Abstract
Multimodal, molekylær billeddannelse tillader visualisering af biologiske processer på cellulære, subcellulære og molekylær niveau resolutioner ved hjælp af flere, komplementære billeddiagnostiske teknikker. Disse afbildningsmidler lette real-time vurdering af veje og mekanismer in vivo, som øger både diagnostisk og terapeutisk effekt. Denne artikel præsenterer protokollen til syntese af biofunctionalized preussiske blå nanopartikler (PB NP'er) - en ny klasse af stoffer til brug i multimodale, molekylære billedbehandlingsprogrammer. De billeddiagnostiske modaliteter indarbejdet i nanopartikler, fluorescens billedbehandling og magnetisk resonans imaging (MRI), har komplementære funktioner. PB NP'er besidder en kerne-skal-design, hvor gadolinium og mangan ioner inkorporeret i de interstitielle rum i PB gitter generere MRI-kontrastmiddel, både i T 1 og T 2-vægtede sekvenser. PB NP'er er belagt med fluorescerende avidin anvendelse elektrostatisk selv somde monteres, hvilket muliggør fluorescens billeddannelse. Avidin-overtrukne nanopartikler er modificeret med biotinylerede ligander, der bibringer molekylære målretning til nanopartikler. Stabiliteten og toksicitet af nanopartiklerne måles, såvel som deres MRI relaxiviteter. De multimodale, molekylære billeddiagnostiske kapacitet disse biofunctionalized PB NP'er derefter demonstreret ved at bruge dem til fluorescens billeddannelse og molekylær MRI in vitro.
Introduction
Molekylær billeddannelse er den ikke-invasiv og målrettet visualisering af biologiske processer på det cellulære, subcellulære og molekylære niveau 1. Molekylær billeddannelse tillader en model til at forblive i sin native mikromiljø mens dens endogene veje og mekanismer vurderes i realtid. Typisk molekylær billeddannelse involverer indgivelse af en eksogen billeddannende middel i form af et lille molekyle, makromolekyle eller nanopartikel at visualisere, mål og spore relevante fysiologiske processer blev undersøgt 2. De forskellige billeddiagnostiske metoder, der er blevet udforsket i molekylær billeddannelse omfatter MR, CT, PET, SPECT, ultralyd, photoacoustics, Raman spektroskopi, bioluminescens, fluorescens, og intravital mikroskopi 3. Multimodal billeddannelse er en kombination af to eller flere billeddannende modaliteter, hvor kombinationen forbedrer evnen til at visualisere og karakterisere forskellige biologiske processer og hændelser 4. Multimodal imaging udnytter de stærke sider ved de enkelte billeddiagnostiske teknikker, mens kompensere for deres individuelle begrænsninger 3.
Denne artikel præsenterer protokollen til syntese af biofunctionalized preussiske blå nanopartikler (PB NP'er) - en ny klasse af multimodale, molekylære billeddannelsesmidler. PB NP'er udnyttes til fluorescens billeddannelse og molekylær MRI. PB er et pigment, der består af vekslende jern (II) og jern (III) atomer i en kubisk fladecentreret netværk (figur 1). PB gitter består af lineære cyanid ligander i en Fe II - CN - Fe III kobling, der inkorporerer kationer på balance afgifter inden for sit tredimensionale netværk 5. Evne PB at inkorporere kationer i sin gitter er udnyttet af særskilt lastning gadolinium og mangan ioner ind i PB nationale parlamenter for MRI kontrast.
Begrundelsen for at forfølge en nanopartikel design for MRI kontrast er på grund affordelene dette design tilbyder i forhold til de nuværende MRI kontrastmidler. Langt størstedelen af US FDA-godkendte MRI kontrastmidler er gadoliniumchelater der er paramagnetiske i naturen og give positiv kontrast ved spin-gitter relaksationsmekanisme 6,7,8. I forhold til en enkelt gadolinium-chelat, der giver lavt signal intensitet på egen hånd, giver inkorporering af flere gadolinium ioner i PB gitter af nanopartiklerne forstærket signal intensitet (positiv kontrast) 3,9. Endvidere tilstedeværelsen af flere gadoliniumioner i PB gitter øger den samlede spin-tæthed og størrelsen af paramagnetisme af nanopartiklerne, som forstyrrer den lokale magnetfelt i dets nærhed, hvorved der genereres negativ kontrast ved spin-spin relaksationsmekanisme. Således gadoliniumholdige nanopartikler fungere både som T 1 (positiv) og T 2 (negativ) kontrastmidler 10,11.
I en undergruppe af patienter med nedsat nyrefunktion, er administrationen af gadolinium-baserede kontrastmidler været knyttet til udviklingen af nefrogen systemisk fibrose 8,12, 13. Har Denne observation bedt undersøgelser af anvendelsen af alternative paramagnetiske ioner som kontrastmidler til MRI. Derfor er alsidigt design af nanopartiklerne er indrettet til at optage manganioner i PB gitter. Svarende til gadoliniumkelater, mangan-chelater er også paramagnetiske og anvendes typisk til at give positivt signal intensitet i MRI 7,14. Som med gadoliniumholdige PB nationale parlamenter, de mangan-holdige PB NP'er også fungere som T 1 (positiv) og T 2 (negativ) kontrastmidler.
At indarbejde fluorescensimagografi kapaciteter er nanopartikel "kerner" belagt med en "biofunktionelle" skal bestående af fluorescens-mærket glycoprotein avidin (figur 1). Avidin giver ikke kun fluorescensimagografi, men fungerer også som en docking platform for biotinylerede ligander, som er målrettet mod specifikke celler og væv. Den avidin-biotin obligation er en af de stærkeste kendte, ikke-kovalente bindinger er kendetegnet ved ekstremt stærke binding affinitet mellem avidin og biotin 15. Fastgørelsen af biotinylerede ligander til avidinbelagt PB NP'er giver molekylære målretning til PB NP'er.
Motivationen for at forfølge fluorescens og MR-scanning ved hjælp af PB NP'er skyldes, at disse billeddiagnostiske modaliteter besidder komplementære funktioner. Fluorescensimagografi er en af de mest udbredte optiske molekylære billeddannende teknikker, og giver mulighed for samtidig visualisering af flere objekter ved høje følsomheder 1,16,17. Fluorescensimagografi er en sikker, ikke-invasiv modalitet, men er forbundet med lave dybder penetration og rumlige opløsninger 1,3,16. På den anden side, MRI genererer høj tidslig end rumlig opløsning non-invasivt og uden behov for ioniserende stråling 1,3,16. Men MRI lider lav følsomhed. Derfor fluorescens billeddannelse og MR blev udvalgt som de molekylære billeddiagnostiske teknikker på grund af deres komplementære træk i dybden penetration, følsomhed og rumlig opløsning.
Denne artikel præsenterer protokollen til syntese og biofunctionalization af PB nationale parlamenter, gadolinium-holdige PB NP'er (GdPB), og mangan-holdige PB NP'er (MnPB) 10,11. De følgende fremgangsmåder er beskrevet: 1) måling af størrelse, ladning og tidsmæssig stabilitet af nanopartiklerne, 2) vurdering af cytotoksicitet af nanopartiklerne, 3) Måling af MRI relaxiviteter, og 4) udnyttelse af nanopartikler til fluorescens og molekylær MR-billeddannelse af en population af målrettede celler in vitro. Disse resultater viser potentialet i NPS til brug som multimodale, molekylære afbildningsmidler in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese af PB NP'er, GdPB og MnPB
Syntese af nanopartiklerne (PB NPS, GdPB eller MnPB) opnås ved hjælp af en one-pot synteseskema ved at udføre de trin, der er beskrevet nedenfor:
- Forbered løsning 'A', der indeholder 5 ml 5 hexacyanoferrat mM kalium (II) i deioniseret (DI) vand. Afhængigt af hvilken type af nanopartikel blive syntetiseret - PB nationale parlamenter, GdPB eller MnPB forberede løsning 'B' på følgende måde:
- For PB NP'er: fremstilling af 10 ml af en opløsning indeholdende 2,5 mM jern (III) chlorid i DI vand.
- For GdPB NP'er: fremstilling af 10 ml af en opløsning indeholdende 2,5 mM af hver af gadolinium (III) nitrat og jern (III) chlorid i DI vand
- For MnPB NP'er: fremstilling af 10 ml af en opløsning indeholdende 2,5 mM af hver af mangan (II) chlorid og jern (III) chlorid i DI vand.
- Tilføj løsning 'B' til en rundbundet kolbe, og rør kolbens indhold ved stuetemperatur (RT) og1.000 rpm. Tilføj opløsning A dråbevis ned i rundbundet kolbe indeholdende løsning 'B'. Kontrollere gennemstrømningshastigheden for tilsætning af opløsning A til B "af en peristaltisk pumpe indstillet til at dispensere ca. 10 ml / time.
- Fortsæt omrøring ved 1.000 rpm ved stuetemperatur i yderligere 30 minutter efter tilsætning af opløsning "A" til "B" er færdig. Stop omrøring og indsamle blandingen.
- Overfør alikvoter af blandingen i mikrocentrifugerør at skylle nanopartiklerne fri for uomsatte komponenter. Tilsæt 5 M NaCl (0,2 ml NaCl / ml reaktionsblanding) til hver portion for at hjælpe med partikel indsamling ved centrifugering.
- Centrifuger hvert aliquot af nanopartikler i mindst 10 min ved 20.000 x g. Efter centrifugering fjernes forsigtigt supernatanten.
- Resuspender hver nanopartikel pellet i 1 ml DI vand via sonikering ved anvendelse af en mikrospids (sonication puls on / off = 1/1 sek, amplitude = 50%, varighed =5 sek, sonikator effekt = 125 W) til at bryde op pellet.
- Gentag trin 1,4-1,6 mindst 3 × at sikre, at nanopartiklerne er fri for bestanddele af den oprindelige reaktions- og reaktionsbiprodukter. Efter den sidste centrifugering, resuspenderes partiklerne i 1 ml deioniseret vand.
2. Biofunctionalization af PB NP'er, GdPB og MnPB
Biofunctionalization af nanopartiklerne involverer belægning af nanopartikel "kerner" med avidin og tilsætning biotinylerede ligander som beskrevet nedenfor:
- Coating af nanopartiklerne med fluorescerende Avidin
Coating af nanopartikler med fluorescerende avidin opnås ved anvendelse af elektrostatisk selvsamling hvor positivt ladede avidin (pi ~ 10,5) er belagt på negativt ladede nanopartikler som følger 18:- Forbered suspensioner af PB NP'er, GdPB eller MnPB i 1 ml DI vand. Filter Alexa Fluor 488-mærket avidin (A488; rekonstitueret i DI vand)gennem et 0,2 um nylon mikrocentrifuge filter ved 14.000 x g i 10 min. Tilføj ≤0.2 mg avidin / mg nanopartikler. Tilføj hver filtrerede prøve af A488 separat til portioner af PB nationale parlamenter, GdPB eller MnPB.
- Kontakt nanopartiklerne med A488 for 2-4 timer med forsigtig rystning eller rotation ved 4 ° C. Beskyt prøverne fra lys ved hjælp aluminiumsfolie.
BEMÆRK: Dette trin udbytter A488 belagt PB NP'er (PB-A488), GdPB (GdPB-A488), og MnPB (MnPB-A488).
- Attachment af biotinylerede antistoffer
Binding af biotinyleret målrettet antistoffer onto avidin-overtrukne nanopartikler opnås ved anvendelse af avidin-biotin interaktioner som følger:- Forbered suspensioner af avidinovertrukne nanopartikler - PB-A488, GdPB-A488, og MnPB-A488 i 1 ml DI-vand. Filter biotinyleret antistof (som leveret af producenten) gennem et 0,2 um nylon mikrocentrifuge filter ved 14.000 x g i 10 min.
BEMÆRK: Her nærværende undersøgelse anvender biotinylated anti-neuron-glial antigen 2 (Ang2), der er målrettet NG2 overudtrykt i celler og væv i centralnervesystemet og biotinyleret anti-humant eotaxin-3 (Eot3), der er målrettet receptorer overudtrykt i eosinofiler eller eosinofile cellelinjer. - Tilføje hver filtreret alikvot af biotinyleret antistof separat til portioner af avidinovertrukne nanopartikler. Tilføj ≤0.05 mg biotinylerede antistof / mg avidin-overtrukne nanopartikler. Kontakt avidin-coatede nanopartikler med de biotinylerede antistoffer (Ang2 eller Eot3) for 2-4 timer med forsigtig rystning eller rotation ved 4 ° C. Beskyt prøverne fra lys ved hjælp aluminiumsfolie.
BEMÆRK: Dette trin udbytter antistof coatede nanopartikler (f.eks GdPB-A488-Eot3 og MnPB-A488-Ang2).
- Forbered suspensioner af avidinovertrukne nanopartikler - PB-A488, GdPB-A488, og MnPB-A488 i 1 ml DI-vand. Filter biotinyleret antistof (som leveret af producenten) gennem et 0,2 um nylon mikrocentrifuge filter ved 14.000 x g i 10 min.
3. Dimensionering, Zeta Potential og Temporal Stabilitet af nanopartiklerne
Størrelsesfordelingen, ladning, og stabilitet af nanopartiklerne måles ved hjælp af dynamisklysspredning (DLS) metoder som beskrevet nedenfor:
- Dimensionering af Nanopartikler
Dimensionering af nanopartiklerne opnås ved anvendelse af dynamisk lysspredning som følger:- Tilsættes 10 ul af nanopartikel prøve (1 mg / ml) til 990 pi af DI vand i en engangs plastik kuvette.
BEMÆRK: Dette er repræsentativ værdi for en god DLS signal. - Cap kuvetten og vortex at blande godt. Anbring kuvetten i et system, der anvendes til at analysere partikelstørrelse for at måle størrelsen af nanopartikler. Foretag partikelstørrelse analyse på en måling vinkel på 173 °.
- Tilsættes 10 ul af nanopartikel prøve (1 mg / ml) til 990 pi af DI vand i en engangs plastik kuvette.
- Zetapotentiale af Nanopartikler
Zetapotentialet af nanopartiklerne måles ved anvendelse af fase analyse lysspredning som følger:- Tilsæt 100 pi af nanopartikel prøve (1 mg / ml) til 900 pi af DI vand i en engangs plastik kapillær celle. Denne værdi er repræsentativ for en god zetapotentiale måling.
- Placer kapillary celle i et system, der anvendes til at analysere zetapotentialet for at måle zetapotentialet af nanopartiklerne hjælp standardparametre ved 25 ° C.
- Temporal Stabilitet af den Nanopartikler
Tidsmæssig stabilitet af nanopartiklerne måles ved hjælp af dynamisk lysspredning som følger:- Vurdere stabiliteten af nanopartikler ved at måle størrelserne af nanopartikler i DI vand samt Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM), som beskrevet i afsnit 3.1.
- Gentag målingerne størrelse i DI vand og DMEM gang / dag over en periode på 5 dage.
4. cytotoksicitet Nanopartikler
Cytotoksicitet af nanopartiklerne måles under anvendelse af et XTT-celleproliferationsassay som følger:
- Seed 10.000-15.000 celler / brønd af hver celletype undersøgt (Neuro2A, BSG D10, EOL-1 og OE21) i en 96-brønds plade. Sørg for, at den samlede mængde af seedede celler ikke eXceed 0,2 ml / brønd. Inkuber podede celler natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
- Kontakt nanopartikler med cellerne:
- Inkubér cellerne med forskellige koncentrationer af nanopartikler (0,01-0,5 mg / ml). Se tabel 1 som et repræsentativt tabel, som beskriver størrelsen af nanopartiklerne (i 50 pi) tilsat til cellerne efter fjernelse 50 pi medium / brønd.
- For at tage højde for eventuelle interfererende absorbans af nanopartiklerne i analysen, tilføje en tom bestående af den passende koncentration af nanopartikler (0-0,5 mg / ml; i sidestilles med de beløb, der tilføjes til cellerne) til medium uden celler.
- Cellerne inkuberes med nanopartikler natten over ved 37 ° C og 5% CO2. Aspirer medier fra hver brønd, og skyl med farvning buffer bestående af 5% føtalt bovint serum (FBS) i phosphatpufret opløsning (PBS). Tilsæt 100 pi medier uden phenolrødt og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO 2for 16-18 timer.
- Inkubér cellerne med forskellige koncentrationer af nanopartikler (0,01-0,5 mg / ml). Se tabel 1 som et repræsentativt tabel, som beskriver størrelsen af nanopartiklerne (i 50 pi) tilsat til cellerne efter fjernelse 50 pi medium / brønd.
- Forbered XTT celleproliferationsassay arbejdsopløsning ved at blande kitkomponenter (XTT Reagent og XTT Activator) i henhold til fabrikantens specifikationer. Aspirer medierne fra brøndene, og 100 pi RPMI (RPMI w / o phenolrødt + 10% FBS + 1 × Pen-Strep) eller passende medium for den undersøgte celletype. Der tilsættes 50 pi XTT brugsopløsning til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i 2-2,5 timer.
- Absorbansen ved 490 nm, med en reference bølgelængde på 630 nm for at korrigere for fingeraftryk eller snavs. Beregn den korrigerede absorbans for hver brønd (A 490-A 630) og gennemsnittet af aflæsningerne for gentagelser.
- Fratræk datoer aflæsninger fra hver brønd værdi at beregne den endelige korrigerede absorbans værdier. Beregn overlevelse procentdel for hver prøve ved at normalisere den endelige korrigerede absorbans med den for ubehandlede celler uden nanopartikler. Plot survival procent som en funktion af nanopartikel koncentration.
5. MRI relaxiviteter af PB NP'er, GdPB og MnPB
MRI relaksivitet måles ved hjælp af T 1 - og T2-vægtede sekvenser ved fremstilling af et MRI "fantom" ved hjælp af en 96-brønds plade indeholdende nanopartikler, som beskrevet nedenfor:
- Phantom Forberedelse
- Forbered en plade med 96 brønde med hver brønd indeholdende 100 ul nanopartikler (PB NPS, GdPB eller MnPB) ved den passende koncentration. Begyndende med en koncentration på 0,4 mM for hver type nanopartikel, serielt fortynde nanopartiklerne 2 × hjælp DI vand, indtil en koncentration på 2,4 x 10 -5 M er nået (dette kræver 14 fortyndinger og 15 brønde).
- Tilsæt 100 pi af smeltet 1% agarose opløsning i demineraliseret vand i hver brønd, og bland godt. Tillad gelen at størkne ved 4 ° C i 12 timer.
BEMÆRK: Dette giver en fantom indeholdende serielle fortyndinger afnanopartiklerne i størknet agarose. - Placer stiplet i en horisontal 3 T klinisk magnet under en solid blok af 2% agar (150 cm3). Fastgør fantom og blok af agar i centrum af en 8-kanals HD hjerne spole. Mål relaksationstider anvendelse af 0,5 mm tykke koronale skiver på højde med midten af den 96-brønds plade 11.
- T 1 - og T2-vægtede sekvenser
Brug følgende repræsentative indstillinger for at erhverve sekvenserne i den kliniske magnet.
BEMÆRK: Disse værdier er optimeret til nanopartikler, der anvendes i den foreliggende undersøgelse:- Anskaf T 1 vægtede (T1W) MR-billeder ved hjælp af følgende flydende svækkede inversion recovery (FLAIR) sekvens: Echo tog (ET) = 8, gentagelse tid (TR) = 2.300 ms, Echo tid (TE) = 24,4 msek, Matrix størrelse = 512 x 224, synsfelt (FOV) = 16 x 16 cm 2.
- Acquire T2-vægtede (T2W) MR-billeder ved hjælp af følgende hurtige Relaxation hurtigt spin-ekko (FRFSE) sekvens: ET = 21; TR = 3.500 ms; Te = 104 ms; Matrix size = 512 x 224; FOV = 16 x 16 cm 2.
- Anskaf T1W og T2W MR-billeder på 127 MHz (3 T) ved følgende inversion gange: 50, 177, 432, 942, 1.961 og 4.000 msek.
- Måling af MRI relaxiviteter
- Efter at erhverve T1W og T2W billeder ved hjælp af sekvenserne beskrevet i afsnit 5.2, måle signal intensitet for hver brønd med ImageJ fremover udpeget som område af interesse (ROI) ved at vælge hver ROI ved hjælp af knappen Beskær ovale placeret på hovedværktøjslinjen, så vælge Analyze> Mål.
BEMÆRK: En pop-up skal vise den gennemsnitlige signal intensiteten af hver ROI i kolonnen mærket "Mean". - For hver ROI, plotte målte signal intensitet mod dets særlige inversion tid. Hvis brug vendes punkter (aflæsninger), der genererer en indledende "boble" eller outliers i starten af plottet (lavere inversiongange).
BEMÆRK: Disse aflæsninger genereres ved lave inversion gange, fordi MRI måler størrelsen eller absolutte værdi af billeder i stedet for deres faktiske (negativ) værdi, som skal regnskabsmæssigt / korrigeret for 19. - Forbered en eksponentiel pasform til hver plot af signal intensitet for ROI'er (SI) vs. inversion gange (T I) som beskrevet i afsnit 5.2. Plot T I på x-aksen, SI på y-aksen; ɑ og Δ er konstanter bestemmes af regression, og T 1- eller T 2 er den variable, der skal løses:
hvor t = T 1, T 2. - Løs for T 1- eller T 2 ved hjælp af ovenstående ligning og plot den inverse af de beregnede værdier (1 / T 1 og 1 / T 2) mod koncentrationerne af de nanopartikler, der anvendes i hver ROI.
- Beregn hældningen af den lineære graf, dergiver de relaxiviteter R1 og R2.
BEMÆRK: Følgende afsnit af protokollen beskriver anvendelsen af nanopartikler til fluorescerende mærkning og generere MRI kontrast i målrettede celler.
- Efter at erhverve T1W og T2W billeder ved hjælp af sekvenserne beskrevet i afsnit 5.2, måle signal intensitet for hver brønd med ImageJ fremover udpeget som område af interesse (ROI) ved at vælge hver ROI ved hjælp af knappen Beskær ovale placeret på hovedværktøjslinjen, så vælge Analyze> Mål.
6. fluorescensmærkning af målrettede celler Brug af Nanopartikler - konfokal mikroskopi
BEMÆRK: nanopartikler (PB NPS, GdPB og MnPB) kan anvendes til fluorescens mærke en population af målceller (overvåget ved konfokal mikroskopi) som følger:
- Syntese af det fluorescerende Nanopartikler
- Syntetisere GdPB-A488, GdPB-A488-Eot3, MnPB-A488, MnPB-A488-Ang2 til fluorescerende mærkning af en population af målrettede celler ved at følge trinene beskrevet i afsnit 1 og 2.
- Udarbejdelse af celler til fluorescens Målretning
- Coat nr. 1,5 mikro dækglasset ved at dyppe dem i en opløsning af 0,002% poly (L-lysin) hydrobromid i 90 min. Fjern låget briller fra opløsningen og lad dem tørre i 24 timer.
- Frø cellerne (f.eks EOL-1, BSG D10, SUDIPG1) på de overtrukne dækglas placeret i en 6-brønds plade og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 i mindst 16 timer. Skyl cellerne med en 1 × PBS-opløsning og (valgfrit) fastsætte med 10% formaldehyd i neutral buffer opløsningen i 15 minutter. Farv cellerne med 5 um rødorange celle-gennemtrængende farvestof i PBS ved 37 ° C i 30 minutter. Derefter skylles cellerne med PBS.
- > Fluorescensmærkning af målrettede celler
- Tilsæt 1% bovint serumalbumin (BSA; i DI vand) til cellerne for at minimere ikke-specifik binding på cellerne, og der inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Cellerne inkuberes med nanopartiklerne i 1% BSA i 1 time. For EOL-1: inkuberes med 0,2 mg / ml GdPB-A488 eller GdPB-A488-Eot3; For BSG D10 og SUDIPG1: inkuberes med 0,2 mg / ml MnPB-A488 eller MnPB-A488-Ang2. Skyl cellerne med PBS 3 × fjerne unbound nanopartikler.
- Vendes forsigtigt dækglasset (indeholdende celler og nanopartikler) på et objektglas, der sikrer, at der ikke er nogen luftbobler. Forsegl kanten mellem dækglasset og objektglas ved omhyggeligt at anvende klar neglelak. Billede cellerne under anvendelse af et konfokalt laserscanningsmikroskop.
7. fluorescensmærkning af målrettede celler Brug af Nanopartikler - flowcytometri
Nanopartiklerne (PB NP'er, GdPB og MnPB) kan anvendes til fluorescens etiket en population af målceller (overvåget ved flowcytometri) som følger:
- Forbered suspensioner af cellerne bliver målrettet i PBS. For kultur studier rene, suspensionerne bestå af en enkelt celle (f.eks BSG D10); resuspendere en cellepellet af BSG D10 celler i PBS ved 100.000 celler / ml (10 ml i alt). For kultur studier blandede, affjedringen består af mindst to celletyper (f.eks EOL-1 og OE21); svarende til BSG D10, resuspender cellepellets af EOL-1 og OE21 i PBS ved 100.000 celler / ml af hver (10 ml i alt).
- Forbered varierende forhold af EOL-1: OE21 1: 0 (2 ml EOL-1), 3: 1 (1,5 ml EOL-1, 0,5 ml OE21), 1: 1 (1 ml hver af EOL-1 og OE21) 1: 3 (0,5 ml EOL-1, 1,5 ml OE21), 0: 1 (2 ml OE21).
- Bloker cellerne (rene og blandede suspensioner) blive ramt af nanopartiklerne med 2 ml 5% BSA for at minimere ikke-specifik binding.
- Tilsæt 1 ml (1 mg / ml) nanopartikler til cellerne og inkuberes i 1 time. For BSG D10, inkuberes celler med MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (kontrol antistof), eller MnPB-A488-Ang2). For blandinger af EOL-1 og OE21 inkuberes blandingerne med et fast beløb på GdPB-A488-Eot3.
- Skyl cellerne fri for ubundne nanopartikler ved spinding ned prøverne ved 1000 x g i 5 minutter mindst 3 × at fjerne ubundne partikler. Opblande cellerne i 1 ml PBS og løse med 10% formaldehyd i PBS. Farv cellerne ved inkubation med 10 ug / ml7-Aminoactinomytcin D i PBS på is i 30 minutter. Skyl med PBS, derefter analysere 10.000 gated celler fra hver prøve ved hjælp flowcytometer.
8. Generering MRI kontrast på målrettede celler under anvendelse af nanopartikler
Nanopartiklerne (PB NPS, GdPB og MnPB) kan anvendes til at generere MRI-kontrastmiddel (i begge T 1 - og T2-vægtede sekvenser) i en population af målceller som følger:
- Phantom Forberedelse
- Grow celler (f.eks BSG D10) i T75 kolber indtil ~ 80% konfluens. Brug passende vækstmedium og betingelser. For BSG D10, dyrke cellerne i DMEM + 10% FBS + 1 × Pen-Strep ved 37 ° C og 5% CO2.
- Skyl celler fri for medium med 5 ml PBS og blokere cellerne med 5 ml 1% BSA i PBS i 1 time for at minimere ikke-specifik binding. Tilsæt 5 ml (0,5 mg / ml) nanopartikler til cellerne. For BSG D10, inkuberes cellerne med MnPB-A488, MnPB-A488-ABC (kontrol antistof), og MnPB-A488-Ang2 i 1 time.
- Skyl celler 3 × med 5 ml PBS for at fjerne ubundne nanopartikler. Trypsinisér cellerne ved at inkubere cellerne med 2 ml Trypsin EDTA 0,25% opløsning 1 × i 5 minutter ved 37 ° C og 5% CO 2 for at frigøre dem fra kolben for phantom forberedelse. Tilsæt 8 ml DMEM for at standse trypsinisering af celler.
- Indsamle cellerne ved centrifugering dem ved 1.000 x g i 5 minutter; aspireres ud supernatanten. Opblande cellerne i 1 ml PBS, og der tilsættes 1 ml 10% formaldehyd i PBS til at fastsætte cellerne. Tilsæt 100 pi af hver prøve til en separat brønd i en plade med 96 brønde.
- Tilsæt 100 pi af smeltet 1% agaroseopløsning i DI vand i hver brønd, og bland godt ved pipettering op og ned. Tillad gelen at størkne ved 4 ° C i 12 timer.
BEMÆRK: Dette giver en fantom indeholder celler med vedhæftede nanopartikler i størknet agarose. - Placer stiplet i en horisontal 3 T klinisk magnet ved siden af en solid blok af 2% agar (150 cm
- T 1 - og T2-vægtede sekvenser
Brug følgende indstillinger til at erhverve sekvenserne i det kliniske MRI magnet:- Acquire T1W MR-billeder ved hjælp af følgende spin-ekko sekvens: Echo tog (ET) = 1, gentagelse tid (TR) = 650 ms, Echo tid (TE) = 11 msek, Matrix size = 320 x 256, synsfelt (FOV) 10 x 10 cm 2.
- Acquire T2W MR-billeder ved hjælp af følgende FRFSE sekvens: ET = 28; TR = 3.000 ms; Te = 101 msek; Matrix size = 384 x 288; FOV = 10 x 10 cm 2.
- Post-køb Processing
- For lettere læsning, konvertere de originale gråskalabilleder i en farveskala billedet ved hjælp ImageJ: Vælg Image> type> 8-Bit, at konvertere billedet til gråtoner.
- Beregn for hver prøve den normaliserede intensitet efter subtraktion af signalet bidrag fra agaroseopløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug af one-pot synteseskema, nanopartikler af PB NP'er (middeldiameter 78,8 nm, polydispersitetsindeks (PDI) = 0,230; beregnet ved dynamisk lysspredning instrument), GdPB (middeldiameter 164,2 nm, PDI = 0,102) eller MnPB ( middeldiameter 122,4 nm, PDI = 0,124), som er monodisperse (som målt ved DLS) kan konsekvent syntetiseret (figur 2A). De målte zetapotentialer af det syntetiserede nanopartikler er mindre end -30 mV (figur 2B), hvilket indikerer moderat stabilitet af partiklerne baseret på deres overfladeladninger. De syntetiserede nanopartikler udviser tilstrækkelig tidsmæssig stabilitet over en periode på 5 dage som angivet ved deres konsekvente størrelser (hydrodynamiske diametre, figur 2C).
Når co-inkuberet med celler, nanopartiklerne (PB NPS, GdPB og MnPB) udviser ubetydelig cytotoksicitet til cellerne under visse tærskelkoncentrationer (figur 3). Cytotoksicitet studør af PB nationale parlamenter på Neuro2A celler indikerer ubetydelig cytotoksicitet ved samtidig inkuberes med Neuro2A ved koncentrationer lavere end 0,67 × 10 -6 mg / celle (figur 3A). Cytotoksicitetsstudier udført ved co-inkubering af GdPB med EOL-1 og OE21 celler indikerer ubetydelig cytotoksicitet af GdPB på begge celletyper ved koncentrationer lavere end 0,25 × 10 -6 mg / celle (figur 3B). Lignende, cytotoksicitet studier indikerer ubetydelig cytotoksicitet af MnPB ved samtidig inkuberet med BSG D10 ved koncentrationer lavere end 0,25 × 10 -6 mg / celle (figur 3C). Den yderligere cytotoksicitet af MnPB og GdPB kan tilskrives tilstedeværelsen af yderligere ioner (Mn 2+ for MnPB og Gd 3+ for GdPB) i nanopartikel kerne.
MRI relaksiviteten blev udført ved hjælp af fantomer består af varierende koncentrationer af PB nationale parlamenter, GdPB, og MnPB. Undersøgelserne indikerer anvendeligheden af nanopartikler som MRI-kontrastmidler i både T1W og T2W sekvenser (Figur 4). Det fremgår af den øgede hyperintensities (positiv kontrast) i T 1 vægtede sekvenser og øgede hypointensities (negativ kontrast) i T2-vægtede sekvenser med stigende koncentrationer af både GdPB (figur 4A) og MnPB (figur 4B). Baseret på relaksiviteten målinger MnPB er en moderat T 1 middel og en stærk T 2 agent mens GdPB er en stærk T 1 middel og en moderat T2 agent (figur 4C). De målte relaxiviteter af GdPB og MnPB tåler sammenligning med de klinisk godkendte kontrastmidler 10, 11.
De biofunctionalized PB NP'er er i stand til fluorescens mærke en population af målrettede celler in vitro (figur 5). Når biofunctionalized med både fluorescerende avidin (A488) og biotinyleret anti-humant eotaxin-3 antistof (Eot3) kan GdPB fluorescens målrette en population af EOL-1-celler (figur 5B). Kontrol GdPB nanopartikler uden Eot3 udviser ubetydelig binding (figur 5A) Tilsvarende, når GdPB er biofunctionalized med både fluorescerende avidin (A488) og biotinyleret anti-neuronal glia antigen-2 (Ang2) nanopartiklerne kan fluorescens målbefolkning BSG D10 og SUDIPG1 neurosfærer (figur 5D og F), mens kontrol nanopartikler uden målretning antistof er i stand til fluorescens mærke de celler (figur 5C og E). Således effektiv målretning og fluorescerende mærkning kræver tilstedeværelse af både fluorescerende avidin og biotinyleret målrettet ligand.
Evne til biofunctionalized nanopartikler til fluorescens mærke en population af celler, som kvantificeret ved flowcytometri bekræfter behovet for både fluorescerende avidin og biotinylated målretning ligand for effektiv fluorescerende mærkning (figur 6). BSG D10 celler i kontakt med MnPB indeholdende både A488 og Ang2 (MnPB-A488-Ang2) udviser forøget fluorescens (figur 6A) og procentdelen af fluorescens-mærkede celler (figur 6B) sammenlignet med kontrol fluorescerende nanopartikler med en kontrol antistof (MnPB-A488 -abc) og uden et antistof (MnPB-A488). De biofunctionalized nanopartikler er i stand til fluorescens målrette en specifik sub-population af celler i en celle blanding (figur 6C). Dette demonstreres som faste mængder af EOL-1-targeting, er fluorescerende GdPB (GdPB-A488-Eot3) kontaktet med målrettede celler (EOL-1) og kontrol celler (OE21). Fluorescens øges som andele af EOL-1 øges (øget Alexa Fluor 488 signalintensitet; figur 6C) i blandingen. Dette indikerer specificiteten af nanopartiklerne for denne sub-population af celler i cell blanding.
De biofunctionalized PB NP'er øge MRI kontrast i en population af målrettede celler (figur 7). Når BSG D10 celler bringes i kontakt med tilsvarende koncentrationer af eksperimentelle (MnPB-A488-Ang2) og kontrol (MnPB-A488-ABC og MnPB-A488) nanopartikler, fantomer udviser øget hyperintensity for celler i kontakt med MnPB-A488-Ang2 sammenlignet med kontroller i T1W sekvenser og øget hypointensity for celler i kontakt med MnPB-A488-Ang2 sammenlignet med kontroller i T2W sekvenser (figur 7A). Billede analyse af ROI'er i fantom bekræfter denne tendens, hvor celler i kontakt med eksperimentelle partikler udviser signifikant forøget intensitet i forhold til kontrol i T1W sekvenser og væsentligt nedsat styrke i forhold til kontroller i T2W sekvenser (Figur 7B).
Figur 1: Kernen-shell design af PB NP'er. Kernen består af en PB gitter, som består af lineære cyanid ligander i en Fe II - CN -. Fe III binding Disse bindinger muligt PB NP'er at optage kationer inden for sit tredimensionalt netværk som et middel til at afbalancere afgifter 5. Denne kation-bindende evne preussiske blå udnyttes til at indlæse gadolinium og mangan ioner i gitter, der giver MRI kontrast. Kernen overtrækkes med et biofunktionelle shell består af fluorescerende avidin at muliggøre fluorescensimagografi og biotinylerede ligander for at aktivere molekylært målretning.
Figur 2:. Størrelse, ladning, og stabilitet i PB NP'er (A) Størrelse fordelinger af PB (blå), GdPB (rød) og MnPB (sort) nanopartikler målt ved DLS. (B (C) Temporal stabilitet PB (blå), GdPB (rød) og MnPB (sort) nanopartikler i vand (fast stof) og DMEM (stiplet) i fem dage efter deres syntese målt ved DLS.
Figur 3:. Cytotoksicitet PB NP'er Cytotoksicitetsstudier hjælp af forskellige koncentrationer af (A) PB nationale parlamenter sættes til et fast antal Neuro2A celler (B) GdPB tilføjet til et fast beløb på EOL-1 og OE-21-celler, henholdsvis og ( C) MnPB tilsat til et fast antal BSG D10 celler. Celleoverlevelse blev beregnet på 24 og 48 timer. Gengivet med tilladelse fra ref 11, copyright 2014 American Chemical Society; Ref 10 med tilladelse fra Dove Press Ltd og Ref 21 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry.
Figur 4: MR-billeder og relaxiviteter af GdPB og MnPB på 3 T. Hyperintensity i T 1 vægtede sekvenser og hypointensity i T2-vægtede sekvenser af (A) GdPB og (B) MnPB som en funktion af koncentration af nanopartikler. (C) tabelopstilling over de relaxitivies af PB NP'er, GdPB og MnPB målt ved 3 T. gengivet med tilladelse fra ref 11, copyright 2014 American Chemical Society.
Figur 5: Fluorescerende mærkning af målrettede celler med biofunctionalized PB nationale parlamenter, som målt ved laserscanning konfokal mikroskopi Billeder af EOL-1 celler behandlet med (A) kontrol (GdPB-A488) og (B) eksperimentelle (GdPB-A488-Eot3. ) nanopartikler.Billeder af BSG neurosfærer behandlet med (C) kontrol (MnPB-A488) og (D) eksperimentelle (MnPB-A488-Ang2) nanopartikler. Billeder af SUDIPG1 neurosfærer behandlet med (E) kontrol (MnPB-A488) og (F) eksperimentelle (MnPB-A488-Ang2) nanopartikler. Gengivet med tilladelse fra ref 11, copyright 2014 American Chemical Society. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 6: Fluorescerende mærkning af målrettede celler med biofunctionalized PB NP'er, målt ved flowcytometri (A) Flowcytometri histogrammer af BSG D10 celler behandlet med eksperimentel (MnPB-A488-Ang2) og kontrol (MnPB-A488-ABC og MnPB. -A488) nanopartikler. (B) Percentage af BSG D10 celler fra panel (A), der er fluorescerende (% af Alexa-Fluor positiv) ved behandling med eksperimentel (MnPB-A488-Ang2) og kontrol (MnPB-A488-ABC og MnPB-A488) nanopartikler, ** p <0,05. (C) Flowcytometri scatter plots af en celle blanding med varierende indhold af EOL-1 (målrettede celler) og OE21 (kontrol celler) er omfattet af de nanopartikler (GdPB-A488-Eot3). Gengivet med tilladelse fra ref 11, copyright 2014 American Chemical Society og fra Ref 10 med tilladelse fra Dove Press Ltd. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 7:. Stigende MRI kontrast i målrettede celler med biofunctionalized PB nationale parlamenter (A) T 1 vægtede og T <sub> 2 vægtede kontrast forbedring i fantomer består af et fast antal BSG D10 celler behandlet med eksperimentelle (MnPB-A488-Ang2) og kontrol (MnPB-A488-ABC og MnPB-A488) nanopartikler. (B) Normalized signal intensitet for BSG D10 celler behandlet med eksperimentel (MnPB-A488-Ang2) og kontrol (MnPB-A488-ABC og MnPB-A488) nanopartikler, ** p <0,05. Gengivet fra Ref 10 med tilladelse fra Dove Press Ltd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel har fremlagt metoder til syntese af en ny klasse af multimodale, molekylære imagografimidler baseret på biofunctionalized Prussian Blue nanopartikler. De molekylære afbildningsmodaliteter inkorporeret i nanopartiklerne er fluorescensimagografi og molekylær MRI på grund af deres komplementære funktioner. De biofunctionalized preussiske blå nanopartikler har en kerne-shell design. De vigtigste trin i syntesen af disse nanopartikler er: 1) one-pot-syntese, som giver de kerner, der består af preussiske blå nanopartikler (PB NPS), gadoliniumholdige preussiske blå nanopartikler (GdPB) eller mangan-holdige preussiske blå nanopartikler (MnPB), 2) biofunctionalization af nanopartiklerne med fluorescerende avidin ved elektrostatisk selvsamling, og 3) fastgørelse af biotinylerede ligander (antistoffer) til nanopartiklerne ved hjælp robuste avidin-biotin interaktioner. Både fluorescerende avidin og de biotinylerede ligander udgør biofunctional skallen af nanopartikler.
Den ene-pot syntese giver PB NP'er, GdPB eller MnPB der fungerer både som T 1 og T 2 kontrastmidler til MR-scanning. Størrelsen af de paramagnetiske ioner (gadolinium eller mangan) indlæst i nanopartikel kerne kan ændres (øget eller nedsat) ved at variere størrelsen af de paramagnetiske ion-holdige salte (gadolinium (III) nitrat og mangan (II) chlorid) i one-pot-syntese (trin 1.2). Dette resulterer i ændret (øget eller nedsat) MRI signalintensiteter. Disse ændringer af den syntese ordning, kan imidlertid resultere i ustabile, aggregerede nanopartikler. At afbøde problemer forbundet med aggregering, kan one-pot syntese modificeres til at inkorporere størrelse-kontrollerende capping midler, såsom citrat under syntese 20.
Biofunctionalization af nanopartikler kerner opnås ved elektrostatisk selvsamling med fluorescerende avidin, hvilket ENABles fluorescensimagografi. Elektrostatisk selvsamling kræver modsatte ladninger på overfladen af nanopartiklerne og belægningen polymer (i denne artikel, fluorescerende avidin). For at ændre overfladen funktionaliteten af nanopartiklerne, kan avidin erstattes af positivt ladede polymerer (f.eks polylysin eller en amin-gruppe indeholdende polyethylenglycol) under syntesen. Men de relative andele af nanopartikler og coating polymer skal optimeres for at opretholde nanopartikel størrelse og stabilitet og for at forhindre aggregering.
Tilsætning af de biotinylerede antistoffer onto avidinovertrukne nanopartikler giver molekylære målretning til PB-baserede nanopartikler. Dette trin er baseret på den robuste interaktion mellem avidin og biotin (ligevægtsdissociationskonstanten, K D ~ 10 -15). Som med tidligere trin, de relative andele af de avidinovertrukne nanopartikler og biotinylerede ligander skal være optimized således at forhindre den biotinylerede ligand fra samtidig binding to avidin overtrukne nanopartikler resulterer i nanopartikel aggregering. For molekylær målretning kan antistofferne erstattes af andre målretning ligander, såsom antistoffragmenter (FAB), variable fragment enkelt kæde (scFv), peptider eller aptamerer.
De vigtigste fordele ved denne metode til syntese biofunctionalized nanopartikler som multimodale, molekylære afbildningsmidler er: 1) facile one-pot (1-trin) syntese af nanopartikler kerner, og 2) sekventiel berørende trin (elektrostatisk selvsamling og avidin- biotin interaktioner) til at overtrække nanopartikel kerne med en biofunktionelle shell. Andre fordele ved nanopartiklerne nævnes, at Prussian blue (solgt som Radiogardase) allerede er FDA-godkendt til human anvendelse, og at nanopartiklerne, der resulterer fra en-pot synteseskema kan anvendes som et MRI-kontrastmiddel i både T 1 ( positiv) og T 2 </ Sub> (negative) vægtede sekvenser, som ikke let nås med andre kontrastmidler eller nanopartikler platforme uden komplicerede synteseskemaer eller specialiserede kemikalier til syntese af kontrastmidler. En begrænsning af den teknik er, at syntesen kan føre til polydisperse nanopartikler med aggregater, hvis de relative andele af reaktanterne i både nanopartikel kerne syntese og biofunktionelle skalcoating trin ikke strengt optimeret til de reaktanter, der anvendes i disse særlige trin. For eksempel kan de relative andele til coating nanopartiklerne kerner med avidin ikke udvides til overtrækning af nanopartikler med polylysin uden optimering undersøgelser forudgående.
Efter mastering teknikken til syntese biofunctionalized preussiske blå nanopartikler er beskrevet her, kan dette alsidige design modificeres til molekylær billeddannelse undersøgelser in vivo. Dette vil kræve PEGylering af nanopartiklerne for lavere Immunogenicity og længere cirkulationstider in vivo. Svarende til den her beskrevne udformning kan PB NP'er blive biofunctionalized med antistoffer forud for in vivo administration. Andre undersøgelser omfatter anvendelse af biofunctionalized PB NP'er for theranostic (samtidig terapi + diagnostiske) anvendelser in vivo. Studier der undersøger brugen af preussiske blå nanopartikler til photothermal terapi (baseret på deres absorbans karakteristika på nær infrarøde bølgelængder) er i øjeblikket i gang 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium hexacyanoferrate (II) trihydrate (K4Fe(CN)6·3H2O) | Sigma-Aldrich | P9387 | |
| Manganese (II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Gadolinium (III) nitrate hexahydrate (Gd(NO3)3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 211591 | |
| Iron (III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan, Biotin Conjugate Antibody | Millipore | AB5320 | |
| Biotinylated Anti-Human Eotaxin-3 | Peprotech | 500-P156GBT | |
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| BSG D10 Cell Line | Lab stock | --- | |
| OE21 Cell Line | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| SUDIPG1 Neurospheres | Lab stock | --- | |
| Eol-1 Cell Line | Sigma-Aldrich | 94042252 | |
| Poly(L-lysine) hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1399 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Aminoactinomycin D | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange, AM | Life Technologies | C34851 | |
| Avidin-Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21370 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Peristaltic Pump | Instech | P270 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | |
| Sonicator | QSonica | Q125 | |
| Hot Plate/Magnetic Stirrer | VWR | 97042-642 | |
| Ultra Clean Aluminum Foil | VWR | 89107-732 | |
| Vortex Mixer | VWR | 58816-121 | |
| 1.7 ml conical microcentrifuge tubes | VWR | 87003-295 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | VWR | 21008-918 | |
| Tube holders | VWR | 82024-342 | |
| Disposable plastic cuvettes | VWR | 7000-590 (/586) | |
| Zetasizer capillary cell | VWR | DTS1070 | |
| Centrifugal Filters, 0.2 micrometer spin column | VWR | 82031-356 | |
| 96-well cell culture tray | VWR | 29442-056 | |
| Trypsin EDTA 0.25% solution 1x | JR Scientific | 82702 | |
| Cell Culture Grade PBS (1x) | Life Technologies | 10010023 | |
| XTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4891-025-K | |
| T75 Flask | 89092-700 | VWR | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Biowhitaker | 12-604Q | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-010 | |
| Pen-Strep 1x | Life Technologies | 15070063 | |
| Fluoview FV1200 Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1200 | |
| Chambered Microscope Slides | Thermo Scientific | 154534 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| RPMI | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| 3 T Clinical MRI Magnet | GE Healthcare | ||
| 100 ml round-bottom flask |
References
- Massoud, T. F., Gambhir, S. S. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev. 17, 545-580 (2003).
- Mankoff, D. A. A Definition of Molecular Imaging. J Nucl Med. 48 (6), 18N-21N (2007).
- James, M. L., Gambhir, S. S. A Molecular Imaging Primer: Modalities, Imaging Agents, and Applications. Phys Rev. 92, 897-965 (2012).
- Cao, W., Chen, X. Multimodality Molecular Imaging of Tumor Angiogenesis. J Nucl Med. 49 (2), 113S-129S (2008).
- Heinrich, J. L., Berseth, P. A., Long, J. R. Molecular Prussian Blue analogues: synthesis and structure of cubic Cr4Co4(CN)12 and Co8(CN)12 clusters. Chem Commun. 11, 1231-1232 (1998).
- Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD). , National Center for Biotechnology Information. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK5330 (2004).
- Zhu, D., Liu, F., Ma, L., Liu, D., Wang, Z. Nanoparticle-Based Systems for T1-Weighted Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents. Int J Mol Sci. 14 (5), 10607-1010 (2013).
- Bartolini, M. E., et al. An investigation of the toxicity of gadolinium based MRI contrast agents using neutron activation analysis. Magn. Reson. Imaging. 21 (5), 541-544 (2003).
- Adel, B., et al. Histological validation of iron-oxide and gadolinium based MRI contrast agents in experimental atherosclerosis: The do's and don't's. Atherosclerosis. 225 (2), 274-280 (2012).
- Dumont, M. F., Yadavilli, S., Sze, R. W., Nazarian, J., Fernandes, R. Manganese-containing Prussian blue nanoparticles for imaging of pediatric brain tumors. Int J Nanomedicine. 9, 2581-2595 (2014).
- Dumont, M. F., et al. Biofunctionalized gadolinium-containing prussian blue nanoparticles as multimodal molecular imaging agents. Bioconjug Chem. 25 (1), 129-137 (2014).
- Yang, L., et al. Nephrogenic Systemic Fibrosis and Class Labeling of Gadolinium-based Contrast Agents by the Food and Drug Administration. Radiology. 265 (1), 248-253 (2012).
- Information on Gadolinium-Based Contrast Agents. , U.S. Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/PostmarketDrugSafetyInformationforPatientsandProviders/ucm142882.htm (2013).
- Mendonca-Dias, M. H., Gaggelli, E., Lauterbur, P. C. Paramagnetic contrast agents in nuclear magnetic resonance medical imaging. Sem in Nuc Med. 13 (4), 364-376 (1983).
- Izrailev, S., Stepaniants, S., Balsera, M., Oono, Y., Schulten, K. Molecular Dynamics Study of Unbinding of the Avidin-Biotin Complex. Biophys. 72 (4), 1568-1581 (1997).
- Chen, Z. Y., et al. Advance of Molecular Imaging Technology and Targeted Imaging Agent in Imaging and Therapy. Biomed Res Int. 2014, 1-12 (2014).
- Weissleder, R., Pittet, M. J. Imaging in the era of molecular oncology. Nature. 452 (7187), 580-589 (2008).
- Jaiswal, J. K., Mattoussi, H., Mauro, J. M., Simon, S. M. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates. Nature Biotech. 21 (1), 47-51 (2002).
- Mangrum, W., Christianson, K., Duncan, S., Hoang, P., Song, A., Merkle, E. Duke Review of MRI Principles. 304, Mosby. Philadelphia, PA. 304 (2012).
- Shokouhimehr, M., Soehnlen, E. S., Hao, J., Griswold, M., Flask, C., Fan, X., Basilion, J. P., Basu, S., Huang, S. D. Dual purpose prussian blue nanoparticles for cellular imaging and drug delivery: a new generation of T1-weighted MRI contrast and small molecule delivery agents. J. Mater. Chem. 20, 5251-5259 (2010).
- Hoffman, H. A., Chakrabarti, L., Dumont, M. F., Sandler, A. D., Fernandes, R. Prussian blue nanoparticles for laser-induced photothermal therapy of tumors. RSC Adv. 4 (56), 29729-29734 (2014).
