Introduction
Filamentösa svampar är utmärkta modellsystem för att studera utvecklingsprocesser. De erbjuder flera experimentella fördelar som billig odling, ett stort antal avkommor och genetiska tillgänglighet. Den sista punkten är särskilt relevant för byggandet av transformanter som tillåter undersöker betydelsen av så långt okarakteriserade gener för olika cellulära mekanismer. Trådsvampar har varit avgörande för att klarlägga flera delar och mekanismer för cellulära kvalitetskontroll vägar som proteas aktivitet för nedbrytning av avvikande proteiner, mitokondriella dynamik för att upprätthålla mitokondriell integritet och autophagy för avlägsnande av överskott och / eller dysfunktionella cellkomponenter och för att upprätthålla cellviabiliteten i tider av svält 1,2,3.
Det finns flera experimentella tekniker tillgängliga för studier av autophagy i trådsvampar 2: (i) undersökning av vakuoler if de innehåller täta autophagic kroppar när proteaser inhiberas av transmissionselektronmikroskopi 4, (ii) visualisering av autophagosomes genom att övervaka GFP-Atg8 foci via fluorescensmikroskopi 5,6 och (iii) detektering av syrade autophagosomal strukturer genom att använda det fluorescerande färgämnet monodansyl kadaverin 7.
Här används en ny metod för att odla Penicillium chrysogenum för autophagy studier presenteras. Det viktigaste inslaget är "svält pad" som helt enkelt består av 1% -ig löst i steriliserat kranvatten. Ytterligare föreningar (t.ex. stress, asätare, autophagy modulatorer) kan läggas till dynan så länge de inte visar auto fluorescens. Dynan ligger i objektglas som innehåller ett grunt central hålighet. Denna dyna i ympas antingen med en sporsuspension eller med små mycel fragment. Det senare är lämpligt om stammen av intresse inte sporulate effektivt (t.ex. Δ atg1 stammar 8). Glasen är placerade i våta kamrar (dessa kan lätt konstrueras med hjälp tomma pipett spets rutorna) för att förhindra uttorkning av provet och inkuberas vid rumstemperatur. P. chrysogenum kan växa för ett par dagar under dessa förhållanden. Autophagy kan observeras mikroskopiskt genom vakuolär utvidgning som är en positiv markör för svamp autophagy. I detta bidrag, ett P. chrysogenum stam (Wisconsin 54-1255) används som bildar grönt fluorescerande protein som är riktad till peroxisomerna med sin C-terminal "SKL" sekvens 9. Därför är det möjligt att övervaka nedbrytning av peroxisomer. Det är möjligt att märka även andra avdelningarna i cellen (t.ex., mitokondrier) genom användning av lämpliga lokaliseringssignaler och för att analysera deras nedbrytning. Fastän data från P. chrysogenum Ws54-1255 (GFP-SKL) presenteras här, är det säkert möjligtatt använda "svält pad" metod även för andra trådsvampar (t.ex. Neurospora crassa, Sordaria macrospora, Aspergillus arter, osv).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av P. chrysogenum för Svält Experiment
- Om P. chrysogenum stam av intresse hålls på ris ("gröna ris"), placera 2-3 riskorn täcks med sporbildande mycel i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Fyll den med 500 | il YGG (10 g / I KCI, 20 g / I glukos, 10 g / l jästkvävebas, 5 g / I K 2 HPO 4, 20 g / I jästextrakt).
- Vortexa röret för 30 sek, så att sporer kan lossna från ris effektivt.
- Inkubera röret under en dag vid rumstemperatur (t.ex. mellan 20 och 25 ° C).
- Förbered en 1/50 utspädning av denna sporsuspension i sterilt kranvatten, blanda väl.
- Om P. chrysogenum stam av intresse hålls på en agarplatta (t.ex. YGG agarplatta), överför små bitar av mycelet i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 400 | il sterilt kranvatten och ca 100 mg glass pärlorna genom användning av en steril tandpetare eller pipettspets.
- Vortex röret för 2 minuter så att mycel blir fragmenterad. Använd innehållet i röret omedelbart.
2. Förberedande Steg för odling av P. chrysogenum på Svält Pads
- Slå på en värmeplatta och ställ in den på ca 60 ° C.
- Lös 2 g agaros i 100 ml kranvatten genom kokning av lösningen i en mikrovågsugn. Se till att denna lösning är helt klar efter upphettning. Om det inte är, laga det igen tills agarosen hade löst sig fullständigt. Låt agaroslösningen svalna till approximativt 60 ° C före användning.
- Fyll 1,5 ml mikrocentrifugrör (4/2, beroende på antalet prover) med 400 ^ il sterilt kranvatten varje (inga ytterligare föreningar tillsatta) eller 400-x il (tillsats av x il av föreningslösning i steg 2.5) och placera dem på värmeplattan under minst en minut, så att water inne blir varm.
- Placera objektglas som innehåller en central hålighet på värmeplattan under minst 1 min.
- Lägg 400 | il 2% agaros till lösningen i de 1,5 ml mikrocentrifugrör och virvel korthet. Efter detta steg om så önskas, lägga till ytterligare föreningar (dvs 1 iM rapamycin). Om detta görs, vortex kort stund efter varje ytterligare ämne pipetteras till röret. Sätt rören tillbaka på värmebordet för att förhindra för tidig stelning.
OBS: Den totala volymen i mikrocentrifugrör bör vara 800 l.
3. Beredning av mikroskop Slides innehållande Svält Pads
- Pipettera 140 | il av agaroslösningen i håligheten av mikroskopobjektglas (som fortfarande ligger på värmeplattan). Försök att undvika att göra bubblor om möjligt.
- Placera omedelbart ett täckglas på agaroslösningen.
NOTERA: Detta kommer att resultera i en plan yta. - Placera mikroräckvidd skjut på labbet bänk för ca 4 min att låta agarosen pad att stelna.
- Försiktigt bort täckglaset från agarosen pad genom att skjuta den med hjälp av en tumme eller pekfinger (bära handskar för att undvika kontaminering!).
- Placera objektglas med dynan till en våt kammare för att förhindra uttorkning. Rekommendation: Använd en tom spetslåda som fortfarande har insatsen för att hålla pipettspetsarna. Tillsätt steril vatten till lådan så att botten är täckt. Placera objektglas på insatsen och stänga rutan.
4. ympa svält Pads med P. chrysogenum och Inkubation
- Pipettera 5 ul av 1/50 spor utspädning (om kulturerna odlades på ris) eller 5 | il av den outspädda lösningen innehållande mycel fragment (om kulturerna odlades på en agarplatta) på mitten av svält dynan.
- Stäng den våta kammaren och linda in den i en plastpåse (detta fungerar somextra skydd mot uttorkning av svält kuddar). Var noga med att inte flytta rutan för mycket eftersom annars Inokuleringen droppar blir störd.
- Förvara inslagna rutan vid rt under minst 20 h före analys av proverna.
5. Mikroskopisk analys av proven
- Efter 20 h av inkubation proverna är klara för mikroskopisk analys; sätta objektglas på torrt mjukpapper (botten tenderar att bli blöt).
- Pipettera en liten volym vatten (ca 50 | j, l) på svält dynan. Sätt på ett täck på kudden och krama ur överflödigt vatten. Avlägsna överskottsvatten med en silkespapper.
- Placera objektglas på observationen bordet i fluorescensmikroskop. För att få en överblick över mycel tillväxt, använd en 20X objektiv. Använd 63X eller 100X mål för att studera lokalisering av GFP i hyfer. För att förhindra en gradvis uttorkning av provet inte analysera prover förlängre än 15 minuter innan du sätter tillbaka dem i den våta kammaren.
- Upprepa 5.3 med jämna mellanrum (t.ex., efter 40 timmar och 60 timmar av tillväxt).
OBS: Provet kan sättas tillbaka i den våta kammaren. Det är inte nödvändigt att ta bort täck eftersom den inte påverkar mycel tillväxt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera användbarheten av protokollet beskrivs ovan peroxisom nedbrytning i P. chrysogenum stam Ws54-1255 (GFP-SKL) analyserades. I denna stam GFP-SKL brukar importeras till peroxisomer 9. Detta resulterar i uppkomsten av flera sfäriska former när provet analyseras via fluorescensmikroskopi. Om autophagy inträffar, vakuoler förstoring. GFP-SKL inkorporeras i vakuoler av autophagy (pexophagy). På grund av det faktum att GFP är resistent mot nedbrytning av vakuol proteaser det märker dessa organ 10. Därför de två parametrarna för observation autophagy (pexophagy) i denna stam, utvidgning vakuolen och lokalisering av GFP-SKL till vakuoler, lämpligen övervakas av fluorescensmikroskopi.
Vid 20 h av inkubation GFP aldrig observerats i vakuoler (Figur 1). Dessutom är vacuole utvidgningen inte äger rum. Men vid 40 h av tillväxt GFP-märkta vakuolerblir synliga i några av de hyfer, som indikerar autophagy (pexophagy) att bli aktiva (figur 1). Vid 60 tim tillväxt mängden GFP-märkta vakuoler har ökat ytterligare. Som en negativ kontroll en Δ atg1 mutant av P. chrysogenum utnyttjades (Δ atg1 (GFP-SKL)) (Figur 2). Inte heller kan observeras förstorade eller GFP-märkta vakuoler i denna stam. Som en positiv kontroll, är autophagy stimulerande drogen rapamycin används (Figur 3). Efter 40 timmar av tillväxt GFP-märkta vakuoler blir synliga. Vid 60 h, är det hyfer helt fylld med enorma GFP-innehållande vakuoler (Figur 3). Detta indikerar att, som väntat, tar massiva autophagy rum här. Tillsammans står dessa resultat visar giltigheten av försöksuppställningen.
Figur 2:. Lokalisering av GFP-SKL i Δ atg1 (GFP-SKL) under odling på svältdynor Vid de angivna tider, kulturer odlas på svältkuddar analyserades med hjälp av fluorescens mikroskopi. Bilderna visas för varje tidpunkt. Motsvarande ljusa fältområden visas nedan varje fluorescenskanalbild. Skalstrecken: 10 ^ M. 
Figur 3:. Lokalisering av GFP-SKL i Ws54-1255 (GFP-SKL) behandlade med rapamycin för induktion av autophagy vid de indikerade tidpunkterna kulturer odlade på svältdynor kompletterat med 1 pM rapamycin analyserades med användning av fluorescensmikroskopi. Bilderna visas för varje tidpunkt. Motsvarande ljusa fältområden visas nedan varje fluorescens kanal bild. Vit "v": GFP-SKL lokaliserad till vakuoler indikerar peroxisom nedbrytning. Skalstrecken: 10 ^ M.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som presenteras här tillåter bekväm och reproducerbar undersökning av autophagy i P. chrysogenum. Till exempel kan den användas för att screena effektiviteten av olika föreningar om de är kapabla att modulera autophagy responsen för denna svamp eller inte. Resultaten med rapamycin visar att hämning av TOR signalering leder till en uttalad induktion av autophagy i P. chrysogenum som även visats för andra organismer 11.
Det är möjligt att använda mycel som odlats på svältkuddar för analys i mer sofistikerade mikroskop (t.ex. konfokal laserscannande mikroskop). Det spelar ingen roll om provet tas under det mål på över målet (inverterat mikroskop). Olika fluorescerande proteiner riktade mot vissa faktorer kan användas för att övervaka ödet för olika organeller under autophagy (t.ex., mitokondrier -> mitophagy; endoplasmatiska reticulum -> ER-phagy, etc).. Sammanfattningsvis, den teknik som beskrivs här sträcker sig det spektrum av metoder för mikroskopiskt studerar svampar 12.
Protokollet är i allmänhet enkel och lätt att använda. Det är dock mycket viktigt att de svältdynorna aldrig desiccate eftersom detta kommer att leda till artefakter och celldöd. Därför är det starkt antydde att (i) objektglas innehåller fortfarande flytande agaroslösningen tas bort omedelbart från värmeplattan (steg 3,3), (ii) att täck slip för att göra en plan yta tas bort från svält pad efter en max 5 min (steg 3,3 och 3,4), (iii) att objektglas hålls alltid i den våta kammaren när den inte analyseras (steg 3,5 och 5,4) och (iv) att mikroskopisk analys inte tar mer än 15 minuter (steg 5.3). En annan viktig aspekt är att utgångsbeloppet för sporer eller myceliefragment pipetteras på svält dynan ska inte vara för hög ellerför låg. Detta kan enkelt kontrolleras genom utspädning av lager genom att använda sterilt kranvatten. Den 1/50 utspädning som beskrivs i 1.1.3 fungerar bra för P. chrysogenum sporsuspensioner. Det är den rekommenderade spädn för användning med våra svampar men kan kräva vissa justeringar.
En begränsning med metoden är att det inte är lämpligt för time-lapse avbildning experiment för mer än 15 minuter. Detta beror på att den gradvisa uttorkning av svält dynan när den avlägsnas från den våta kammaren. Om längre observationstider behövs är det möjligt att lägga till små mängder sterilt kranvatten till utkanten av svält pad även om detta inte hindrar någon uttorkning i centrala delarna av dynan. En annan begränsning är att metoden inte är absolut kvantitativt. I encelliga organismer är det möjligt att göra mål händelser per cell (t.ex. mängd celler som innehåller GFP i vakuolen). Däremot, P. chrvsogenum som en filamentös svamp är charactemanfattas av en multicellulär arkitektur. Celler dividerat med septae som innehåller en central por som medger passage av cytoplasman och organeller. Därför prover kan endast analyseras "semi kvantitativt" (t.ex. antal hyfer innehåller GFP lokaliserad till vakuoler). För att uppnå signifikans är det mycket viktigt att antalet hyfer analyseras är tillräckligt hög (minst 80 per tidpunkt och kondition testas men mer är definitivt att föredra).
Utnyttjandet av svältdynor för att studera autophagy kan enkelt anpassas för användning i andra filamentösa svampar. Därför protokollet presenteras här är inte bara begränsat till P. chrysogenum. Det bör också vara möjligt att anpassa den för med encelliga svampar, dvs jäst. Överföring av protokollet till högre organismer (t.ex. nematoder) kräver förmodligen mer specialiserade anpassningar. Det ska bli intressant att se om den metod som beskrivs i detta arbete finner ocksådess användning inom andra områden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope slides with central cavity | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | H884.1 | These can be used multiple times after cleaning. |
| Glass beads | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | A553.1 | Diameter: 0.25 - 0.50 mm |
References
- Fischer, F., Hamann, A., Osiewacz, H. D. Mitochondrial quality control: an integrated network of pathways. Trends Biochem. Sci. 37 (7), 284-292 (2012).
- Pollack, J. K., Harris, S. D., Marten, M. R.
- Scheckhuber, C. Q., Osiewacz, H. D. Podospora anserina: a model organism to study mechanisms of healthy ageing. Mol. Genet. Genomics. 280 (5), 365-374 (2008).
- Pinan-Lucarré, B., Iraqui, I., Clavé, C.
- Kikuma, T., Ohneda, M., Arioka, M., Kitamoto, K. Functional analysis of the ATG8 homologue Aoatg8 and role of autophagy in differentiation and germination in Aspergillus oryzae. Eukaryot. Cell. 5 (8), 1328-1336 (2006).
- Pinan-Lucarré, B., Balguerie, A., Clavé, C. Accelerated cell death in Podospora autophagy mutants. Eukaryot. Cell. 4 (11), 1765-1774 (2005).
- Veneault-Fourrey, C., Barooah, M., Egan, M., Wakley, G., Talbot, N. J. Autophagic fungal cell death is necessary for infection by the rice blast fungus. Science. 312 (5773), 580-583 (2006).
- Bartoszewska, M., Kiel, J. A., Bovenberg, R. A., Veenhuis, M., van der Klei, I. Autophagy deficiency promotes beta-lactam production in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 77 (4), 1413-1422 (2011).
- Meijer, W. H., et al. Peroxisomes are required for efficient penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. Appl. Environ. Microbiol. 76 (17), 5702-5709 (2010).
- Cubitt, A. B., Heim, R., Adams, S. R., Boyd, A. E., Gross, L. A., Tsien, R. Y. Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci. 20 (11), 448-455 (1995).
- Jung, C. H., Ro, S. H., Cao, J., Otto, N. M., Kim, D. H.
- Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Med. Mycol. 47, Suppl 1. S110-S119 (2009).
