Introduction
बैक्टीरिया कोशिका चक्र जीनोम की प्रतिकृति और बेटी कोशिकाओं के विभाजन के दोनों नियंत्रित करता है। एंटीबायोटिक प्रतिरोध सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए खतरा बढ़ रहा है के रूप में महत्वपूर्ण, बैक्टीरिया कोशिका चक्र एंटीबायोटिक के विकास के लिए एक अप्रयुक्त लक्ष्य प्रस्तुत करता है।
जीवाणु Caulobacter crescentus में, प्रत्येक कोशिका चक्र अलग भाग्य (चित्रा 1 ए) 1,2 के दो बेटी कोशिकाओं से बेदखल, एक असममित प्रभाग की ओर जाता है। एक बेटी सेल एक कशाभिका संभालते हैं और दूसरी बेटी एक डंठल संभालते हैं और बिना डंठल है, जबकि गतिशील है। एक एकीकृत आनुवंशिक सर्किट ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन, phospho-संकेतन, और विनियमित प्रोटियोलिसिस 3 द्वारा कोशिका चक्र प्रगति और सेल भाग्य को नियंत्रित करता है। इसके अलावा, गुणसूत्र प्रतिकृति और समवर्ती अलगाव उपज बेटी कोशिकाओं गुणसूत्र 4 के ठीक एक प्रतिलिपि होते हैं। महत्वपूर्ण बात है, इन दो प्रकार की कोशिकाओं में तेजी से collo के द्वारा अलग किया जा सकता हैउच्च पैदावार (चित्रा 1 बी) के साथ जनसंख्या के बाकी हिस्सों से swarmer कोशिकाओं के अलगाव की इजाजत दी synchronizable NA1000 तनाव 5-7 में IDAL सिलिका के कण घनत्व centrifugation। कोशिकाओं swarmer पृथक तो असममित कोशिका विभाजन के माध्यम से तुल्यकालिक आगे बढ़ें। यहाँ, हम विस्तार प्रोटोकॉल Caulobacter तनाव NA1000 सिंक्रनाइज़ करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हम प्रोटोकॉल और बड़े और छोटे पैमाने पर दोनों सिंक्रनाइज़ेशंस के लिए आम समस्या निवारण युक्तियों प्रदान करते हैं। इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया Caulobacter सेल चक्र और सेल भाग्य के spatiotemporal नियंत्रण से पूछताछ करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है।
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Protocol
1. बड़े पैमाने पर synchrony - वेस्टर्न ब्लाट, माइक्रोएरे / आरएनए Seq, और अन्य सामग्री गहन Assays के लिए इष्टतम
- एक फ्रीजर शेयर या एक थाली से, दोग़ला माध्यम में 28 डिग्री सेल्सियस पर झटकों से तनाव NA1000 के 5 मिलीलीटर हे / एन संस्कृति बढ़ता है।
- M2G के 25 एमएल (टेबल्स 1-2) में चरण 1 से कोशिकाओं के 0.5 मिलीलीटर टीका लगाना और संस्कृति 0.5 और 0.6 के बीच एक आयुध डिपो 600 तक पहुँच जाता है, जब तक 28 डिग्री सेल्सियस पर हिला।
- M2G की एक एल में कोशिकाओं टीका लगाना और 28 डिग्री सेल्सियस पर हिला।
- आयुध डिपो 600 0.5-0.6 में पहुँचता है, तरल घुड़सवार चरण माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं swarmer की उपस्थिति की पुष्टि। चरण माइक्रोस्कोपी द्वारा एक गिलास स्लाइड पर कोशिकाओं के एक μl, एक कवर पर्ची के साथ कवर जगह है, और छवि। जनसंख्या में तेजी से तैर कोशिकाओं visualizing द्वारा swarmer कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करें।
- एक जावेद-10 रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर सात kxg पर 15 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन।
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ठंड M2 के 180 मिलीलीटर जोड़ने (टेबल्स 1-2) और धीरे रेसएक सीरम वैज्ञानिक pipet का उपयोग सभी कोशिकाओं uspend। शिथिल pelleted कोशिकाओं त्यागें; वे predivisional और पीछा कोशिकाओं रहे हैं।
- ठंड कोलाइडयन सिलिका समाधान के 60 मिलीलीटर जोड़ें और अच्छी तरह से सेल निलंबन मिश्रण (अच्छी तरह से कोशिकाओं को जोड़ने से पहले कोलाइडयन सिलिका निलंबन मिश्रण करने के लिए सुनिश्चित करें)।
- आठ से 30 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन डालो और एक जावेद-20 रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 6.4 kxg पर 30 मिनट के लिए स्पिन।
नोट: एक दो अलग-अलग बैंड देखना चाहिए; पीछा / predivisional कोशिकाओं शीर्ष बैंड (चित्रा 1 बी) में हैं, जबकि swarmer बैंड के निचले बैंड है। - ध्यान से बंद शीर्ष बैंड महाप्राण और swarmer बैंड (कम बैंड) के ऊपर ~ 1 सेमी करने के लिए तरल हटा दें।
- पाश्चर pipet का प्रयोग (महत्वपूर्ण), ध्यान से swarmer बैंड को हटाने और एक स्वच्छ ट्यूब में जगह है। एक जावेद-20 रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 6.4 kxg पर 10 मिनट के लिए कोलाइडयन सिलिका, शीर्ष ठंड M2 के साथ ट्यूब बंद और स्पिन दूर धोने के लिए।
- ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें और resuspend20 ठंड M2 के मिलीलीटर और एक जावेद-20 रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 6.4 kxg पर 10 मिनट के लिए स्पिन में कोशिकाओं।
- ठंड M2 के 30 मिलीलीटर में सभी छर्रों Resuspend और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर 600 आयुध डिपो को मापने और ठंड M2 के माध्यम का उपयोग कर खाली। कोशिकाओं swarmer के लिए जाँच करने के लिए चरण इमेजिंग के लिए एक μl सहेजें; कोशिकाओं के 90-95% swarmers होना चाहिए।
- एक जावेद-20 रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 6.4 kxg पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं नीचे स्पिन। 28 डिग्री सेल्सियस M2G मध्यम में Resuspend कोशिकाओं को एक 600 ~ 0.3-0.4 और 28 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए शुरू इतना है कि।
नोट: विशिष्ट पैदावार 30 और अनसिंक्रनाइज़्ड कोशिकाओं के 1L से swarmer सेल संस्कृति के 60ml के बीच हैं। - समय अंक (जंगली प्रकार संस्कृति को विभाजित करने के लिए लगभग 135-140 मिनट लग जाएगा) 8,9 लेने शुरू। हर समय बिंदु पर, 600 आयुध डिपो को मापने। विभाजन के बाद 600 आयुध डिपो लगभग 2X प्रारंभिक 600 आयुध डिपो है कि जाँच करें।
- पश्चिमी धब्बा या जीन अभिव्यक्ति assays के लिए, घन के 1ml aliquots को दूरवांछित समय बिंदुओं पर lture, तेजी, 30 सेकंड के लिए एक tabletop अपकेंद्रित्र में अधिकतम गति से नीचे स्पिन छानना या मध्यम महाप्राण, और फ्लैश तरल नाइट्रोजन में सेल गोली फ्रीज। बहाव के विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल की दुकान।
2. छोटे पैमाने पर synchrony - माइक्रोस्कोपी के लिए इष्टतम
- एक फ्रीजर शेयर या एक थाली से, एक 5 मिलीलीटर हे / एन संस्कृति M2G में 28 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए बड़े होते हैं।
- M2G के 15 मिलीलीटर (टेबल्स 1-2) में पतला और मध्य प्रवेश (आयुध डिपो = 0.5-0.6 600) जब तक बढ़ता है।
- 1 मिलीलीटर ठंड m2 (टेबल्स 1-2) और एक 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण में एक जावेद-20 रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6.4 kxg पर स्पिन, और resuspend।
- सतह पर तैरनेवाला बंद महाप्राण, गोली कोशिकाओं के लिए एक microcentrifuge ट्यूब में 3 मिनट के लिए 15 kxg पर स्पिन, ठंड M2 के 900 μl में बर्फ पर गोली, और resuspend डाल दिया।
- एक mic में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 kxg पर 20 मिनट के लिए कोलाइडयन सिलिका और स्पिन लेपित ठंड पीवीपी के 900 μl जोड़ेंrocentrifuge ट्यूब।
- (महत्वपूर्ण) महाप्राण शीर्ष पीछा / predivisional सेल बैंड बंद pipet और एक नया microcentrifuge ट्यूब में बैंड swarmer नीचे इकट्ठा या।
- 3 मिनट के लिए 15 kxg पर centrifuging जबकि ठंड M2 के एक मिलीलीटर में swarmer कोशिकाओं दो बार धोएं।
- अंतिम स्पिन से पहले, एक पूर्व ठंडा 1 मिलीलीटर कांच टेस्ट ट्यूब में कोशिकाओं को स्थानांतरित और M2 के एक खाली की तुलना में कोशिकाओं के 600 आयुध डिपो को मापने।
- 0.3 के बीच एक आयुध डिपो में 28 डिग्री सेल्सियस M2G में अंतिम सेल गोली Resuspend - 0.4 और 28 डिग्री सेल्सियस पर / रोल कोशिकाओं हिला।
नोट: विशिष्ट पैदावार swarmer सेल संस्कृति के बीच 2 और 4 मिलीलीटर हैं। - इमेजिंग के लिए एक M2G agarose पैड पर कोशिकाओं के वांछित समय बिंदुओं जगह एक μl में माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए।
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Representative Results
एक उच्च घनत्व है जो swarmer बैंड, और कम घनत्व की एक पीछा / predivisional सेल बैंड: तुल्यकालन आम तौर पर कोशिकाओं के दो बैंड (चित्रा 1 बी) अर्जित करता है। कुशल तुल्यकालन आम नियंत्रण आयुध डिपो के 600, निगरानी और अलग सेल चक्र समय बिंदुओं पर पश्चिमी धब्बा द्वारा CtrA प्रोटीन के स्तर को मापने शामिल हैं सुनिश्चित करने के लिए। आयुध डिपो के 600 सेल चक्र के कोर्स (चित्रा 2) के दौरान लगभग दो गुना से वृद्धि करनी चाहिए। सेल चक्र मास्टर नियामक CtrA के लिए पश्चिमी धब्बा एक अच्छा synchrony (चित्रा 2) को सत्यापित करने के लिए एक उपयोगी नियंत्रण है। CtrA डीएनए प्रतिकृति ब्लॉक करने के लिए swarmer सेल में उपयोग किया जाता है और डीएनए प्रतिकृति 10 के शुरू होने पर अपमानित किया जाता है। CtrA फिर बाद में सेल चक्र में संश्लेषित और कशाभिका 11,12 के कई घटकों सहित विकासात्मक जीनों के एक मेजबान के प्रतिलेखन सक्रिय हो जाता है। एक सफल synchrony टी होगाCtrA प्रोटीन के स्तर के बारे में उनकी oscillating के पैटर्न।
चित्रा 1. Caulobacter crescentus की कोशिका चक्र। (ए) swarmer सेल चक्र का एक कार्टून योजनाबद्ध। swarmer कोशिकाओं, पिली retracting flagella बाहर खदेड़ना, और डीएनए प्रतिकृति शुरू करके प्रतिकृति सक्षम पीछा कोशिकाओं में अंतर। हलकों और सेल की रूपरेखा के अंदर दिखाया थीटा संरचनाओं मौन और नकल गुणसूत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं। कोशिकाओं तो डंठल विपरीत ध्रुव पर एक भी कशाभिका इमारत सेल चक्र के माध्यम से प्रगति। विभाजन पर, दो अनूठे प्रकार की कोशिकाओं उत्पन्न कर रहे हैं, एक प्रतिकृति (बी) के घनत्व centrifugation के लिए प्रतिनिधि का परिणाम है।। सेल और एक प्रतिकृति सक्षम स्थिर पीछा सेल swarmer गतिशील अवरुद्ध कर कम घनत्व पीछा किया और predivकोशिकाओं swarmer घने ट्यूब के नीचे की ओर खत्म होता है, जबकि isional कोशिकाओं ढाल के शीर्ष के निकट तैरने लगते हैं। स्केल सलाखों चरण माइक्रोस्कोपी छवियों में एक माइक्रोन कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा सेल synchrony swarmer एक सफल के लिए 2. प्रतिनिधि परिणाम है। आयुध डिपो के 600 से मापा सेल जन धीरे-धीरे बढ़ाने के लिए और अंततः परख के पाठ्यक्रम में डबल चाहिए। 1 मिलीलीटर aliquots एक बड़ी सेल synchrony और संकेत समय बिंदुओं पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मापा आयुध डिपो के 600 से प्लास्टिक cuvettes में pipetted थे। इसके अतिरिक्त, CtrA सेल चक्र मास्टर विनियामक प्रोटीन एक तीव्र गिरावट के द्वारा पीछा डीएनए प्रतिकृति, ब्लॉक करने के लिए swarmer सेल में मौजूद होना चाहिएडीएनए प्रतिकृति की दीक्षा के साथ संपाती। CtrA तो महत्वपूर्ण कशाभ और पिली घटकों सहित कई विकासात्मक जीनों की अभिव्यक्ति को सक्रिय करने के लिए बाद में सेल चक्र में पुनर्जीवित कर रहा है। सेल चक्र मास्टर विनियामक प्रोटीन CtrA के लिए पश्चिमी blots एक बड़े पैमाने पर synchrony के एक मिलीलीटर aliquots लेने के द्वारा प्रदर्शन किया गया। कोशिकाओं PVDF को हस्तांतरित एक 10% Tris-Gly पृष्ठ पर अलग, आयुध डिपो 600 प्रति 250 μl में Laemmlli नमूना बफर resuspended, और विरोधी CtrA एंटीबॉडी के साथ मिट गया। असफ़ल synchrony प्रक्रियाओं प्रोटीन के स्तर में कोई परिवर्तन नहीं के साथ CtrA पश्चिमी blots पैदा होती हैं। α-CtrA एंटीबॉडी 12 एक एक पर incubated था: 3% दूध TBST में 1.5 घंटे के लिए 10,000 कमजोर पड़ने और TBST में तीन बार धोया। बकरी-α-खरगोश तो एक में जोड़ा गया था माध्यमिक:। 1 घंटे के लिए 10,000 कमजोर पड़ने 3 में% दूध TBST, TBST के साथ तीन बार धोया, और एक chemiluminescent पता लगाने किट का उपयोग कर फिल्म पर imaged करेंइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| ना 2 HPO 4 | 17.4 जी |
| के.एच. 2 पीओ 4 | 10.6 जी |
| एनएच 4 सीएल | 10 ग्राम |
| एच 2 ओ | 1 एल एंड आटोक्लेव में Resuspend |
तालिका 1 20X M2 के साल्ट पकाने की विधि।
| 20X M2 के साल्ट | 50 मिलीलीटर | |
| 0.5 एम MgSO 4 | 1 मिलीलीटर | |
| 20% ग्लूकोज | 10 मिलीलीटर | M2 में एच 2 ओ के लिए विकल्प |
| फैरस सल्फेट Chelate समाधान | 1 मिलीलीटर | |
| 0.1 एम 2 CaCl | 5 मिलीलीटर | ए वी के लिए पिछले जोड़ेंOID तेज़ी |
| एच 2 ओ | 1 एल को भरें | |
| 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ बाँझ फिल्टर |
तालिका 2 M2 और M2G नुस्खा है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVP Coated Colloidal Silica (Percoll) | Sigma-Aldrich | P4937 | |
| Colloidal Silica (Ludox AS-40) | Sigma-Aldrich | 420840 | |
| JA10 Rotor | Beckman-Coulter | 369687 | |
| JA20 Rotor | Beckman-Coulter | 334831 | |
| Ferrous Sulfate Chelate Solution | Sigma-Aldrich | F0518 | |
| 30 ml Centrifuge Tubes | Corning | 8445 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-500g |
References
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