Abstract
Multimodal tillåter molecular imaging visualisering av biologiska processer på cellulär, subcellulära och molekylär nivå upplösningen med flera, kompletterande avbildningstekniker. Dessa avbildningsmedel underlättar realtid bedömning av vägar och mekanismer in vivo, som förbättrar både diagnostiska och terapeutiska effekten. I denna artikel presenteras protokollet för syntes av biofunctionalized preussiska blå nanopartiklar (PB NP) - en ny klass av medel för användning i multimodala, molekylära bildprogram. De avbildningsmetoder som ingår i nanopartiklar, fluorescens avbildning och magnetisk resonanstomografi (MRT), har kompletterande funktioner. PB NP har en kärna-skal design där gadolinium och manganjoner införlivas i mellanrummen i PB gitter generera MRI kontrast, både i T 1 och T 2 viktade sekvenser. PB NP är belagda med fluorescerande avidin använder elektrostatisk själv somtering, vilket möjliggör fluorescensavbildning. De avidinbelagda nanopartiklar modifierade med biotinylerade ligander som ger molekylinriktnings kapacitet till nanopartiklarna. Stabiliteten och toxicitet för de nanopartiklar mäts, liksom deras MRI relaxiviteter. De multimodala, molekylära bildhanteringsfunktioner av dessa biofunctionalized PB NP sedan demonstreras genom att använda dem för fluorescens avbildning och molekylär MRI in vitro.
Introduction
Molecular Imaging är icke-invasiv och målinriktad visualisering av biologiska processer på cellulär, subcellulära och molekylär nivå 1. Molekylär avbildning tillåter ett exemplar kvar i dess ursprungliga mikromiljö medan dess endogena vägar och mekanismer bedöms i realtid. Vanligtvis innebär molecular imaging administration av en exogen avbildningsmedel i form av en liten molekyl, makromolekyl, eller nanopartiklar för att visualisera, mål, och spår relevanta fysiologiska processer som studeras 2. De olika avbildningsmetoder som har undersökts i molekylär avbildning inkluderar MRI, CT, PET, SPECT, ultraljud, photoacoustics, Ramanspektroskopi, bioluminiscens, fluorescens, och intravital mikroskopi 3. Multimodal avbildning är en kombination av två eller flera avbildningsmetoder där kombinationen förstärker förmågan att visualisera och karakterisera olika biologiska processer och händelser 4. Multimodal avbildning utnyttjar styrkan i de individuella avbildningstekniker, samtidigt kompensera för deras individuella begränsningar 3.
I denna artikel presenteras protokollet för syntes av biofunctionalized preussiska blå nanopartiklar (PB NP) - en ny klass av multimodala, imagingmolekyler. PB NP utnyttjas för fluorescens avbildning och molekylär MRI. PB är ett pigment bestående av alternerande järn (II) och järn (III) atomer i en ytcentrerad kubisk nätverk (figur 1). PB gitter består av linjära cyanidligander i en Fe II - KN - Fe III koppling som innehåller katjoner för att balansera avgifter inom dess tredimensionella nät 5. Förmågan hos PB att införliva katjoner i sitt gitter utnyttjas av separat laddar gadolinium och manganjoner i PB NP för MRI kontrast.
Den logiska grunden för att bedriva en nanopartikel design för MRI kontrast är på grund avfördelarna denna design ger relativt nuvarande MRI kontrastmedel. Den stora majoriteten av amerikanska FDA-godkända MRI-kontrastmedel är gadoliniumkelater som är paramagnetisk i naturen och ger en positiv kontrast av spinn-gitter relaxamekanism 6,7,8. Jämfört med en enda gadolinium-kelat som ger låg signalintensitet på egen hand, ger införlivandet av flera gadolinium joner inom PB galler av nanopartiklarna förbättrad signalintensitet (positiv kontrast) 3,9. Vidare ökar förekomsten av multipla gadolinium joner inom PB gitter övergripande spinn densitet och storleken på paramagnetism av nanopartiklar, vilket stör den lokala magnetfält i dess närhet, och därmed generera negativ kontrast av avslappning mekanismen spinn-spinn. Således gadoliniuminnehållande nanopartiklar fungerar både som T 1 (positiv) och T 2 (negativ) kontrastmedel 10,11.
I en undergrupp av patienter med nedsatt njurfunktion, har administrationen av gadolinium-baserade kontrastmedel kopplats till utvecklingen av nefrogen systemisk fibros 8,12, 13. Denna observation uppmanas undersökningar om användningen av alternativa paramagnetiska joner som kontrastmedel för MRI. Därför är den mångsidig design av nanopartiklarna anpassats för att införliva manganjoner inom PB gitter. Liknar gadoliniumkelater, mangan-kelat är också para och används vanligtvis för att ge positiv signal intensiteten i MRI 7,14. Som med gadoliniuminnehållande PB NP, manganinnehållande PB NP fungera även som T 1 (positiv) och T 2 (negativ) kontrastmedel.
Att införliva fluorescens bildhanteringsfunktioner, är nanopartiklar "kärnorna" belagd med en "biofunktionell" skal består av fluorescensmärkt glykoprotein avidin (Figur 1). Avidin inte bara möjliggör fluorescens avbildning, men också fungerar som en dockningsplattform för biotinylerade ligander som riktar specifika celler och vävnader. Avidin-biotin-bindningen är en av de starkaste kända, icke-kovalenta bindningar som karakteriseras av extremt stark bindningsaffinitet mellan avidin och biotin 15. Infästningen av biotinylerade ligander till avidinbelagda PB NP ger molekylära inriktningsmöjligheter till PB NP.
Motivationen för att driva fluorescens och MR avbildning med PB NP beror på att dessa avbildningsmetoder har kompletterande funktioner. Fluorescens avbildning är en av de mest använda optiska molekylära avbildningstekniker, och möjliggör samtidig visualisering av flera objekt vid höga känslig 1,16,17. Fluorescens avbildning är en säker, icke-invasiv modalitet men är associerad med låga djup penetration och rumsliga upplösningar 1,3,16. Å andra sidan, genererar MRI hög tids end spatial upplösning icke-invasivt och utan ett behov av joniserande strålning 1,3,16. Men MRT lider låg känslighet. Därför fluorescens avbildning och MRI valdes ut som de molekylära avbildningstekniker på grund av deras kompletterande funktioner i djuppenetration, känslighet och spatial upplösning.
I denna artikel presenteras protokollet för syntes och biofunctionalization av PB NP, gadolinium-innehållande PB NP (GdPB), och mangan-innehållande PB NP (MnPB) 10,11. Följande metoder är beskrivna: 1) mätning av storlek, laddning, och tidsstabilitet av nanopartiklar, 2) utvärdering av cytotoxicitet av nanopartiklar, 3) mätning av MRI relaxiviteter, och 4) utnyttjande av nanopartiklar för fluorescens och molekylär MR imaging av en population av målceller in vitro. Dessa resultat visar potentialen i de nationella parlamenten för användning som multimodala, imagingmolekyler in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntes av PB NPS GdPB och MnPB
Syntes av nanopartiklar (PB NPS GdPB eller MnPB) uppnås genom att använda en enkärlssyntes system genom att utföra stegen som beskrivs nedan:
- Förbered lösning "A" som innehåller 5 ml av 5 mM kaliumhexacyanoferrat (II) i avjoniserat (DI) vatten. Beroende på typen av nanopartikel som syntetiseras - PB NP, GdPB eller MnPB, framställa lösning "B" enligt följande:
- För PB NP: bereda 10 ml av en lösning innehållande 2,5 mM järn (III) klorid i DI-vatten.
- För GdPB NP: bereda 10 ml av en lösning innehållande 2,5 mM vardera av gadolinium (III) nitrat och järn (III) klorid i avjoniserat vatten
- För MnPB NP: bereda 10 ml av en lösning innehållande 2,5 mM vardera av mangan (II) klorid och järn (III) klorid i DI-vatten.
- Lägg lösning "B" till en rundbottnad kolv, och rör om innehållet i kolven vid rumstemperatur (RT) och1000 varv per minut. Lägg lösning "A" drop-wise in i den rundbottnade kolven innehållande lösning "B". Styra flödeshastigheten för tillsättning av lösning "A" till "B" genom en peristaltisk pump inställd för att dispensera ca 10 ml / timme.
- Fortsätt omröring vid 1000 varv per minut vid RT under ytterligare 30 min efter tillsats av lösning "A" till "B" är klar. Sluta omrörning och samla blandningen.
- Överför alikvoter av blandningen i mikrocentrifugrör att skölja de nanopartiklar som är fria från oreagerade komponenter. Lägg 5 M NaCl (0,2 ml NaCl / ml reaktionsblandning) till varje alikvot för att hjälpa till partikeluppsamling genom centrifugering.
- Centrifugera varje alikvot av nanopartiklar i minst 10 minuter vid 20000 x g. Efter centrifugering, försiktigt bort supernatanten.
- Resuspendera varje nanopartikel pelleten i 1 ml avjoniserat vatten via ultraljudsbehandling med hjälp av en mikrospets (ultraljudsbehandling puls på / av = 1/1 sek, amplitud = 50%, varaktighet =5 sek, sonikator märkeffekt = 125 W) för att bryta upp pelleten.
- Upprepa steg 1,4-1,6 minst 3 × att säkerställa att nanopartiklarna är fria från komponenter i det initiala reaktions och reaktionsbiprodukter. Efter den sista centrifugeringen, återsuspendera partiklarna i en ml Dl-vatten.
2. Biofunctionalization av PB NPS GdPB och MnPB
Biofunctionalization av nanopartiklarna innefattar beläggning av nanopartiklar "kärnor" med avidin och tillsats biotinylerade liganderna som beskrivs nedan:
- Beläggning av Nanopartiklar med Fluorescent avidin
Beläggning av nanopartiklar med fluorescerande avidin uppnås med hjälp av elektrostatisk självorganisering, där positivt laddade avidin (pl ~ 10.5) är belagt på att negativt laddade nanopartiklar som följer 18:- Förbered suspensioner av de PB NPS GdPB eller MnPB i en ml Dl-vatten. Filter Alexa Fluor 488-märkt avidin (A488, rekonstitueras i DI vatten)genom ett 0,2 ^ m nylonmikrocentrifug filter vid 14000 x g under 10 min. Lägg ≤0.2 mg avidin / mg nanopartiklar. Lägg varje filtrerad alikvot av A488 separat till portioner av PB NP, GdPB eller MnPB.
- Kontakta nanopartiklar med A488 för 2-4 h med försiktig skakning eller rotation vid 4 ° C. Skydda proverna från ljus med hjälp av aluminiumfolie.
OBS: Detta steg avkastningen A488 belagda PB NP (PB-A488), GdPB (GdPB-A488), och MnPB (MnPB-A488).
- Fästande av biotinylerade antikroppar
Utmätning av biotinylerade inriktnings antikroppar på avidinbelagda nanopartiklar uppnås med hjälp av avidin-biotin interaktioner enligt följande:- Förbered suspensioner av avidinbelagda nanopartiklar - PB-A488, GdPB-A488, och MnPB-A488 i 1 ml avjoniserat vatten. Filter biotinylerad antikropp (tillhandahållen av tillverkaren) genom ett 0,2 ^ m nylonmikrocentrifug filter vid 14000 x g under 10 min.
OBS: Här använder föreliggande studie biotinylated anti-neuron-glia antigen 2 (ANG2) som riktar NG2 överuttryckt i celler och vävnader i det centrala nervsystemet och biotinylerad anti-human eotaxin-3 (Eot3) som riktar receptorer överuttryckta på eosinofiler eller eosinofila cellinjer. - Lägg varje filtrerad alikvot av biotinylerad antikropp separat till portioner av de avidinbelagda nanopartiklar. Lägg ≤0.05 mg biotinylerad antikropp / mg avidin-belagda nanopartiklar. Kontakta avidinbelagda nanopartiklar med de biotinylerade antikropparna (Ang2 eller Eot3) för 2-4 h med försiktig skakning eller rotation vid 4 ° C. Skydda proverna från ljus med hjälp av aluminiumfolie.
OBS: Detta steg avkastningen antikropp belagda nanopartiklar (t.ex. GdPB-A488-Eot3 och MnPB-A488-Ang2).
- Förbered suspensioner av avidinbelagda nanopartiklar - PB-A488, GdPB-A488, och MnPB-A488 i 1 ml avjoniserat vatten. Filter biotinylerad antikropp (tillhandahållen av tillverkaren) genom ett 0,2 ^ m nylonmikrocentrifug filter vid 14000 x g under 10 min.
3. Dimensionering, Zeta Potential och Oral stabilitet i Nanopartiklar
Fördelningen storlek, laddning, och stabiliteten hos de nanopartiklar mäts med hjälp av dynamiskljusspridning (DLS) enligt beskrivning nedan:
- Storleks av Nanopartiklar
Dimensionering av nanopartiklarna uppnås med användning av dynamisk ljusspridning enligt följande:- Lägg 10 ul av provet nanopartiklar (1 mg / ml) till 990 pl av DI-vatten i en engångs plastkyvett.
OBS: Detta är representativt värde för en bra DLS signal. - Förslut kyvetten och skaka för att blanda väl. Placera kyvetten i ett system som används för att analysera partikelstorlek för att mäta storleken av nanopartiklarna. Utför partikelstorleksanalys på en mätningsvinkel av 173 °.
- Lägg 10 ul av provet nanopartiklar (1 mg / ml) till 990 pl av DI-vatten i en engångs plastkyvett.
- Zeta-potentialen för nanopartiklar
Zeta-potential av nanopartiklarna mäts med användning fasanalys ljusspridning enligt följande:- Lägg 100 pl av provet nanopartiklar (1 mg / ml) till 900 pl av DI-vatten i en engångsplast kapillärcell. Detta värde är representativt för en bra zeta potentialmätning.
- Placera capillary cell i ett system som används för att analysera zeta-potential för att mäta zeta-potentialen för nanopartiklarna med användning av standardparametrarna vid 25 ° C.
- Temporal Stabilitet hos Nanopartiklar
Temporal stabilitet hos nanopartiklar mäts med hjälp av dynamisk ljusspridning enligt följande:- Bedöma stabiliteten av nanopartiklar genom att mäta storleken på de nanopartiklar i avjoniserat vatten samt Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM), såsom beskrivs i avsnitt 3.1.
- Upprepa storleksmätningar i DI vatten och DMEM gång / dag under en period av fem dagar.
4. Cytotoxicitet av nanopartiklar
Cytotoxicitet av nanopartiklarna mätes med användning av en XTT-cellproliferationsanalys enligt följande:
- Seed 10.000-15.000 celler / brunn av varje celltyp som studerades (Neuro2a, BSG D10, EOL-1, och OE21) i en 96-brunnsplatta. Se till att den totala volymen av sådda celler inte eXceed 0,2 ml / brunn. Inkubera ympade cellerna över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
- Kontakta nanopartiklar med cellerna:
- Inkubera cellerna med varierande koncentrationer av nanopartiklar (0,01-0,5 mg / ml). Se Tabell 1 som en representativ tabell som beskriver mängderna av nanopartiklar (i 50 | il) sattes till cellerna efter avlägsnande 50 | il medium / brunn.
- För att beakta eventuella störande absorbans av nanopartiklar inom analysen, lägga till en tom bestående av lämplig koncentration av nanopartiklar (0-0,5 mg / ml; i likvärdighet för belopp som läggs till cellerna) till medium utan celler.
- Inkubera cellerna med nanopartiklar över natten vid 37 ° C och 5% CO2. Aspirera medium från varje brunn och skölj med färgningsbuffert bestående av 5% fetalt bovint serum (FBS) i fosfatbuffrad lösning (PBS). Lägg 100 | il medium utan fenolrött och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2för 16-18 timmar.
- Inkubera cellerna med varierande koncentrationer av nanopartiklar (0,01-0,5 mg / ml). Se Tabell 1 som en representativ tabell som beskriver mängderna av nanopartiklar (i 50 | il) sattes till cellerna efter avlägsnande 50 | il medium / brunn.
- Förbered XTT cellprolifereringsanalys arbetslösning genom att blanda kitkomponenterna (XTT Reagens och XTT Activator) som enligt tillverkarens specifikationer. Aspirera media från brunnarna och tillsätt 100 pl RPMI (RPMI w / o fenol röd + 10% FBS + 1 × Pen-Strep) eller lämpligt medium för den celltyp studeras. Lägg 50 | il XTT arbetslösning till varje brunn och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 under 2 till 2,5 timmar.
- Mät absorbansen vid 490 nm, med en referensvåglängd på 630 nm för att korrigera för fingeravtryck eller fläckar. Beräkna den korrigerade absorbansen för varje brunn (A 490 -A 630) och i genomsnitt mätvärdena för replikat.
- Subtrahera de tomma avläsningar från varje brunn värde för att beräkna de slutliga korrigerade absorbansvärdena. Beräkna överlevnadsprocenten för varje prov genom att normalisera den slutliga korrigerade absorbansen med den för obehandlade celler utan nanopartiklar. Plot SUrvival procentsats som funktion av nanopartikelkoncentration.
5. MRI relaxiviteter av PB NP, GdPB och MnPB
MRI relaxivitet mätes med T 1 - och T 2-viktade sekvenser genom framställning av en MRI "fantom" med användning av en 96-brunnsplatta innehållande nanopartiklar, såsom beskrivs nedan:
- Phantom Framställning
- Förbered en 96-brunnar med varje brunn innehållande 100 ^ nanopartiklar (PB NPS GdPB eller MnPB) vid lämplig koncentration. Börjar med en koncentration av 0,4 mM för varje typ av nanopartiklar, seriellt späda nanopartiklarna 2 × använder DI vatten tills en koncentration av 2,4 x 10 -5 M nås (detta kräver 14 spädningar och 15 brunnar).
- Lägg 100 pl av smält 1% agaros-lösning i avjoniserat vatten i varje brunn och blanda väl. Låt gelén stelna vid 4 ° C under 12 h.
OBS: Detta ger en fantom som innehåller serieutspädningar avnanopartiklarna i stelnad agaros. - Placera fantom i en horisontell 3 T klinisk magnet under ett massivt block av 2% agar (150 cm3). Säkra fantom och block av agar i centrum av en 8-kanals HD-hjärnpole. Mät avkoppling gånger med 0,5 mm tjocka koronala skivor på halva höjden av 96-brunnar 11.
- T 1 - och T 2 -viktade Sekvenser
Använd följande representativa inställningar för att förvärva de sekvenser i den kliniska magneten.
OBS: Dessa värden är optimerade för de nanopartiklar som används i föreliggande studie:- Förvärva T1-viktade (T1W) MR-bilder med hjälp av följande vätskan försvagat inversion återvinning (FLAIR) sekvens: Echo tåg (ET) = 8, Upprepning tid (TR) = 2,300 ms, Echo tid (TE) = 24,4 msek, Matrix storlek = 512 x 224, Synfält (FOV) = 16 x 16 cm 2.
- Förvärva T 2 viktade (T2W) MR-bilder med hjälp av följande snabba Relaxation snabb spinn eko (FRFSE) sekvens: ET = 21; TR = 3.500 ms; TE = 104 ms; Matrix size = 512 x 224; FOV = 16 x 16 cm 2.
- Förvärva T1W och T2W MR-bilder på 127 MHz (3 T) vid följande inversionstider: 50, 177, 432, 942, 1961 och 4000 ms.
- Mätning av MRI relaxiviteterna
- Efter förvärvet T1W och T2W bilder med hjälp sekvenserna som beskrivs i avsnitt 5.2, mäta signalstyrkan för varje brunn med ImageJ, hädanefter kallad regionen av intresse (ROI) genom att välja varje ROI med hjälp grödan knappen ovala ligger på huvud verktygsfältet sedan välja Analysera> Mät.
OBS: Ett pop-up ska visa medelvärdet signalstyrkan för varje ROI under kolumnen "Mean". - För varje ROI, rita den uppmätta signalstyrkan mot dess specifika inversion tid. Om det behövs, inverterade punkter (avläsningar) som genererar en initial "bubbla" eller avvikare i början av tomten (lägre inversiongånger).
OBS: Dessa avläsningar genereras vid låga inversions gånger eftersom MRI mäter storleken eller absoluta värdet av bilder snarare än deras faktiska (negativt) värde, som måste redovisas / korrigeras för 19. - Förbered en exponentiell passform för varje tomt på signalstyrkan för ROI (SI) vs. inversionstider (T I) som beskrivs i avsnitt 5.2. Plot T I på x-axeln, SI på y-axeln; ɑ och Δ är konstanter som bestäms av regression, och T 1 eller T 2 är den variabel som ska lösas:
där t = T 1, T 2. - Lös för T 1 eller T 2 med användning av ovanstående ekvation och plotta det inverterade värdet av de beräknade värdena (1 / T 1 och 1 / T 2) mot koncentrationerna av de nanopartiklar som används i varje ROI.
- Beräkna lutningen för den linjära kurva, somger de relaxiviteterna r 1 och r 2.
OBS: Följande avsnitt av protokollet beskriver tillämpningen av nanopartiklar för fluorescerande märkning och generera MRI kontrast i målceller.
- Efter förvärvet T1W och T2W bilder med hjälp sekvenserna som beskrivs i avsnitt 5.2, mäta signalstyrkan för varje brunn med ImageJ, hädanefter kallad regionen av intresse (ROI) genom att välja varje ROI med hjälp grödan knappen ovala ligger på huvud verktygsfältet sedan välja Analysera> Mät.
6. Fluorescerande märkning av målceller Använda Nanopartiklar - konfokalmikroskopi
OBS: De nanopartiklar (PB NPS GdPB och MnPB) kan användas för att fluorescerande märka en population av målceller (övervakas av konfokalmikroskopi) enligt följande:
- Syntes av fluorescerande Nanopartiklar
- Syntetisera GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-ANG2 för lysrörs märkning av en population av målceller genom att följa stegen som beskrivs i avsnitt 1 och 2.
- Beredning av celler för fluorescens Targeting
- Coat nr. 1,5 mikrotäckglas genom att doppa dem i en lösning av 0,002% poly (L-lysin) hydrobromid under 90 min. Ta bort täckglas från lösningen och låt dem torka i 24 timmar.
- Frön cellerna (t.ex. EOL-1, BSG D10, SUDIPG1) på de belagda täckglas placeras i en 6-brunnars platta och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 under åtminstone 16 timmar. Skölj cellerna med 1 × PBS-lösning och (tillval) fixa med 10% formaldehyd i neutral buffertlösning i 15 min. Fläcken celler med 5 pM rödorange cellgenomträngande färgämne i PBS vid 37 ° C under 30 min. Därefter skölj celler med PBS.
- > Fluorescerande märkning av målceller
- Lägg 1% bovint serumalbumin (BSA; i avjoniserat vatten) till cellerna för att minimera icke-specifik bindning på cellerna, och inkubera vid 37 ° C under 1 h.
- Inkubera cellerna med nanopartiklarna i en% BSA under 1 h. För EOL-1: inkubera med 0,2 mg / ml GdPB-A488 eller GdPB-A488-Eot3; För BSG D10 och SUDIPG1: inkubera med 0,2 mg / ml MnPB-A488 eller MnPB-A488-ANG2. Skölj cellerna med PBS 3 × ta bort unbound nanopartiklar.
- Försiktigt invertera täckglaset (innehållande celler och nanopartiklar) på ett objektglas, se till att det inte finns några luftbubblor. Täta kanten mellan täckglaset och objektglas genom att försiktigt applicera genomskinligt nagellack. Bild cellerna med hjälp av en konfokala laserskanning mikroskop.
7. Fluorescerande märkning av målceller Använda Nanopartiklar - flödescytometri
De nanopartiklar (PB NPS GdPB och MnPB) kan användas för att fluorescensetikett en population av målceller (övervakades med flödescytometri) enligt följande:
- Förbered suspensioner av celler blir måltavla i PBS. För rena kulturstudier, upphängning består av en enda celltyp (t.ex. BSG D10); resuspendera en cellpellet av BSG D10-celler i PBS vid 100000 celler / ml (10 ml totalt). För blandade kulturstudier, upphängning bestå av minst två celltyper (t.ex. EOL-1 och OE21); liknar BSG D10, återsuspendera cellpelletar i EOL-1 och OE21 i PBS vid 100000 celler / ml vardera (totalt 10 ml).
- Bered varierande förhållanden mellan EOL-1: OE21 1: 0 (2 ml EOL-1), 3: 1 (1,5 ml EOL-1, 0,5 ml OE21), 1: 1 (1 ml vardera av EOL-1 och OE21), 1: 3 (0,5 ml EOL-1, 1,5 ml OE21), 0: 1 (2 ml OE21).
- Blockera cellerna (rena och blandade suspensioner) blir måltavla för nanopartiklarna med 2 ml 5% BSA för att minimera icke-specifik bindning.
- Lägg 1 ml (1 mg / ml) nanopartiklar till cellerna och inkubera i 1 timme. För BSG D10, inkubera celler med MnPB-A488, MnPB-A488-ABC-(antikroppskontroll), eller MnPB-A488-ANG2). För blandningar av EOL-1 och OE21, inkubera blandningarna med ett fast belopp på GdPB-A488-Eot3.
- Skölj cellerna fria från obundna nanopartiklar genom att spinna ned proverna vid 1000 x g under 5 minuter vid minst 3 × att avlägsna obundna partiklar. Resuspendera cellerna i 1 ml PBS och fixera med 10% formaldehyd i PBS. Stain celler genom inkubation med 10 mikrogram / ml7-Aminoactinomytcin D i PBS på is under 30 min. Skölj med PBS, sedan analysera 10.000 gated celler från varje prov med hjälp av en flödescytometer.
8. Generera MRI Kontrast på Riktade celler med Nanopartiklar
De nanopartiklar (PB NPS GdPB och MnPB) kan användas för att generera MRI kontrast (i både T-1 - och T 2 viktade sekvenser) i en population av målceller som följer:
- Phantom Framställning
- Väx celler (t.ex. BSG D10) i T75-kolvar tills ~ 80% sammanflödet. Använd lämplig odlingsmedium och villkor. För BSG D10, odla cellerna i DMEM + 10% FBS + 1 × Pen-Strep vid 37 ° C och 5% CO2.
- Skölj celler fria från medium med 5 ml PBS och blockera cellerna med 5 ml 1% BSA i PBS under 1 timme för att minimera ospecifik bindning. Lägg 5 ml (0,5 mg / ml) nanopartiklar till cellerna. För BSG D10, inkubera cellerna med MnPB-A488, MnPB-A488-ABC-(antikroppskontroll), och MnPB-A488-ANG2 under 1 timme.
- Skölj celler 3 × med 5 ml PBS för att avlägsna obundna nanopartiklar. Trypsinisera cellerna genom inkubering av cellerna med 2 ml Trypsin-EDTA 0,25% lösning 1 × för 5 min vid 37 ° C och 5% CO2 för att lösgöra dem från kolven för fantom beredning. Lägg 8 ml DMEM för att släcka trypsinering av celler.
- Samla cellerna genom centrifugering dem vid 1000 x g under 5 min; aspirera ut supernatanten. Resuspendera cellerna i 1 ml PBS och tillsätt 1 ml 10% formaldehyd i PBS för att fixera cellerna. Lägg 100 pl av varje prov till en separat brunn i en 96-brunnars platta.
- Lägg 100 pl av smält 1% agaros-lösning i avjoniserat vatten i varje brunn och blanda väl genom pipettering upp och ned. Låt gelén stelna vid 4 ° C under 12 h.
OBS: Detta ger en fantom som innehåller celler med bifogade nanopartiklar i stelnad agaros. - Placera fantom i en horisontell 3 T klinisk magnet intill ett fast block av 2% agar (150 cm
- T 1 - och T 2 -viktade Sekvenser
Använd följande inställningar för att förvärva sekvenserna i klinisk MRT magneten:- Förvärva T1W MR-bilder med hjälp av följande spinn eko sekvens: Echo tåg (ET) = 1, Upprepning tid (TR) = 650 ms, Echo tid (TE) = 11 ms, Matrix size = 320 x 256, Synfält (FOV) = 10 x 10 cm 2.
- Förvärva T2W MR-bilder med hjälp av följande FRFSE sekvens: ET = 28; TR = 3000 ms; TE = 101 ms; Matrix size = 384 x 288; FOV = 10 x 10 cm 2.
- Efter förvärvet Processing
- För att underlätta läsningen, konvertera den ursprungliga gråskalebilder i en färgskala bild med ImageJ: Välj Bild> typ> 8-Bit, att konvertera bilden till gråskala.
- Beräkna den normaliserade intensiteten för varje prov efter subtraktion av signalbidraget från agaroslösningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använda enkärlssyntes schema, nanopartiklar av PB NP (medeldiameter 78,8 nm, polydispersitetsindex (PDI) = 0,230; beräknas av dynamisk ljusspridning instrument), GdPB (medeldiameter 164,2 nm, PDI = 0,102), eller MnPB ( medeldiameter 122,4 nm, PDI = 0,124) som är monodispersa (mätt med DLS) konsekvent kan syntetiseras (Figur 2A). De uppmätta zeta-potentialer hos de syntetiserade nanopartiklar är mindre än -30 mV (figur 2B), vilket indikerar måttlig stabilitet av partiklarna baserat på deras ytladdningar. De syntetiserade nanopartiklar uppvisar adekvat tidsstabilitet under en period av fem dagar såsom indikeras av deras konsekventa storlekar (hydrodynamiska diametrar; Figur 2C).
Vid samtidig inkuberas med celler, de nanopartiklar (PB NPS GdPB och MnPB) uppvisar försumbar cytotoxicitet till cellerna under vissa tröskelkoncentrationer (Figur 3). Cytotoxicitet studör av PB NP på Neuro2a celler indikerar försumbar cytotoxicitet vid samtidig inkuberas med Neuro2a vid koncentrationer lägre än 0,67 × 10 -6 mg / cell (Figur 3A). Cytotoxicitet studier som utförts av samtidig inkubation av GdPB med EOL-1 och OE21 celler indikerar försumbar cytotoxicitet av GdPB på båda celltyper vid koncentrationer lägre än 0,25 × 10 -6 mg / cell (Figur 3B). Liknande, cytotoxicitet studier indikerar försumbar cytotoxicitet av MnPB vid samtidig inkuberas med BSG D10 vid koncentrationer lägre än 0,25 × 10 -6 mg / cell (Figur 3C). Den ytterligare cytotoxicitet MnPB och GdPB kan hänföras till förekomsten av ytterligare joner (Mn 2+ för MnPB och Gd 3+ för GdPB) inom nanopartikelkärnan.
MRI relaxiviteten studier utfördes med användning av fantomer bestående av varierande koncentrationer av PB NPS GdPB och MnPB. Studierna indikerar användbarheten av nanoparpartiklar som MRI kontrastmedel i både T1W och T2W sekvenser (Figur 4). Detta framgår av den ökade hyperintensities (positiv kontrast) i T1-viktade sekvenser och ökade hypointensities (negativ kontrast) i T2 viktade sekvenser med ökande koncentrationer av både GdPB (Figur 4A) och MnPB (Figur 4B). Baserat på mätningar relaxiviteten är MnPB en måttlig T 1 agent och en stark T2 agent medan GdPB är ett starkt T 1 agent och en måttlig T2 agent (Figur 4C). De uppmätta relaxiviteter av GdPB och MnPB mäta sig med de av kliniskt godkända kontrastmedel 10, 11.
De biofunctionalized PB NP kan fluorescerande märka en population av målceller in vitro (Figur 5). När biofunctionalized med både fluorescerande avidin (A488) och biotinylerad anti-human eotaxin-3-antikropp (Eot3), kan GdPB fluorescent rikta en population av EOL-1-celler (figur 5B). Kontroll GdPB nanopartiklar utan Eot3 uppvisar försumbar bindning (Figur 5A) Likaså när GdPB är biofunctionalized med både fluorescerande avidin (A488) och biotinylerad anti-neuronal gliaceller antigen-2 (ANG2), nanopartiklarna kan fluorescerande rikta populationer av BSG D10 och SUDIPG1 neurosfärer (Siffrorna 5D och F), medan kontrollnanopartiklar utan målstyrd antikropp är oförmögna att fluorescerande märka cellerna (figurerna 5C och E). Således effektiv målinriktning och fluorescerande märkning kräver närvaro av både fluorescerande avidin och biotinylerad inriktning liganden.
Förmågan hos de biofunctionalized nanopartiklar för att fluorescerande märka en population av celler som kvantifieras genom flödescytometri, bekräftar behovet av både fluorescerande avidin och biotinylated inriktning ligand för effektiv fluorescerande märkning (Figur 6). BSG D10-celler i kontakt med MnPB innehållande både A488 och ANG2 (MnPB-A488-ANG2) uppvisar ökad fluorescens (figur 6A) och procent av fluorescensmärkta celler (Figur 6B) jämfört med kontroll fluorescerande nanopartiklar med en kontrollantikropp (MnPB-A488 -abc) och utan en antikropp (MnPB-A488). De biofunctionalized nanopartiklar kan fluorescens rikta en särskild undergrupp av celler i en cellblandning (figur 6C). Detta demonstreras som fasta mängder EOL-1-inriktning, är fluorescerande GdPB (GdPB-A488-Eot3) kontakt med målceller (EOL-1) och kontrollceller (OE21). Fluorescens ökar när proportioner av EOL-1 ökar (ökad Alexa Fluor 488 signalintensitet; Figur 6C) i blandningen. Detta indikerar specificitet nanopartiklar för denna undergrupp av celler i cell blandningen.
De biofunctionalized PB NP ökar MRI kontrast i en population av målceller (Figur 7). När BSG D10 celler kontakt med ekvivalenta koncentrationer av experimentell (MnPB-A488-ANG2) och kontroll (MnPB-A488-ABC och MnPB-A488) nanopartiklar, fantomer uppvisar ökad Hyperintensitet för celler i kontakt med MnPB-A488-ANG2 jämfört med kontroller i T1W sekvenser och ökad hypointensity för celler i kontakt med MnPB-A488-ANG2 jämfört med kontroller i T2W sekvenser (Figur 7A). Bildanalys av ROI inom fantom bekräftar denna trend där celler i kontakt med experimentella partiklar uppvisar signifikant ökad intensitet i jämförelse med kontroller i T1W sekvenser och minskade betydligt intensitet jämfört med kontroller i T2W sekvenser (Figur 7B).
Figur 1: Den kärna-skal utformningen av PB NPS. Kärnan består av ett PB gitter, som består av linjära cyanidligander i en Fe II - KN -. Fe III koppling Dessa kopplingar gör det möjligt PB NP att införliva katjoner inom dess tredimensionella nätverk som ett sätt att balansera avgifter 5. Denna katjon bindande förmåga berlinerblått används för att ladda gadolinium och manganjoner i gitter, vilket ger MRI kontrast. Kärnan är belagd med en biofunktionell skal bestående av fluorescerande avidin för att möjliggöra fluorescensavbildning och biotinylerade liganderna för att möjliggöra molekylär målinriktning.
Figur 2:. Storlek, laddning, och stabilitet PB NP (A) Storlek distributioner av PB (blå), GdPB (röd) och MnPB (svart) nanopartiklar mäts genom DLS. (B (C) Temporal stabilitet PB (blå), GdPB (röd) och MnPB (svart) nanopartiklar i vatten (fast) och DMEM (prickad) för fem dagar efter deras syntes, uppmätt genom DLS.
Figur 3:. Cytotoxicitet av PB NP cytotoxicitet studier med användning av olika koncentrationer av (A) PB NP sattes till ett fast antal Neuro2a celler (B) GdPB sattes till en fast mängd av EOL-1 och OE-21-celler, respektive och ( C) MnPB sattes till ett fast antal BSG D10-celler. Cell överlevnaden beräknades vid 24 och 48 h. Reproducerad med tillstånd från ref 11, copyright 2014 American Chemical Society; Ref 10 med tillstånd från Dove Press Ltd; och Ref 21 med tillstånd från The Royal Society of Chemistry.
Figur 4: MR-bilder och relaxiviteter av GdPB och MnPB vid 3 T. Hyperintensitet i T1-viktade sekvenser och hypointensity i T 2 viktade sekvenser av (A) GdPB och (B) MnPB som en funktion av koncentrationen av nanopartiklar. (C) sammanräkningen av de relaxitivies av PB NP, GdPB och MnPB värderade till 3 T. återges med tillstånd från ref 11, copyright 2014 American Chemical Society.
Figur 5: Fluorescerande märkning av målceller med användning av de biofunctionalized PB NP, mätt genom laserskanning konfokalmikroskopi Bilder inom EOL-1-celler som behandlats med (A) kontroll (GdPB-A488) och (B) experimentell (GdPB-A488-Eot3. ) nanopartiklar.Bilder från BSG neurosfärer behandlade med (C) kontroll (MnPB-A488) och (D) experimentella (MnPB-A488-Ang2) nanopartiklar. Bilder av SUDIPG1 neurosfärer behandlade med (E) kontroll (MnPB-A488) och (F) experimentella (MnPB-A488-Ang2) nanopartiklar. Reproducerad med tillstånd från ref 11, copyright 2014 American Chemical Society. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Fluorescerande märkning av målceller med användning av de biofunctionalized PB NP, mätt med flödescytometri (A) Flödescytometri histogram av BSG D10-celler behandlade med experimentell (MnPB-A488-ANG2) och kontroll (MnPB-A488-ABC och MnPB. -A488) nanopartiklar. (B) Percentage av BSG D10 celler från panelen (A) som är fluorescerande (% av Alexa-Fluor positiva) vid behandling med experimentell (MnPB-A488-ANG2) och kontroll (MnPB-A488-ABC och MnPB-A488) nanopartiklar, ** p <0,05. (C) Flödescytometri scatter tomter av en cellblandning innehållande varierande proportioner av EOL-1 (målceller) och OE21 (kontrollceller) riktat av nanopartiklar (GdPB-A488-Eot3). Reproducerad med tillstånd från ref 11, copyright 2014 American Chemical Society och från Ref 10 med tillstånd från Dove Press Ltd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7:. Öka MRI kontrast i riktade celler genom att använda de biofunctionalized PB NP (A) T 1-viktade och T <sub> 2 viktade kontrastförbättring i fantomer som består av ett fast antal BSG D10-celler behandlade med experimentell (MnPB-A488-ANG2) och kontroll (MnPB-A488-ABC och MnPB-A488) nanopartiklar. (B) Normaliserad signalstyrkan för BSG D10 celler som behandlats med experimentell (MnPB-A488-ANG2) och kontroll (MnPB-A488-ABC och MnPB-A488) nanopartiklar, ** p <0,05. Reproducerat från Ref 10 med tillstånd från Dove Press Ltd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel har present metoderna för syntes av en ny klass av multimodala, molekylära avbildningsmedel baserade på biofunctionalized berlinerblått nanopartiklar. Molekyl avbildningsmodaliteter införlivade i nanopartiklar är fluorescensavbildning och molekylär MRI, på grund av sina komplementära funktioner. De biofunctionalized preussiska blå nanopartiklar har en kärna-skal design. De viktigaste stegen i syntesen av dessa nanopartiklar är de: 1) en-pot-syntes som ger kärnorna som utgörs av berlinerblått nanopartiklar (PB NP), gadoliniuminnehållande berlinerblått nanopartiklar (GdPB) eller mangan-innehållande berlinerblått nanopartiklar (MnPB), 2) biofunctionalization av nanopartiklarna med fluorescerande avidin genom elektrostatisk självsammansättning, och 3) infästning av biotinylerade liganderna (antikroppar) till nanopartiklarna med användning av robusta avidin-biotin-interaktioner. Både fluorescerande avidin och biotinylerade liganderna utgör biofunktionell skal av nanopartiklarna.
Den enkärlssyntes ger PB NP, GdPB eller MnPB som fungerar både som T 1 och T 2 kontrastmedel för MRI. Mängderna av de paramagnetiska joner (gadolinium eller mangan) laddas i nanopartikel kärnan kan ändras (ökas eller minskas) genom att variera mängderna av de paramagnetiska jon-innehållande salter (gadolinium (III) nitrat och mangan (II) klorid) i enkärlssyntes (Steg 1.2). Detta resulterar i förändrad (ökat eller minskat) MRI signalintensiteter. Dock kan dessa ändringar i syntesschema resultera i instabila, aggregerade nanopartiklar. För att mildra problem som är förknippade med aggregation, kan enkärlssyntes modifieras för att inkorporera storlek-kontrollerande kapslingsmedel såsom citrat under syntes 20.
Biofunctionalization av nanopartiklar kärnorna uppnås genom elektrosjälvorganisering med fluorescerande avidin, vilket ENABles fluorescens avbildning. Elektrosjälvorganisering kräver motsatta laddningar på ytan av nanopartiklar och beläggningspolymeren (i den här artikeln, fluorescerande avidin). För att förändra ytan funktionalitet av nanopartiklarna, kan avidin ersättas med positivt laddade polymerer (t.ex. polylysin eller en amin-grupp innehållande polyetylenglykol) under syntesen. Emellertid de relativa proportionerna av de nanopartiklar och beläggningspolymer kommer att behöva optimeras för att bibehålla nanopartikelstorlek och stabilitet och för att förhindra aggregation.
Tillägg av biotinylerade antikroppar på avidinbelagda nanopartiklar ger molekylära inriktningsmöjligheter till PB-baserade nanopartiklar. Detta steg är baserat på den robusta interaktionen mellan avidin och biotin (jämviktsdissociationskonstanten, Kd ~ 10 -15). Som med föregående steg, de relativa proportionerna av avidinbelagda nanopartiklar och biotinylerade ligander måste vara opoptimerat för att förhindra den biotinylerade liganden från att samtidigt binda två avidinbelagda nanopartiklar som resulterar i nanopartikel aggregering. För molekylär målinriktning kan antikropparna ersättas av andra målligander såsom antikroppsfragment (Fab), variabel fragment enkelkedjig (scFv), peptider eller aptamerer.
De viktigaste fördelarna med denna metod för att syntetisera biofunctionalized nanopartiklar som multimodala, imagingmolekyler är: 1) facile en pott (1-steg) syntes av nanopartiklar kärnor, och 2) sekventiell kontaktsteg (elektrosjälvorganisering och avidin- biotin interaktioner) för beläggning av nanopartiklar kärna med en biofunktionell skal. Andra fördelar med nanopartiklarna innefattar det faktum att berlinerblått (säljs som Radiogardase) redan är FDA-godkända för human användning och att nanopartiklarna som är resultatet av den enkärlssyntes schema kan användas som ett MRT-kontrastmedel både i T 1 ( positiv) och T 2 </ Sub> (negativa) -viktade sekvenser, som inte är lätt att uppnå med användning av andra kontrastmedel eller nanopartikelplattformar utan komplicerade syntesscheman eller specialiserade kemikalier för syntes av kontrastmedel. En begränsning av tekniken är att syntesen kan leda till polydispersa nanopartiklar med aggregat om de relativa proportionerna av reaktanterna i både nanopartikelkärnan syntes och biofunktionell skal beläggningssteg inte är noggrant optimerade för de reaktanter som används i dessa speciella steg. Till exempel kan de relativa proportionerna för beläggning av nanopartiklar kärnor med avidin inte utvidgas till att belägga nanopartiklarna med polylysin utan föregående optimeringsstudier.
Efter behärska tekniken för syntetisering biofunctionalized preussiska blå nanopartiklar som beskrivs här, kan denna mångsidiga designen modifieras för molekylär imaging studier in vivo. Detta kommer att kräva PEGylering av nanopartiklar för lägre Immunogenicity och längre cirkulationstider in vivo. I likhet med konstruktionen som beskrivits här, kan de PB NP vara biofunctionalized med antikroppar före administrering in vivo. Andra studier inkluderar användning av biofunctionalized PB NPS för theranostic (samtidig terapi + diagnostiska) tillämpningar in vivo. Studier som undersöker användningen av preussiska blå nanopartiklar för fototermisk terapi (baserat på deras absorbans egenskaper vid nära infraröda våglängder) pågår 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
| Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| BSG D10 Cell Line | Lab stock | --- | |
| OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | --- | |
| Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
| Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
| Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
| Sonicator | QSonica | Q125 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
| Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
| Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
| 1.7 ml conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
| Tube holders | VWR | 82024-342 | |
| Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
| Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
| Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
| 96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
| Trypsin EDTA 0.25% solution 1x | JR Scientific | 82702 | |
| Cell Culture Grade PBS (1x) | Life Technologies | 10010023 | |
| XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
| T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
| Pen-Strep 1x | Life Technologies | 15070063 | |
| Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
| Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| 3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
| 100 ml round-bottom flask |
References
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Mankoff, D. A. A Definition of Molecular Imaging. J Nucl Med. 48 (6), 18N-21N (2007).
- James, M. L., Gambhir, S. S. A Molecular Imaging Primer: Modalities, Imaging Agents, and Applications. Phys Rev. 92, 897-965 (2012).
- Cao, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. J Nucl Med. 49 (2), 113S-129S (2008).
- Heinrich, J. L., Berseth, P. A., Long, J. R. Molecular Prussian Blue analogues: synthesis and structure of cubic Cr4Co4(CN)12 and Co8(CN)12 clusters. Chem Commun. 11, 1231-1232 (1998).
- Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD). , National Center for Biotechnology Information. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK5330 (2004).
- Zhu, D., Liu, F., Ma, L., Liu, D., Wang, Z. Nanoparticle-Based Systems for T1-Weighted Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents. Int J Mol Sci. 14 (5), 10607-1010 (2013).
- Bartolini, M. E., et al. An investigation of the toxicity of gadolinium based MRI contrast agents using neutron activation analysis. Magn. Reson. Imaging. 21 (5), 541-544 (2003).
- Adel, B., et al. Histological validation of iron-oxide and gadolinium based MRI contrast agents in experimental atherosclerosis: The do's and don't's. Atherosclerosis. 225 (2), 274-280 (2012).
- Dumont, M. F., Yadavilli, S., Sze, R. W., Nazarian, J., Fernandes, R. Manganese-containing Prussian blue nanoparticles for imaging of pediatric brain tumors. Int J Nanomedicine. 9, 2581-2595 (2014).
- Dumont, M. F., et al. Biofunctionalized gadolinium-containing prussian blue nanoparticles as multimodal molecular imaging agents. Bioconjug Chem. 25 (1), 129-137 (2014).
- Yang, L., et al. Nephrogenic Systemic Fibrosis and Class Labeling of Gadolinium-based Contrast Agents by the Food and Drug Administration. Radiology. 265 (1), 248-253 (2012).
- Information on Gadolinium-Based Contrast Agents. , U.S. Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/PostmarketDrugSafetyInformationforPatientsandProviders/ucm142882.htm (2013).
- Mendonca-Dias, M. H., Gaggelli, E., Lauterbur, P. C. Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging. Sem in Nuc Med. 13 (4), 364-376 (1983).
- Izrailev, S., Stepaniants, S., Balsera, M., Oono, Y., Schulten, K. Molecular Dynamics Study of Unbinding of the Avidin-Biotin Complex. Biophys. 72 (4), 1568-1581 (1997).
- Chen, Z. Y., et al. Advance of Molecular Imaging Technology and Targeted Imaging Agent in Imaging and Therapy. Biomed Res Int. 2014, 1-12 (2014).
- Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452 (7187), 580-589 (2008).
- Jaiswal, J. K., Mattoussi, H., Mauro, J. M., Simon, S. M. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates. Nature Biotech. 21 (1), 47-51 (2002).
- Mangrum, W., Christianson, K., Duncan, S., Hoang, P., Song, A., Merkle, E. Duke Review of MRI Principles. 304, Mosby. Philadelphia, PA. 304 (2012).
- Shokouhimehr, M., Soehnlen, E. S., Hao, J., Griswold, M., Flask, C., Fan, X., Basilion, J. P., Basu, S., Huang, S. D. Dual purpose prussian blue nanoparticles for cellular imaging and drug delivery: a new generation of T1-weighted MRI contrast and small molecule delivery agents. J. Mater. Chem. 20, 5251-5259 (2010).
- Hoffman, H. A., Chakrabarti, L., Dumont, M. F., Sandler, A. D., Fernandes, R. Prussian blue nanoparticles for laser-induced photothermal therapy of tumors. RSC Adv. 4 (56), 29729-29734 (2014).
