Introduction
細菌の細胞周期は、ゲノムの複製と娘細胞の分裂の両方を制御する。抗生物質耐性は、公衆の健康に成長している脅威であるとして重要なのは、細菌の細胞周期は、抗生物質開発のための未開発の目標を提示します。
細菌カウロバクターcrescentusでは、各細胞周期の異なる運命（ 図1A）1,2の2つの娘細胞を生じる、非対称分裂に導く。 One娘細胞は鞭毛を継承し、他の娘は茎を継承し、固着されている間運動性である。集積回路の遺伝子は、転写調節、リン酸化シグナル伝達、およびタンパク質分解規制3ことによって、細胞周期の進行および細胞の運命を制御する。また、染色体複製と同時分離は、第4染色体の正確に一つのコピーを含む娘細胞が得られる。重要なことに、これらの2つの細胞型は急速COLLOによって分離することができる高収率（ 図1B）を有する集団の残りからswarmer細胞の単離を可能にする同期可能NA1000株5-7 idalシリカ粒子の密度遠心分離。細胞swarmer分離された後、非対称細胞分裂を通じて同期的に進む。ここでは、詳細プロトコルは、 カウロバクター株 NA1000を同期させるために使用される。私たちは、プロトコルおよび大規模および小規模の両方の同期のための一般的なトラブルシューティングのヒントを提供する。この実験手順は、 カウロバクター細胞周期と細胞の運命の時空間制御を調べるための強力なツールを提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.大規模同期性 - ウエスタンブロット、マイクロアレイ/ RNA-SEQ、およびその他素材集中アッセイに最適
- 冷凍庫ストック又はプレートから、PYE培地で28℃で振とうすることにより歪NA1000の5ミリリットルO / N培養を成長。
- M2Gの25ミリリットル（表1-2）に、ステップ1からの細胞の0.5ミリリットルを接種し、培養が0.5と0.6の間のOD 600に達するまで28℃で振る。
- M2Gの1リットル中に細胞を接種し、28℃で振る。
- OD 600が 0.5〜0.6に達すると、液体取り付けられた位相差顕微鏡を用いて細胞swarmerの存在を確認する。位相差顕微鏡によってスライドガラス上の細胞の1μlを、カバーガラスで覆い、スポット、および画像。人口が急速に泳いで細胞を視覚化することによってswarmer細胞の存在を確認してください。
- JA-10ローターで4℃で7 kxgで15分間細胞をスピン。
- 上清を捨て、冷たいM2（表1-2）の180ミリリットルを加え、穏やかにresは血清学的ピペットを使用してすべてのセルをuspend。緩くペレット化した細胞を捨てる。彼らはpredivisionalとストーカー細胞である。
- 冷たいコロイダルシリカ溶液の60ミリリットルを加え、よく細胞懸濁液を混ぜる（よく細胞に添加する前にコロイダルシリカ懸濁液を混在してください）。
- 8 30ミリリットルチューブに細胞懸濁液を注ぎ、JA-20ローターで、4℃で6.4 kxgで30分間スピン。
注：Oneは、2つの異なるバンドが表示されるはずです。ストーカー/ predivisional細胞は、トップバンド（ 図1B）にいる間swarmer帯は下のバンドである。 - 慎重にトップバンドをオフに吸引し、swarmerバンド（下のバンド）上記〜1 cmの液体を除去する。
- パスツールピペットを用いて（クリティカル）、慎重にswarmerバンドを削除して、清潔なチューブに配置します。 JA-20ローターで、4℃で6.4 kxgで10分間コロイダルシリカ、トップ冷たいM2とチューブオフとスピンを洗い流す。
- 注意深く上清を破棄し、再懸濁JA-20ローターで冷たいM2の20ミリリットルと、4℃で6.4 kxgで10分間スピンのセル。
- コールドM2 30mlの中に全てのペレットを再懸濁し、分光光度計を用いてOD 600を測定し、冷M2培地を用いてブランク。 swarmer細胞を確認するために位相イメージングのための1μLを保存します。細胞90〜95％がswarmersでなければなりません。
- JA-20ローターで、4℃で6.4 kxgで5分間、細胞をスピンダウン。 28℃M2G培地中の細胞を再懸濁A 600になるように、〜0.3〜0.4と28℃で振とうを開始。
注：典型的な収量は30と同期していない細胞の1Lからswarmer細胞培養の60mLの間にある。 - 8,9（野生型の文化が分裂するのに約135〜140分かかります）の時点を取って開始します。各時点で、OD 600を測定する。分割後のOD 600が約2倍初期OD 600であることを確認してください。
- ウェスタンブロットまたは遺伝子発現アッセイのために、立方1mLのアリコートを除去所望の時点でlture、30秒間、卓上遠心分離機において最大速度でスピンダウンし、急速に培地をデカントまたは吸引し、フラッシュは、液体窒素中で細胞ペレットを凍結する。下流の分析まで-80℃で細胞を保管してください。
2.小規模同期性 - 顕微鏡用に最適
- 冷凍庫ストック又はプレートから、M2Gに28℃で振とう5ミリリットルO / N培養を成長。
- M2G（表1-2）15mlに希釈し、中期対数（OD 600 = 0.5〜0.6）になるまで成長する。
- JA-20ローター中で4℃で10分間6.4 kxgでスピンし、1ミリリットル中に再懸濁冷たいM2（表1-2）と2 mlのマイクロ遠心チューブに移す。
- 上清を吸引し、細胞をペレットにマイクロ遠心チューブ中で3分間15 kxgでのスピンは、冷たいM2の900μlの氷の上でペレット、再懸濁を置く。
- マイクで4℃で15 kxgで20分間、コロイダルシリカとスピンコーティングされた冷たいPVP900μlのを追加します。rocentrifugeチューブ。
- （クリティカル）を吸引したり、トップを切っピペット/ predivisional細胞バンドをストーカーして、新しいマイクロ遠心チューブにバンドswarmer底に集める。
- 3分間15 kxgで遠心分離しながら、冷たいM2の1ミリリットル中swarmer細胞を2回洗浄します。
- 最後のスピンの前に、予備冷却した1mlのガラス試験管に細胞を移動し、M2のブランクと比較した細胞のOD 600を測定する。
- 0.4及び28℃/ロール細胞を振る - 0.3の間ODで28℃、M2Gに最終的な細胞ペレットを再懸濁。
注：典型的な収量はswarmer細胞培養の2および4 mlの間である。 - 顕微鏡実験のために、所望の時間にポイントがイメージングのためM2Gアガロースパッド上に細胞を1μLを置く。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
より高い密度を有するswarmerバンド、およびより低い密度のストーカー/ predivisionalセル帯域：同期は、典型的には、セルの二つのバンド（ 図1B）が得られる。効率的な同期を確実にするために共通のコントロールがOD 600を監視し、異なる細胞周期の時点でウエスタンブロットによりCTRAタンパク質のレベルを測定することを含む。 OD 600は、細胞周期（ 図2）の過程で約2倍に増やす必要があります。細胞周期のマスターレギュレーターCTRAためのウェスタンブロットは、良好な同期（ 図2）を確認するための有用な制御である。 CTRAは、DNA複製をブロックするswarmerセルに利用され、DNA複製10の開始時に分解される。 CTRAは、その後、細胞周期における合成し、鞭毛11,12の多くの構成要素を含む発生遺伝子の宿主の転写を活性化する。成功した同期は、Tを持つことになりますCTRAタンパク質レベルの彼の振動パターン。
カウロバクターcrescentusの細胞周期。（A）swarmer細胞周期の漫画の概略図。図 。 swarmer細胞は、線毛を後退させる鞭毛を噴射して、DNA複製を開始することによって複製能力ストーカー細胞に分化する。セルの輪郭の内側に示された円とシータ構造が静止して複製する染色体を表す。次いで、細胞を茎、反対の極で単一の鞭毛を構築する細胞周期を進行。分裂の際、2ユニークな細胞型が生成され、レプリケーションは、（B）密度遠心分離のための代表的な結果。。セルおよび複製能力静止ストーカー細胞swarmer運動性ブロックされて低い密度はストーカーとpredivswarmer密な細胞がチューブの底に向かってしまいながらisional細胞が勾配の上部付近に浮かぶ。スケールバーは、位相差顕微鏡画像内の1程度である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図セル同期swarmer成功2.代表的な結果。OD 600で測定した細胞塊がゆっくり増加し、最終的に検定の過程を通して倍増する必要があります。 1mlアリコートを、大きな細胞同調性と示された時点で分光光度計を用いて測定されたOD 600からプラスチックキュベットにピペットで移した。さらに、CTRA細胞周期のマスター調節タンパク質は、急速な分解に続いて、DNA複製をブロックするswarmer細胞に存在すべきであるDNA複製の開始と一致する。 CTRA次いで、クリティカル鞭毛および線毛成分を含む多くの発生遺伝子の発現を活性化するために、後に細胞周期で再生される。細胞周期のマスター調節タンパク質CTRAのウェスタンブロットは、大規模な同期の1mlアリコートを取ることによって行った。細胞は、OD 600当たり250μlのLaemmlliサンプル緩衝液に再懸濁し、PVDFに移し、10％TRIS-GLY PAGE上で分離し、抗CTRA抗体でブロットした。失敗した同期手順は、タンパク質レベルの変化なしCTRAウェスタンブロットにつながる。 α-CTRA抗体12は、1晩インキュベートした：3％ミルクTBSTで1.5時間10,000希釈し、TBSTで3回洗浄した。ヤギαウサギ二次に1で添加した：。、1時間、3％ミルクTBSTで10,000希釈をTBSTで3回洗浄し、化学発光検出キットを用いてフィルム上に結像してくださいこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
| のNa 2 HPO 4 | 17.4グラム |
| KH 2 PO 4 | 10.6グラム |
| NH 4 Clを | 10グラム |
| H 2 O | 1 L＆オートクレーブ中で再懸濁 |
表1. 20X M2塩レシピ。
| 20X M2塩 | 50ミリリットル | |
| 0.5 M硫酸マグネシウム4 | 1ミリリットル | |
| 20％グルコース | 10ミリリットル | M2におけるH 2 Oの代わりに |
| 硫酸第一鉄のキレート溶液 | 1ミリリットル | |
| 0.1 MのCaCl 2 | 5ミリリットル | AVに最後に追加OID降水 |
| H 2 O | 1 Lまでの塗りつぶし | |
| 0.22μmのフィルターで無菌フィルター |
表2. M2及びM2Gレシピ。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVP Coated Colloidal Silica (Percoll) | Sigma-Aldrich | P4937 | |
| Colloidal Silica (Ludox AS-40) | Sigma-Aldrich | 420840 | |
| JA10 Rotor | Beckman-Coulter | 369687 | |
| JA20 Rotor | Beckman-Coulter | 334831 | |
| Ferrous Sulfate Chelate Solution | Sigma-Aldrich | F0518 | |
| 30 ml Centrifuge Tubes | Corning | 8445 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-500g |
References
- McAdams, H. H., Shapiro, L. System-level design of bacterial cell cycle control. FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry. J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space. Science. 301, 1874-1877 (2003).
- Ptacin, J. L., Shapiro, L. Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation. Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).
- Evinger, M., Agabian, N. Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells. J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).
- Tsai, J. W., Alley, M. R. Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway. J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).
- Marks, M. E., et al. The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus. J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).
- Ely, B.
- Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division. Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).
- Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).
- Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).
- Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein. Cell. 84, 83-93 (1996).
- Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication. Methods. 48, 8-13 (2009).
- Degnen, S. T., Newton, A. Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus. J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).
- Bates, D., et al. The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle. Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).
- Abel, S., et al. Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle. PLoS Genet. 9, e1003744 (2013).
- Johnson, R. C., Ely, B. Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus. Genetics. 86, 25-32 (1977).
- Britos, L., et al. Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus. PLoS One. 6, e18179 (2011).
- Boutte, C. C., Crosson, S. The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment. Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).
