Introduction
Бактериальный клеточный цикл контролирует как репликация генома и деление дочерних клеток. Важно отметить, что, как устойчивость к антибиотикам является растущей угрозой для здоровья населения, бактериальный клеточный цикл представляет собой нетронутый цель для развития антибиотиков.
В бактерией Caulobacter crescentus, каждый клеточного цикла приводит к асимметричному разделения, получая две дочерние клетки разными судьбами (рис 1А) в 1,2 раза. Один дочерняя клетка наследует жгутик и подвижны, а другая дочь наследует стебель и сидячие. Интегрированный генетический контур регулирует прогрессию клеточного цикла и клеточной судьбы по регуляции транскрипции, фосфо-сигнализации, и регулируемого протеолиза 3. Кроме того, репликация хромосом и одновременно дают сегрегация дочерние клетки, которые содержат ровно одну копию хромосомы 4. Важно, что эти два типа клеток может быть быстро отделен от да КоллоIdal частиц кремнезема плотность центрифугирования в синхронизируемый NA1000 штамма 5-7, позволяющей изоляцию Swarmer клеток от остальной части населения с высокими выходами (рис 1б). Изолированные Swarmer клеток затем приступить синхронно через асимметричных клеточных делений. Здесь мы подробно протокол, используемый для синхронизации Caulobacter деформации NA1000. Мы предоставляем протоколы и общие советы по устранению неполадок для большого и малого масштаба синхронизации. Это экспериментальная процедура представляет собой мощный инструмент допросить пространственно-временной контроль клеточного цикла Caulobacter и судьбы клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Масштабная Synchrony - Оптимальное решение для вестерн-блот, Microarray / РНК-Seq и другие материалы интенсивной Анализы
- Из морозильной наличии или пластины, вырастить 5 мл O / N культуру штамма NA1000 встряхиванием при 28 ° С в среде PYE.
- Посев 0,5 мл клеток со стадии 1 в 25 мл M2G (табл 1-2) и встряхивают при 28 ° С до тех пор, пока культура достигает OD 600 между 0,5 и 0,6.
- Привить клеток в 1 л M2G и встряхнуть при 28 ° С.
- После того, как OD 600 достигает 0,5 до 0,6, подтверждают наличие Swarmer клеток с использованием жидкого установлен фазового микроскопа. Пятно 1 мкл клеток на предметное стекло, покрывают покровным и изображения на фазовой микроскопии. Подтвердите наличие Swarmer клеток, визуализируя быстро плавающих клеток в популяции.
- Спин клетки в течение 15 мин при 7 kxg при 4 ° С в JA-10 роторе.
- Удалите супернатант и добавить 180 мл холодной М2 (табл 1-2) и аккуратно ресuspend все клетки с помощью серологических пипетки. Отменить свободно осажденные клетки; они predivisional и пошел клетки.
- Добавить 60 мл холодной раствор коллоидного кремнезема (не забудьте смешать коллоидной суспензии диоксида кремния перед добавлением к клеткам) и смешать клеточной суспензии хорошо.
- Налейте клеточной суспензии на восемь 30 мл пробирки и вращаться в течение 30 мин в 6,4 kxg при 4 ° С в JA-20 роторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Надо было видеть две отдельные полосы; Swarmer полоса нижняя полоса, а стебельчатые / predivisional клетки находятся в верхней полосе (рис 1б). - Тщательно аспирата верхнюю полосу и снимите жидкость ~ 1 см выше Swarmer диапазона (нижняя зона).
- (Критический) С помощью пипетки Пастера, осторожно снимите Swarmer группу и поместить в чистую пробирку. Для смыть коллоидный диоксид кремния, топ трубку с холодной М2 и спина в течение 10 мин при 6,4 kxg при 4 ° С в JA-20 ротора.
- Осторожно удалите супернатант и ресуспендируютклетки в 20 мл холодной М2 и спина в течение 10 мин при 6,4 kxg при 4 ° С в JA-20 ротора.
- Ресуспендируют все гранулы в 30 мл холодного М2 и измерить OD 600, используя спектрофотометр и заготовки с использованием холодного M2 среды. Сохранить 1 мкл для отображения фазы, чтобы проверить на Swarmer клеток; 90-95% клеток должны быть Молодые паразиты.
- Спин вниз клетки в течение 5 мин при 6,4 kxg при 4 ° С в JA-20 роторе. Ресуспендируют клеток в 28 ° С M2G среды таким образом, чтобы 600 ~ 0,3-0,4 и начинают встряхивании при 28 ° С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные выходы находятся между 30 и 60 мл Swarmer культуре клеток из 1 л асинхронных клеток. - Начните принимать временные точки (дикий тип культуры займет около 135-140 минут, чтобы разделить) 8,9. В каждый момент времени, измерьте наружный диаметр 600. Убедитесь, что OD 600 после разделения примерно 2X начальная OD 600.
- Для вестерн-блот или экспрессии генов анализов, удалите 1 мл аликвоты кубlture в желаемых временных точках, спин вниз на максимальной скорости в настольной центрифуге в течение 30 секунд, быстро декантируют и аспирации среды, и флэш заморозить осадок клеток в жидком азоте. Хранить клеток при -80 ° С до анализа вниз по течению.
2. Малый Synchrony - Оптимальное решение для микроскопии
- Из морозильной наличии или пластины, растут 5 мл O / N культуры встряхивании при 28 ° С в M2G.
- Развести в 15 мл M2G (табл 1-2) и не растут до середины логарифмической (OD 600 = 0,5-0,6).
- Спин 6,4 kxg в течение 10 мин при 4 ° С в JA-20 ротором, и ресуспендируют в 1 мл холодного М2 (табл 1-2) и переноса в 2 мл микроцентрифужных трубки.
- Спин на 15 kxg в течение 3 мин в микроцентрифуге трубки для осаждения клеток, аспирация надосадочную, положить таблетку на льду и ресуспендируют в 900 мкл холодного М2.
- Добавить 900 мкл холодного ПВП покрытием коллоидный диоксид кремния и спина в течение 20 мин при 15 kxg при 4 ° С в микрофонrocentrifuge трубки.
- (Критический) Аспирируйте или пипетки с верхней скитался / predivisional Band сотовый и собирать дно Swarmer группы в новую пробирку микроцентрифужных.
- Промыть Swarmer клеткам два раза в 1 мл холодного М2 в то время центрифугирования при 15 kxg в течение 3 мин.
- До конечного отжима, перемещения клеток в предварительно охлажденный 1 мл стеклянную пробирку и измерить OD 600 клеток по сравнению с заготовкой М2.
- Ресуспендируют осадок клеток окончательного в 28 ° C M2G на OD между 0,3 - 0,4 и встряхивают / рулон клетки при 28 ° С.
Примечание: Типичные выходы от 2 до 4 мл Swarmer клеточной культуре. - Для микроскопии экспериментов, в нужное моменты времени место 1 мкл клеток на агарозном площадку M2G для работы с изображениями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Синхронизация обычно дает две полосы клеток (рис 1б): Swarmer группа, которая имеет более высокую плотность, и преследовал / predivisional Band сотовый низкой плотности. Для обеспечения эффективной синхронизации общие элементы управления включают мониторинг OD 600 и измерения уровней CTRA белка вестерн-блоттинга на различных клеточного цикла временных точках. OD 600 следует увеличить примерно на 2 раза в течение клеточного цикла (рисунок 2). Вестерн-блот для клеточного цикла мастер-регулятора CTRA является полезным управления, чтобы убедиться, хорошее синхронность (рис 2). CTRA используется в Swarmer клетки блокируют репликацию ДНК и ухудшается при начале репликации ДНК 10. CTRA затем синтезируются в конце клеточного цикла и активирует транскрипцию множества генов в развитии, включая многих компонентов жгутика 11,12. Успешно синхронность придется тего колебательный характер содержания белка Ctra.
Рисунок 1. Ячейка цикл Caulobacter crescentus. (А) мультипликационный схематическое изображение Swarmer клеточного цикла. В Swarmer клетки дифференцируются в репликации компетентных стебельчатых клеток втягивания пили, извлечение жгутики и начало репликации ДНК. Круги и тета-структуры, приведенные в внутри клетки контуров представляют покоящиеся и тиражирования хромосом. Клетки затем перейти через клеточного цикла создания единого жгутик в полюсе, противоположном стебля. При разделе, два уникальных типов клеток формируются, репликация блокируется подвижные Swarmer клетки и репликации компетентного стационарного преследовал клетки. (B) Представитель результаты центрифугирования в градиенте плотности. Нижняя плотность преследовал и predivisional клетки плавают в верхней части градиента, а плотно Swarmer клеток в конечном итоге к нижней части трубы. Шкала баров 1 мкм в микроскопии изображений фазы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2. Представитель результаты успешной Swarmer клеток синхронно. Клеточная масса измеряется OD 600 должен медленно увеличиваться и в конечном счете в два раза на протяжении всего анализа. 1 мл аликвоты пипеткой в пластиковых кюветах с большой синхронности клеток и OD 600, измеренного с помощью спектрофотометра в указанных временных точках. Кроме того, клеточный цикл мастер-регулирующий белок CTRA должны присутствовать в клетке Swarmer блокировать репликацию ДНК, с последующим быстрым ухудшениемсовпадает с началом репликации ДНК. CTRA затем регенерируют в конце клеточного цикла, чтобы активировать экспрессию многих генов в развитии в том числе критических жгутиковых и пили компонентов. Вестернблоты для мастер-клеточный цикл регуляторный белок CTRA проводились путем принятия 1 мл аликвоты масштабной синхронно. Клетки ресуспендировали в 250 мкл буфера для образцов Laemmlli в OD 600, разделены на 10% Трис-Gly PAGE, переносили на PVDF и смыл с анти-антителом CTRA. Неудачные процедуры синхронность привести к CTRA западных пятна без изменения уровня белка. α-CTRA антитела 12 инкубировали при разведении 1: 10000 в течение 1,5 ч в 3% молока TBST и промывали 3 раза в TBST. Козье-α-кролика вторичной Затем добавляют в количестве от 1: 10000 разбавления в 3% молока TBST в течение 1 ч, промывали 3 раза TBST и отображается на пленке с использованием набора хемилюминесцентный обнаружения. Пожалуйста,Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой цифры.
| Na 2 HPO 4 | 17,4 г |
| KH 2 PO 4 | 10,6 г |
| NH 4 Cl | 10 г |
| H 2 O | Ресуспендируют в 1 л и автоклав |
Таблица 1. 20X M2 Соли Рецепт.
| 20X M2 Соли | 50 мл | |
| 0,5 М MgSO 4 | 1 мл | |
| 20% Глюкоза | 10 мл | Заменитель H 2 O в М2 |
| Сульфат железа хелат Решение | 1 мл | |
| 0,1 М CaCl 2 | 5 мл | Добавить в прошлом А.В.подъязычная осадков |
| H 2 O | Заполните до 1 л | |
| Стерильный фильтр с размером пор 0,22 мкм фильтр |
Таблица 2. М2 и M2G рецепт.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVP Coated Colloidal Silica (Percoll) | Sigma-Aldrich | P4937 | |
| Colloidal Silica (Ludox AS-40) | Sigma-Aldrich | 420840 | |
| JA10 Rotor | Beckman-Coulter | 369687 | |
| JA20 Rotor | Beckman-Coulter | 334831 | |
| Ferrous Sulfate Chelate Solution | Sigma-Aldrich | F0518 | |
| 30 ml Centrifuge Tubes | Corning | 8445 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-500g |
References
- McAdams, H. H., Shapiro, L. System-level design of bacterial cell cycle control. FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry. J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space. Science. 301, 1874-1877 (2003).
- Ptacin, J. L., Shapiro, L. Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation. Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).
- Evinger, M., Agabian, N. Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells. J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).
- Tsai, J. W., Alley, M. R. Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway. J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).
- Marks, M. E., et al. The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus. J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).
- Ely, B.
- Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division. Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).
- Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).
- Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).
- Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein. Cell. 84, 83-93 (1996).
- Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication. Methods. 48, 8-13 (2009).
- Degnen, S. T., Newton, A. Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus. J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).
- Bates, D., et al. The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle. Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).
- Abel, S., et al. Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle. PLoS Genet. 9, e1003744 (2013).
- Johnson, R. C., Ely, B. Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus. Genetics. 86, 25-32 (1977).
- Britos, L., et al. Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus. PLoS One. 6, e18179 (2011).
- Boutte, C. C., Crosson, S. The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment. Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).
