Introduction
박테리아 세포 사이클은 게놈의 복제와 딸 세포 분열의 양을 제어한다. 항생제 내성은 공중 보건에 대한 위협도 갈수록 증가로 중요한 것은, 세균 세포주기 항생제 개발을위한 미개척 목표를 제시한다.
세균 Caulobacter crescentus의, 각 셀은 서로 다른주기 운명 (도 1a)의 1,2- 개의 딸 세포를 수득 비대칭 분할 리드. 한 딸 셀은 편모를 상속하고 다른 딸이 줄기를 상속 고착 동안 운동성이있다. 통합 유전자 회로는 전사 조절, 인산화 신호 전달 및 조절 단백질 분해 (3)에 의한 세포주기 진행과 세포의 운명을 제어합니다. 또한, 염색체 복제 및 동시 분리 수율 딸 세포는 염색체 4의 단 하나의 복사본을 포함하고있다. 중요한 것은, 이러한 두 가지 종류의 세포는 급속 collo 의해 분리 될 수있다높은 수율 (도 1b)와 인구의 나머지 swarmer 세포의 분리를 허용하는 동기화 가능한 균주의 NA1000 5-7 idal 실리카 입자 밀도 원심. 세포 swarmer 절연 한 후 비대칭 세포 분열을 통해 동 기적으로 진행합니다. 여기서 우리는 세부 프로토콜은 Caulobacter 변형 NA1000를 동기화에 사용됩니다. 우리는 프로토콜과의 크고 작은 규모 모두 동기화에 대한 일반적인 문제 해결 팁을 제공합니다. 이 실험 절차는 Caulobacter의 세포주기 및 세포 운명의 시공간 제어를 심문 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다.
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Protocol
1. 대규모의 Synchrony - 웨스턴 블롯 (Western Blot), 마이크로 어레이 / RNA-SEQ 및 기타 재료 집중 분석 실험을위한 최적
- 냉동 주식이나 접시에서 PYE 매체에서 28 ° C에서 흔들어 변형 NA1000의 5 ML의 O / N 문화를 성장.
- M2G 25 ㎖ (표 1-2)에서 1 단계의 세포 0.5 ㎖를 접종하고, 문화는 0.5과 0.6 사이의 OD (600)에 도달 할 때까지 28 ° C에서 흔들.
- M2G 1 L로 세포를 접종하고 28 ° C에서 흔들.
- OD 600 0.6 0.5에 도달하면, 액체 장착 위상 현미경을 사용하여 세포 swarmer의 존재를 확인한다. 위상 현미경 유리 슬라이드에 세포의 1 μL가, 커버 슬립 커버 스팟 및 이미지. 인구 급속 수영 세포를 시각화하여 swarmer 세포의 존재를 확인한다.
- JA-10 회에서 4 ° C에서 7 kxg에서 15 분 동안 세포를 스핀.
- 뜨는을 취소하고 차가운 M2의 180 ml에 추가 (표 1-2)와 부드럽게 입술혈청 학적 피펫을 사용하여 모든 세포 uspend. 느슨하게 펠렛 세포를 폐기; 그들은 predivisional 및 스토킹 세포이다.
- 차가운 콜로 이달 실리카 용액 60ml를 추가하고 잘 세포 현탁액을 혼합 (물론 셀에 추가하기 전에 콜로 이달 실리카 현탁액을 혼합해야합니다).
- 여덟 30 ml의 튜브에 세포 현탁액을 붓고 JA-20 회에서 4 ° C에서 6.4 kxg에서 30 분 동안 회전.
참고 : 하나는 두 가지 밴드를 참조한다 스토킹 / predivisional 세포 TOP 밴드 (도 1b)에있는 동안 swarmer 대역 하위 밴드이다. - 조심스럽게 꺼 상단 밴드를 대기음 swarmer 밴드 (낮은 밴드) 위 ~ 1cm로 액체를 제거합니다.
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 (긴급),주의 깊게 swarmer 밴드를 제거하고 깨끗한 튜브에 배치합니다. JA-20 회에서 4 ° C에서 6.4 kxg에서 10 분 동안 콜로 이달 실리카, 최고 추위 M2와 튜브 오프 스핀을 씻어합니다.
- 조심스럽게 상층 액을 제거하고를 재현 탁20 차가운 M2 ml의 JA-20 회에서 4 ° C에서 6.4 kxg에서 10 분 동안 스핀 세포.
- 감기 M2의 30 ㎖ 중에 모든 펠릿을 재현 탁하고, 분광 광도계를 사용하여 OD (600)을 측정하고 차가운 M2 매체를 이용하여 빈. 세포 swarmer 확인하기 위해 위상 영상 1 μl를 저장; 세포 90-95 %가 swarmers해야한다.
- JA-20 회에서 4 ° C에서 6.4 kxg에서 5 분 동안 세포를 스핀 다운. 28 ° C M2G 매체에 재현 탁 세포 600 ~ 0.3-0.4, 28 ℃에서 진탕 시작되도록.
참고 : 일반적인 수익률은 30 동기화되지 않은 세포의 1L에서 swarmer 세포 배양의 60ML 사이. - 시점 (야생형 문화를 나누는 약 135-140분 소요됩니다) 8,9를 복용 시작합니다. 각 시점에서, OD (600)을 측정한다. 분할 후 OD (600)는 약 2 배의 초기 OD 600 있는지 확인합니다.
- 웨스턴 블롯 또는 유전자 발현 분석을 위해, 용돈의 1 ㎖ 씩 제거원하는 시점에 lture는, 빠르게, 30 초 동안 탁상 원심 분리기에서 최대 속도로 스핀 다운 가만히 따르다 또는 매체를 대기음, 플래시는 액체 질소에서 세포 펠렛을 동결. 다운 스트림 분석 할 때까지 -80 ° C에서 세포를 저장합니다.
2. 작은 규모의 Synchrony - 현미경을위한 최적
- 냉동 주식이나 접시에서 5 ML의 O / N 문화 M2G 28 ° C에서 진탕 성장한다.
- M2G 15 ㎖ (표 1-2)에 희석 중반 로그 (OD = 0.5 ~ 0.6 600)까지 성장한다.
- 1 ml의 차가운 M2 (표 1-2)과 2 ML의 microcentrifuge 관에 전송에서 JA-20 회에서 4 ° C에서 10 분 6.4 kxg에 스핀, 그리고에 resuspend.
- 뜨는을 대기음, 펠릿 세포 microcentrifuge 관에서 3 분 15 kxg에 스핀, 감기 M2의 900 μL에 얼음에 펠릿 및 재현 탁했습니다.
- 마이크에서 4 ° C에서 15 kxg에서 20 분 동안 콜로 이달 실리카 스핀 코팅 감기 PVP의 900 μl를 추가rocentrifuge 튜브.
- (긴급) 대기음은 최고에게 스토킹 / predivisional 세포 밴드를 피펫하고 새로운 microcentrifuge 관에 밴드 swarmer 바닥을 수집하거나.
- 3 분 15 kxg에서 원심 분리 동안 감기 M2의 1 ml의 swarmer 세포를 두 번 씻으십시오.
- 최종 스핀 앞서, 냉장 1ml의 유리 시험관에 세포 이동 및 M2의 블랭크에 비해 셀 OD (600)을 측정한다.
- 0.3 사이의 OD에서 28 ° C M2G에 최종 세포 펠렛을 재현 탁 - 0.4, 28 ℃에서 / 롤 세포를 흔들어.
참고 : 일반적인 수익률이 swarmer 세포 배양의 2 내지 4 ml의입니다. - 이미징을위한 M2G 아가로 오스 패드 상에 세포의 원하는 시점 장소 1 μL에서 현미경 실험하십시오.
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Representative Results
높은 밀도가 swarmer 밴드, 낮은 밀도의 스토킹 / predivisional 세포 밴드 : 동기화는 일반적으로 세포의 두 밴드 (그림 1B)를 산출한다. 효율적인 동기화 공통 컨트롤 OD 600를 모니터링하고 뚜렷한 세포주기 시점에서 웨스턴 블롯 CTRA 단백질의 수준을 측정 포함되도록한다. OD (600)는 세포주기의 과정 (도 2) 동안 약 2 배 증가한다. 세포주기 마스터 레귤레이터 CTRA 대한 웨스턴 블롯 좋은 공시성 (도 2)을 확인하는 유용한 제어이다. CTRA은 DNA 복제를 차단하는 swarmer 셀에서 이용되고, DNA 복제 (10)의 개시시에 열화된다. CTRA는 나중에 세포주기에서 합성 한 11,12 및 편모의 많은 구성 요소들을 포함하는 유전자의 발달 숙주의 전사를 활성화한다. 성공적인 동시성은 t을해야합니다CTRA 단백질 수준 그의 진동 패턴.
도 1의 Caulobacter crescentus의 세포주기. (A) swarmer 세포주기의 만화 개략도. swarmer 세포는, 필리 후퇴 편모를 토출하고, DNA 복제를 개시함으로써 스토킹 식성 세포로 분화. 원과 세포 윤곽 내부에 표시 세타 구조는 정지 및 복제 염색체를 나타냅니다. 세포는 줄기 반대 극에서 단일 건물 편모 세포주기를 통해 진행. 분할시, 두 개의 독특한 종류의 세포가 생성, 복제 (B) 밀도 원심 분리를위한 대표 결과.. 세포와 복제 능력이 고정 스토킹 세포 swarmer 운동성이 차단 낮은 밀도는 스토킹과 prediv세포 swarmer 밀도가 튜브의 아래쪽으로 끝날 동안 isional 세포는 그라데이션의 상단에 떠. 스케일 바는 위상 현미경 이미지에서 1 ㎛이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 셀 공시성 swarmer 성공적인 2. 대표 결과. OD 600에 의해 측정 된 세포 덩어리는 서서히 증가하고 궁극적 분석의 과정을 통해 두 배로한다. 1ml의 분취 량을 큰 셀과 공시성 표시된 시점에서 분광 광도계를 사용하여 측정 OD 600에서 플라스틱 큐벳에 피펫 하였다. 또한 CTRA 세포주기 조절 단백질은 마스터 분해성이어서 DNA 복제를 차단하는 swarmer 셀에 존재해야DNA 복제의 개시와 일치한다. CTRA는 다음 중요한 편모와 필리 구성 요소를 포함하여 많은 발달 유전자의 발현을 활성화 나중에 세포주기에서 생성됩니다. 세포주기 조절 단백질 마스터 CTRA 웨스턴 블롯 대규모 공시성 1 ml의 분취 량을 취함으로써 수행 하였다. 세포를 PVDF로 옮겨 10 % TRIS-GLY 페이지상에서 분리, OD (600) 당 250 μL로 Laemmlli 시료 완충액에 재현 탁하고, 안티 CTRA 항체로 블 롯팅 하였다. 실패 동시성 절차는 단백질 수준에서의 변화없이 CTRA 서부 말로 이어집니다. α-CTRA 항체 (12)는 1에서 배양 하였다 : 3 % 우유 TBST에서 1.5 시간 동안 10,000 희석 및 TBST로 3 회 세척 하였다. 염소 - 토끼 α-후 1 차 첨가 하였다 :. 1 시간 동안 10,000 희석 3 % 우유 TBST는 TBST로 3 회 세척하고, 화학 발광 검출 키트를 사용하여 필름 상에 이미징 주십시오이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 나 2 HPO 4 | 17.4 g |
| KH 2 PO 4 | 10.6 g |
| NH 4 CL | 10g |
| H 2 O | 1 L & 오토 클레이브에 재현 탁 |
표 1. 20 배 M2 소금 레시피.
| 20X M2 염 | 50 ㎖ | |
| 0.5 M 황산 | 1 ml의 | |
| 20 % 포도당 | 10 ml의 | M2에서 H 2 O로 대체 |
| 황산 철 킬레이트 솔루션 | 1 ml의 | |
| 0.1 M CaCl2를 | 5 ml의 | AV로 마지막 추가OID 침전 |
| H 2 O | 1 L에 채워 | |
| 0.22 μm의 필터와 살균 필터 |
표 2. M2 및 M2G 레시피.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVP Coated Colloidal Silica (Percoll) | Sigma-Aldrich | P4937 | |
| Colloidal Silica (Ludox AS-40) | Sigma-Aldrich | 420840 | |
| JA10 Rotor | Beckman-Coulter | 369687 | |
| JA20 Rotor | Beckman-Coulter | 334831 | |
| Ferrous Sulfate Chelate Solution | Sigma-Aldrich | F0518 | |
| 30 ml Centrifuge Tubes | Corning | 8445 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-500g |
References
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