Introduction
Нитчатых грибов являются Отличная модель системы для изучения процессов развития. Они предлагают несколько экспериментальных преимущества, как дешевый выращивания, высокой численности потомства и генетического доступности. Последний пункт имеет особое значение для строительства трансформантов, что позволяет исследовать важность так далеко охарактеризованных генов для различных клеточных механизмов. Мицелиальных грибов играют важную роль для выяснения нескольких элементов и механизмов клеточных путей контроля качества, как активность протеазы для деградации аберрантных белков, митохондриальная динамики для поддержания митохондриальной целостности и аутофагии для удаления излишков и / или компонентов неблагополучных клеток и для поддержания Жизнеспособность клеток во время голодания 1,2,3.
Есть несколько экспериментальных методов, доступных для изучения аутофагии в нитчатых грибов 2: (I) Исследование вакуолей яF они содержат плотные тела, когда аутофагической протеазы ингибирует помощью просвечивающей электронной микроскопии 4, (II) визуализация аутофагосом по мониторингу GFP-Atg8 очаги с помощью флуоресцентной микроскопии 5,6 и (III) обнаружения подкисленных autophagosomal структур с помощью монодансил кадаверин флуоресцентный краситель 7.
Здесь новый метод выращивания Пеницилл золотистый для аутофагии исследований представлены. Основным элементом является "голодание колодок ', который просто состоит из 1% агарозы, растворенного в стерилизованной водопроводной воды. Дополнительные соединения (например, стресс-факторы, поглотители, автофагии модуляторы) могут быть добавлены к площадке, пока они не показывают автоматического флуоресценции. Накладка находится в микроскопических слайдов, которые содержат неполную центральную полость. Это колодок в инокулировали либо суспензией спор или небольших фрагментов мицелия. Последнее целесообразно, если штамм не в интересах sporulatе эффективно (например, штаммы ГПТ1 Δ 8). Слайды расположены во влажных камерах (они могут быть легко сконструированы с использованием пипетки пустые коробки), чтобы предотвратить высыхание образца и инкубировали при комнатной температуре. П. chrysogenum может расти в течение нескольких дней в этих условиях. Аутофагия можно наблюдать микроскопически вакуолярной расширения, которая положительно маркер для грибковой аутофагии. В данной статье, в P. chrysogenum Штамм (Висконсин 54-1255) используется, который формирует зеленый флуоресцентный белок, который предназначен для пероксисом его С-концевого "СКЛ" последовательности 9. Поэтому можно контролировать деградацию пероксисом. Вполне возможно, для обозначения и другие отсеки клетки (например, митохондрий), используя соответствующие сигналы локализации и проанализировать их деградации. Хотя, по данным P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) представлена здесь, это, конечно, возможноиспользовать метод «голод Pad 'и для других нитчатых грибов (например, Нейроспора густая, Sordaria macrospora, виды Aspergillus, и т.д.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка P. chrysogenum для голодания экспериментов
- Если P. chrysogenum Штамм интерес хранится на рисе ("зеленая рисовая '), поместить 2-3 рисовые зерна, покрытые спорообразующих мицелий в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Заполните его 500 мкл YGG (10 г / л KCl, 20 г / л глюкозы, 10 г / л дрожжевого азотистого основания, 5 г / л K 2 HPO 4, 20 г / л дрожжевого экстракта).
- Vortex трубку в течение 30 сек, так что споры могут отделиться от риса эффективно.
- Инкубируйте пробирку в течение 1 дня при комнатной температуре (например, от 20 до 25 ° C).
- Подготовьте разведение этой суспензии спор в стерильной водопроводной воде 1/50, хорошо перемешать.
- Если P. chrysogenum Штамм интерес хранится на агаровой пластине (например, YGG агаром), передавать небольшие кусочки мицелия в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую 400 мкл стерильной водопроводной воды и примерно 100 мг GLпопа шарики с помощью стерильного выбор зуба или пипетки.
- Вихревые трубки в течение 2 мин, так что мицелий становится фрагментированной. Сразу же использовать содержимое пробирки.
2. Подготовительные шаги для выращивания Р. chrysogenum на голодном колодки
- Включите нагревательную плиту и установите его приблизительно на 60 ° C.
- Растворить 2 г агарозы в 100 мл водопроводной воды при приготовлении раствора в микроволновой печи. Позаботьтесь, что это решение совершенно ясно после нагревания. Если это не так, готовить его снова до тех пор, пока агарозном растворяется полностью. Пусть раствор агарозы остыть до приблизительно 60 ° С до использования.
- Заполните 1,5 мл микроцентрифужных трубки (2-4, в зависимости от количества образцов) с 400 мкл стерильной водопроводной воды каждый (никакие дополнительные соединения не добавлено) или 400-х мкл (добавление х мкл раствора соединения в стадии 2,5) и поместить их на нагревательной пластине в течение не менее 1 мин, так что Watэ внутри нагревается.
- Поместите микроскопа, содержащие центральную полость на нагревательной пластине в течение не менее 1 мин.
- Добавить 400 мкл 2% агарозном к раствору в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках и вихревой кратко. После этой стадии, если желательно, дополнительные соединения (например, 1 мкМ рапамицина). Если это сделано, вихревые кратко после каждого дополнительного вещества с помощью пипетки в пробирку. Положите трубки обратно на стол отопления для предотвращения преждевременного затвердевания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем в микроцентрифужных трубки должны быть 800 мкл.
3. Подготовка Предметные Содержит голода колодки
- Пипеток 140 мкл раствора агарозы в полости микроскопа (который до сих пор расположенные на нагревательной пластине). Старайтесь избегать пузыри, если это возможно.
- Сразу место крышку скольжения на раствор агарозы.
Примечание: Это приведет к плоской поверхности. - Поставьте микроСфера слайд на лабораторном столе в течение примерно 4 мин, чтобы позволить агарозном площадку затвердеть.
- Осторожно снимите покровное из агарозы колодки, сдвинув его с помощью большого пальца или указательным пальцем (носить перчатки, чтобы избежать загрязнения!).
- Поместите микроскопа с площадки во влажную камеру, чтобы предотвратить высыхание. Рекомендация: Используйте пустую коробку совет, который до сих пор имеет вставку для проведения наконечники. Добавить стерильную воду к коробке так, что дно покрыто. Поместите предметные стекла на вставку и закройте окно.
4. прививки голодание колодки с P. chrysogenum, и инкубационный
- Пипеток 5 мкл разведении 1/50 спор (если Культуры выращивали на рисе) или 5 мкл неразбавленной раствора, содержащего мицелий фрагменты (если культуры выращивали на чашке с агаром) на центр голода площадку.
- Закройте мокрой камеру и оберните его в полиэтиленовый пакет (это служитдополнительная защита от высыхания голодной площадки). Будьте осторожны, чтобы не переместить окно слишком много, потому что в противном случае прививка капли будет нарушен.
- Хранить завернутые коробку при КТ в течение по меньшей мере 20 ч до анализа образцов.
5. микроскопический анализ образцов
- После 20 ч инкубации образцы готовы для микроскопического анализа; положить стекло микроскопа на сухой папиросной бумаги (нижняя, как правило, становятся влажными).
- Пипеткой небольшое количество воды (около 50 мкл) на голодной площадку. Положите покровное на площадке и выжать излишки воды. Удалить остатки воды с папиросную бумагу.
- Положите стекло микроскопа на смотровой стол флуоресцентного микроскопа. Чтобы получить представление о росте мицелия, используйте цели 20X. Использование 63x или 100X цели для изучения локализации GFP в гиф. Для того чтобы предотвратить постепенное высыхание образца не анализируют образцы длябольше, чем 15 мин, прежде чем положить их обратно в мокрой камеры.
- Повторите 5,3 через регулярные промежутки времени (например, после 40 ч и 60 ч роста).
ПРИМЕЧАНИЕ: образец можно вернуть в мокрую камеру. Это не обязательно, чтобы удалить покровное как это не влияет на мицелия рост.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать полезность протокола описано выше деградации пероксисом в P. chrysogenum Штамм Ws54-1255 (GFP-SKL) анализировали. В этом штамме GFP-SKL, как правило, импортируются в пероксисомах 9. Это приводит к появлению множества сферических форм, когда образец анализируют с помощью флуоресцентной микроскопии. Если аутофагии происходит, вакуоли увеличить. GFP-SKL становится включены в вакуолях путем аутофагии (pexophagy). В связи с тем, что GFP устойчив к деградации вакуоли протеаз, что этикетки эти органеллы 10. Поэтому эти два параметра для наблюдения аутофагии (pexophagy) в этом деформации, вакуолей расширения и локализации GFP-СКЛ в вакуолях, которые удобно контролировать с помощью флуоресцентной микроскопии.
В 20 ч инкубации, GFP никогда не наблюдается в вакуолях (рис 1). Кроме того, расширение вакуоль не происходит. Тем не менее, в 40 ч роста в GFP-меченых вакуолейстановятся видимыми в некоторых гиф, указывая аутофагии (pexophagy), чтобы стать активными (Рисунок 1). В 60 ч роста количество GFP-меченых вакуолей еще более увеличена. В качестве отрицательного контроля Δ ГПТ1 мутанта Р. chrysogenum был использован (Δ ГПТ1 (GFP-SKL)) (Рисунок 2). Ни в увеличенном масштабе, ни GFP-меченых вакуоли не может наблюдаться в этом штамме. В качестве положительного контроля, аутофагии, стимулирующий препарат рапамицин используют (рисунок 3). После 40 ч роста GFP-меченых вакуоли становятся видимыми. В 60 ч гифы полностью заполнены огромными GFP-содержащих вакуолей (рисунок 3). Это указывает на то, что, как ожидается, массивная аутофагии происходит здесь. В совокупности эти результаты показывают обоснованность экспериментальной установки.
Рисунок 2:. Локализация GFP-СКЛ в Δ ГПТ1 (GFP-SKL) при выращивании на голодном подушки на указанное время, культуры, выращенные на голодном колодки были проанализированы с помощью флуоресцентной микроскопии. Типичные изображения показаны для каждой временной точки. Соответствующие светлые участки поля, представлены ниже каждого флуоресценцииканал изображения. Шкала бары: 10 мкм. 
Рисунок 3:. Локализация GFP-SKL в Ws54-1255 (GFP-SKL) обрабатывали рапамицина для индукции аутофагии В указанные моменты времени культур, выращенных на голодном колодок с добавлением 1 мкМ рапамицина были проанализированы с помощью флуоресцентной микроскопии. Типичные изображения показаны для каждой временной точки. Соответствующие яркие участки поля, представлены ниже каждого флуоресценции канала изображения. Белый "v": GFP-SKL локализованы в вакуолях, указывающих деградации пероксисом. Шкала бары: 10 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, представленный здесь позволяет удобно и воспроизводимый исследование аутофагии в Р. chrysogenum. Например, он может быть использован для скрининга эффективности различных соединений, являются ли они способны модулировать аутофагии реакцию этого гриба или нет. Результаты с рапамицином показывают, что ингибирование передачи сигналов TOR приводит к выраженной индукции аутофагии в P. chrysogenum, который также было продемонстрировано и для других организмов 11.
Можно использовать мицелий, выращенные на голодном колодок для анализа в более сложных микроскопов (например, конфокального микроскопа лазерного сканирования). Это не имеет значения, является ли поставить образец ниже цели выше целей (инверсионный микроскоп). Различные флуоресцентные белки, нацеленные на определенные отсеки могут быть использованы для мониторинга судьбу различных органелл во время аутофагии (например, митохондрии -> mitophagy; эндоплазматический Reticulum -> ER-phagy, и т.д.).. Таким образом, способ, описанный здесь, расширяет спектр методов для изучения под микроскопом грибов 12.
Протокол, как правило, проста и удобна в использовании. Тем не менее, очень важно, что голодание колодки не усыхают, так как это приведет к артефактам и гибели клеток. Поэтому настоятельно рекомендуется, чтобы (I) предметные стекла, содержащие все еще жидкого раствора агарозы удаляются непосредственно из нагревательной пластины (этап 3.3), (II), что покровное стекло для создания плоской поверхности удаляется из голодания площадку после максимум 5 мин (шаги 3,3 и 3,4), (III), что стекло микроскопа всегда находится во влажном камеры, когда не анализируются (шаги 3,5 и 5,4) и (IV), что микроскопический анализ занимает не больше, чем 15 мин (шаг 5.3). Другим важным аспектом является то, что исходное количество спор или мицелиальных фрагментов пипеткой на голодной прокладки должна быть не слишком высокой илислишком низкой. Это можно легко контролировать путем разбавления акции с использованием стерильной водопроводной воды. Разведение 1/50 описано в 1.1.3 работает хорошо для Р. chrysogenum суспензии спор. Это рекомендуется разбавление для использования с нашими грибов, но может потребоваться некоторые коррективы.
Ограничение метода заключается в том, что это не рекомендуется для покадровой обработки изображений экспериментов для более чем на 15 мин. Это происходит из-за постепенного высыхания голодания площадки, когда он удаляется из влажной камере. Если более длительное время наблюдения необходимы, можно добавить небольшое количество стерильного водопроводной воды в краю голодной площадку, хотя это не мешает некоторым высыхание в центральных районах площадку. Другим ограничением является то, что способ не является строго количественным. В одноклеточных организмов можно забить событий в клетке (например, количество клеток, содержащих GFP в вакуоли). В отличие от этого, П. chrysogenum как нитевидные гриб характеавторизованный от многоклеточного архитектуры. Клетки разделены перегородками, которые содержат центральную пору, которая позволяет прохождение цитоплазме и органеллах. Поэтому образцы могут быть только проанализированы 'полу количественно »(например, количество гиф, содержащей GFP локализованы в вакуолях). Для достижения значения очень важно, что количество гиф анализировали достаточно высока (по крайней мере, 80 момент времени и состояния тестируемого, но более предпочтительно окончательно).
Использование голода колодки для изучения аутофагии может быть легко адаптирована для использования в других нитчатых грибов. Поэтому протокол, представленные здесь, не ограничивается только P. chrysogenum. Кроме того, должно быть возможным, чтобы приспособить ее к с одноклеточного грибов, т.е. дрожжей. Передача протокола для высших организмов (например, нематоды), вероятно, потребует более специализированные приспособления. Это будет интересно посмотреть, также находит ли метод, описанный в этой работеего использование в других областях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope slides with central cavity | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | H884.1 | These can be used multiple times after cleaning. |
| Glass beads | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | A553.1 | Diameter: 0.25 - 0.50 mm |
References
- Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways. Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).
- Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R. Autophagy in filamentous fungi. Fungal Genet. Biol. 46 (1), 1-8 (2009).
- Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing. Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).
- Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C. Podospora anserina target of rapamycin. Curr. Genet. 50 (1), 23-31 (2006).
- Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae. Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).
- Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants. Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).
- Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus. Science. 312 (5773), 580-583 (2006).
- Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).
- Meijer, W. H., et al. Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).
- Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).
- Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H. mTOR regulation of autophagy. FEBS Lett. 584 (7), 1287-1295 (2010).
- Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).
