Introduction
Funghi filamentosi sono ottimi sistemi modello per lo studio dei processi di sviluppo. Essi offrono diversi vantaggi sperimentali come la coltivazione a basso costo, un numero elevato di progenie e accessibilità genetica. L'ultimo punto è di particolare rilevanza per la costruzione di trasformanti che permettono di indagare l'importanza dei geni so-far non caratterizzate per diversi meccanismi cellulari. Funghi filamentosi sono stati strumentali per la delucidazione di diversi elementi e meccanismi di controllo della qualità vie cellulari come attività della proteasi per la degradazione delle proteine aberranti, dinamiche mitocondriali per mantenere l'integrità mitocondriale e autophagy per la rimozione di eccedenza e / o componenti cellulari disfunzionali e per mantenere vitalità cellulare in tempi di fame 1,2,3.
Ci sono diverse tecniche sperimentali disponibili per lo studio dell'autofagia in filamentose funghi 2: (i) ricerca di vacuoli if contengono organismi autofagiche densi quando proteasi sono inibiti mediante microscopia elettronica a trasmissione 4, (ii) visualizzazione di autophagosomes monitorando GFP-Atg8 foci tramite microscopia a fluorescenza 5,6 e (iii) il rilevamento di strutture autophagosomal acidificati utilizzando il colorante fluorescente monodansyl cadaverina 7.
Qui, un nuovo metodo di coltivazione Penicillium chrysogenum per studi autofagia è presentato. L'elemento principale è il 'pad fame' che consiste semplicemente di 1% agarosio disciolto in acqua di rubinetto sterilizzata. Composti aggiuntive (ad esempio, stress, spazzini, modulatori autofagia) possono essere aggiunti al pad fino a quando non visualizzano auto-fluorescenza. Il pad si trova in vetrini contenenti una cavità centrale superficiale. Questo pad in inoculati sia con una sospensione di spore o con piccoli frammenti di micelio. Quest'ultimo è consigliabile se il ceppo di interesse non sporulate in modo efficiente (ad esempio, i ceppi atg1 Δ 8). I vetrini sono posizionati in camere umide (questi possono essere facilmente costruiti utilizzando scatole di tip pipetta vuote) per prevenire l'essiccamento del campione e incubate a temperatura ambiente. P. chrysogenum è in grado di crescere per alcuni giorni in queste condizioni. L'autofagia può essere osservato al microscopio dall'allargamento vacuolar che è un indicatore positivo per autofagia fungine. In questo contributo, una P. chrysogenum ceppo (Wisconsin 54-1255) viene utilizzato, che costituisce la proteina fluorescente verde, che si rivolge a perossisomi per la sua sequenza di 9 C-terminale 'SKL'. Pertanto è possibile monitorare la degradazione dei perossisomi. E 'fattibile etichettare anche altri compartimenti della cellula (ad esempio, mitocondri) utilizzando segnali di localizzazione appropriati ed analizzare la loro degradazione. Anche se i dati di P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) è presentato qui, è certamente possibileper utilizzare il metodo 'pad fame' anche per altri funghi filamentosi (es Neurospora crassa, Sordaria macrospora, specie di Aspergillus, etc.).
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Protocol
1. Preparazione di P. chrysogenum per gli esperimenti da fame
- Se la P. chrysogenum ceppo di interessi è tenuto il riso ('riso verde'), posizionare 2-3 chicchi di riso ricoperti di sporulanti micelio in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Riempire con 500 microlitri YGG (10 g / l KCl, 20 g / l di glucosio, 10 g / l di lievito base di azoto, 5 g / l K 2 HPO 4 estratto di lievito, 20 g / l).
- Agitare la provetta per 30 sec in modo che le spore possano staccarsi dal riso efficiente.
- Incubare la provetta per 1 giorno a temperatura ambiente (per esempio, tra 20 e 25 ° C).
- Preparare una diluizione 1/50 di questa sospensione di spore in acqua di rubinetto sterile, mescolare bene.
- Se la P. chrysogenum ceppo di interesse è mantenuto su una piastra di agar (ad esempio, piastra di agar YGG), trasferire piccoli pezzi di micelio in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 400 ml di acqua di rubinetto sterile e circa 100 mg glperline culo utilizzando uno stuzzicadenti sterile o punta della pipetta.
- Vortex la provetta per 2 minuti in modo che il micelio diventa frammentata. Utilizzare immediatamente il contenuto della provetta.
2. Operazioni preliminari per la frutticoltura di P. chrysogenum su Pads Starvation
- Accendere una piastra di riscaldamento e impostarla a circa 60 ° C.
- Sciogliere 2 g di agarosio in 100 ml acqua di rubinetto con la cottura la soluzione in un forno a microonde. Fate attenzione che questa soluzione è del tutto chiaro dopo il riscaldamento. Se non lo è, cuocere di nuovo fino a quando l'agarosio è sciolto completamente. Sia la soluzione di agarosio raffreddare a circa 60 ° C prima dell'uso.
- Riempire 1,5 ml provette da microcentrifuga (2-4, a seconda del numero di campioni) con 400 microlitri di acqua di rubinetto (non sterile ciascuno composti addizionali aggiunti) o 400-x microlitri (aggiunta di x ml di soluzione del composto nella fase 2.5) e collocarli sulla piastra di riscaldamento per almeno 1 minuto in modo che il Water all'interno si riscalda.
- Inserire vetrini contenenti una cavità centrale sulla piastra di riscaldamento per almeno 1 min.
- Aggiungere 400 microlitri 2% agarosio alla soluzione in 1,5 ml provette da microcentrifuga e vortice brevemente. Dopo questo passo se lo si desidera, aggiungere ulteriori composti (ad esempio, 1 micron rapamicina). Se questo è fatto, vortex brevemente dopo ogni sostanza aggiuntiva è pipettato al tubo. Mettere i tubi di nuovo sul tavolo di riscaldamento per evitare la solidificazione prematura.
NOTA: Il volume totale della provetta deve essere di 800 ml.
3. Preparazione di micropreparati contenenti Pads Starvation
- Pipettare 140 ml di soluzione di agarosio nella cavità del vetrino da microscopio (che si trova ancora sulla piastra di riscaldamento). Cercate di evitare di fare le bolle, se possibile.
- Mettere immediatamente un vetrino sul soluzione di agarosio.
NOTA: Questo si tradurrà in una superficie piana. - Mettere il microportata vetrino sul banco di laboratorio per circa 4 minuti per consentire al pad agarosio solidificare.
- Rimuovere con attenzione il vetrino dal pad agarosio sfilandolo con l'aiuto di un pollice o indice (indossare guanti per evitare la contaminazione!).
- Posizionare il vetrino con il pad in una camera bagnato per evitare l'essiccamento. Raccomandazione: utilizzare una scatola vuota punta che ha ancora l'inserto per tenere le punte delle pipette. Aggiungere acqua sterile alla casella in modo che il fondo è coperto. Collocare i vetrini sull'inserto e chiudere la finestra.
4. inoculo dei pad da fame con P. chrysogenum e incubazione
- Pipettare 5 ml di diluizione 1/50 spore (se le colture sono state coltivate su riso) o 5 ml della soluzione diluita contenente frammenti micelio (se le colture sono state coltivate su una piastra di agar) sul centro del pad inedia.
- Chiudere la camera umida e avvolgerlo in una busta di plastica (questo serve comeprotezione aggiuntiva contro essiccazione dei tamponi fame). Fare attenzione a non spostare la casella di troppo perché altrimenti saranno disturbati le gocce di inoculazione.
- Conservare la scatola avvolta a temperatura ambiente per almeno 20 ore prima di analizzare i campioni.
5. microscopica analisi dei campioni
- Dopo 20 ore di incubazione i campioni sono pronti per l'analisi al microscopio; mettere il vetrino su carta velina asciutta (fondo tende a diventare bagnato).
- Pipettare una piccola quantità di acqua (circa 50 ml) sul pad fame. Mettere un coprioggetto sul pad e spremere l'acqua in eccesso. Rimuovere l'acqua in eccesso con un fazzolettino di carta.
- Mettere il vetrino sul tavolo di osservazione del microscopio a fluorescenza. Per avere una panoramica di crescita micelio, utilizzare un obiettivo 20X. Obiettivi Utilizzare 63x o 100X per studiare la localizzazione di GFP in ife. Al fine di prevenire il graduale essiccamento del campione non analizzare i campioni perpiù di 15 minuti prima di rimetterli nella camera umida.
- Ripetere 5.3 a intervalli regolari (ad esempio, dopo 40 ore e 60 ore di crescita).
NOTA: Il campione può essere rimesso nella camera umida. Non è necessario rimuovere il coprioggetto quanto non influenza la crescita del micelio.
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Representative Results
Per dimostrare l'utilità del protocollo sopra descritto degrado perossisoma nel P. chrysogenum ceppo Ws54-1255 (GFP-SKL) è stato analizzato. In questo ceppo GFP-SKL è di solito importato in perossisomi 9. Ciò provoca la comparsa di molteplici forme sferiche quando il campione viene analizzato tramite microscopia a fluorescenza. Se si verifica l'autofagia, vacuoli ingrandire. GFP-SKL viene incorporato nel vacuoli da autofagia (pexophagy). A causa del fatto che la GFP è resistente alla degradazione da proteasi vacuolo essa etichetta questi organelli 10. Pertanto, i due parametri per l'osservazione autofagia (pexophagy) in questo ceppo, l'allargamento vacuoli e localizzazione di GFP-SKL di vacuoli, sono opportunamente monitorate al microscopio a fluorescenza.
A 20 ore di incubazione, GFP è mai osservata in vacuoli (Figura 1). Inoltre, l'allargamento vacuolo non sta avvenendo. Tuttavia, a 40 ore di crescita vacuoli GFP-etichettatadiventare visibile in alcune delle ife, indicando autofagia (pexophagy) di attivazione (Figura 1). A 60 ore di crescita della quantità di vacuoli GFP-marcato è ulteriormente aumentata. Come controllo negativo un atg1 mutante Δ di P. chrysogenum è stato utilizzato (Δ atg1 (GFP-SKL)) (Figura 2). Né vacuoli allargata né GFP-etichettata possono essere osservati in questo ceppo. Come controllo positivo, il farmaco rapamicina-autofagia stimolante viene utilizzato (Figura 3). Dopo 40 ore di crescita vacuoli GFP-etichettata diventano visibili. A 60 ore, le ife sono completamente pieni di enormi vacuoli-GFP contenenti (Figura 3). Questa scoperta indica che, come previsto, massiccio autofagia si svolge qui. Collettivamente, questi risultati dimostrano la validità del set-up sperimentale.
Figura 2:. Localizzazione di GFP-SKL a Δ atg1 (GFP-SKL) durante la coltivazione in pastiglie da fame ai tempi indicati, culture cresciute sui rilievi da fame sono stati analizzati utilizzando la microscopia a fluorescenza. Immagini rappresentative sono indicati per ogni punto di tempo. Corrispondente zone di campo luminose sono riportati di seguito ogni fluorescenzaimmagine del canale. Barre di scala: 10 micron. 
Figura 3:. Localizzazione di GFP-SKL in Ws54-1255 (GFP-SKL) trattati con rapamicina per l'induzione di autofagia ai tempi indicati culture cresciute sui rilievi fame integrate con 1 mM rapamicina sono stati analizzati usando la microscopia a fluorescenza. Immagini rappresentative sono indicati per ogni punto di tempo. Corrispondenti aree di campo luminose sono mostrati ogni immagine del canale di fluorescenza di seguito. White "v": GFP-SKL localizzato a vacuoli che indicano il degrado dei perossisomi. Barre di scala: 10 micron.
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Discussion
Il metodo qui presentato permette lo studio comoda e riproducibile dell'autofagia in P. chrysogenum. Ad esempio, può essere utilizzata per lo screening l'efficacia di vari composti che siano in grado di modulare la risposta autofagia di questo fungo o meno. I risultati con rapamicina dimostrano che l'inibizione di segnalazione TOR conduce ad una induzione pronunciato dell'autofagia in P. chrysogenum che è stato dimostrato anche per altri organismi 11.
È possibile utilizzare miceli cresciuti su cuscinetti fame per analisi in microscopi più sofisticati (ad esempio, microscopi confocali scansione laser). Non importa se il campione è messo sotto l'obiettivo di cui sopra dell'obiettivo (microscopio invertito). Varie proteine fluorescenti mirati a determinati comparti possono essere utilizzati per monitorare il destino di diversi organelli durante autofagia (ad esempio, i mitocondri -> mitophagy; r endoplasmaticoeticulum -> ER-phagy, ecc.). In sintesi, la tecnica qui descritta estende lo spettro di metodi per studiare microscopicamente funghi 12.
Il protocollo è generalmente semplice e facile da usare. Tuttavia, è molto importante che le pastiglie fame mai essiccare quanto ciò provocherà artefatti e morte cellulare. Pertanto si suggerisce fortemente che (i) i vetrini contenenti la soluzione di agarosio ancora liquido vengono rimosse immediatamente dalla piastra di riscaldamento (passo 3.3), (ii) che il vetrino per rendere una superficie piana viene rimosso dal pad inedia dopo massimo di 5 min (punti 3.3 e 3.4), (iii) che il vetrino viene sempre mantenuta nella camera umida quando non analizzato (passi 3.5 e 5.4) e (iv) che l'analisi microscopica non richiede più di 15 min (step 5.3). Un altro aspetto importante è che l'importo di base di spore o frammenti miceliari pipettati sul pad fame non dovrebbe essere troppo alto otroppo bassa. Questo può essere facilmente controllato mediante diluizione del titolo utilizzando acqua di rubinetto sterile. La diluizione 1/50 descritto in 1.1.3 funziona bene per P. chrysogenum sospensioni di spore. E 'la diluizione raccomandata per l'uso con i nostri funghi, ma potrebbe richiedere qualche aggiustamento.
Una limitazione del metodo è che non è consigliabile per esperimenti di imaging time-lapse per più di 15 min. Ciò è dovuto al graduale essiccazione del pad inedia una volta rimosso dalla camera umida. Se sono necessari tempi di osservazione più lunghi è possibile aggiungere piccole quantità di acqua di rubinetto sterile frangia del pad inedia sebbene ciò non impedisce alcune essiccazione in regioni centrali pad. Un'altra limitazione è che il metodo non è strettamente quantitativo. Negli organismi unicellulari è possibile segnare eventi per cella (ad esempio, la quantità di cellule contenenti GFP nel vacuolo). Al contrario, P. chrysogenum come fungo filamentoso è caratterizzato da un'architettura multicellulare. Le cellule sono divise da setti che contengono un poro centrale che permette il passaggio del citoplasma e organelli. Quindi i campioni possono essere analizzati soltanto 'semi quantitativamente' (ad esempio, il numero di ife contenente GFP localizzato a vacuoli). Per raggiungere significatività è molto importante che il numero di ife analizzato è sufficientemente elevata (almeno 80 per punto di tempo e condizione verificata ma più definitivamente preferibile).
L'utilizzo di pastiglie fame per studiare l'autofagia può essere facilmente adattato per l'uso in altri funghi filamentosi. Pertanto, il protocollo presentato qui non è solo limitato a P. chrysogenum. Dovrebbe anche essere possibile adattare per con funghi unicellulari, cioè lieviti. Trasferimento del protocollo di organismi superiori (ad esempio, nematodi) probabilmente richiede adattamenti più specializzati. Sarà interessante vedere se il metodo descritto in questo lavoro trova ancheil suo uso in altri campi.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope slides with central cavity | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | H884.1 | These can be used multiple times after cleaning. |
| Glass beads | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | A553.1 | Diameter: 0.25 - 0.50 mm |
References
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