Introduction
bakteriyel hücre döngüsü genomunun çoğaltma ve kızı hücrelerinin bölünmesini kontrol eder. Antibiyotik direnci halk sağlığı için büyüyen bir tehdit olarak önemlisi, bakteri hücre döngüsü antibiyotik gelişimi için bir hedef kullanılmayan sunuyor.
Bakteri Caulobacter crescentus, her bir hücre döngüsü Farklı kaderi (Şekil 1A) 1,2 iki kız hücre sağlar, asimetrik bölünmesi yol açar. Bir yavru hücre, bir kamçı miras ve diğer kızı sap miras ve sapsız ise hareketlidir. Entegre devre genetik transkripsiyon regülasyonu, fosfor-sinyalizasyon ve düzenlenmiş proteoliz 3 hücre döngüsü ilerlemesini ve hücre kaderi kontrol eder. Buna ek olarak, kromozom replikasyonu ve eşzamanlı ayrımcılık verim kızı hücreleri kromozom 4 tam bir kopyasını içeren. Önemli bir şekilde, bu iki hücre tipi hızla collo ile ayrılabiliryüksek verim (Şekil 1B) ile nüfusun geri kalanından swarmer hücrelerinin izolasyonu sağlayan synchronizable NA1000 suşu 5-7 idal silika parçacık yoğunluğu santrifüj. Hücrelerin swarmer İzole sonra asimetrik hücre bölünmesi yoluyla eşzamanlı devam edin. Burada, biz detay protokolü Caulobacter suşu NA1000 senkronize etmek için kullanılır. Biz protokolleri ve büyük ve küçük ölçekli her iki eşitleme için ortak sorun giderme ipuçları sağlar. Bu deneysel prosedür Caulobacter hücre döngüsü ve hücre kaderinin kontrolünü zamanmekansal sorgulamak için güçlü bir araç sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Büyük ölçekli Synchrony - Western Blot, Mikroarray / RNA-Sek, ve Diğer Malzeme Yoğun Tahliller için optimal
- Bir dondurucu stok veya bir plaktan, pye ortamı içinde 28 ° C'de çalkalama ile streyn NA1000 5 ml'lik bir O / N kültürünün yetiştirilmesi.
- M2g 25 ml (Tablo 1-2) 'de, adım 1 hücreleri, 0.5 ml inoküle ve Kültür 0.5 ve 0.6 arasında bir OD 600 ulaşıncaya kadar 28 ° C' de çalkalanır.
- M2g 1 L hücreleri ile inoküle ve 28 ° C de çalkalanır.
- OD 600 0,5-0,6 ulaştığında, sıvı monte faz mikroskobu kullanarak hücrelerin swarmer varlığını doğrulamaktadır. Faz mikroskobu ile bir cam slayt üzerinde hücrelerin 1 ul, bir kapak kayma ile kapak Noktası, ve görüntü. Nüfusun hızla yüzme hücrelerin görselleştirerek swarmer hücrelerinin varlığını doğrulamak.
- JA-10 rotor içinde 4 ° C'de 7 KXG 15 dakika boyunca hücreler dönerler.
- Süpernatantı atın ve soğuk M2 180 ml ekleyin (Tablo 1-2) ve yavaşça resserolojik bir pipet kullanılarak tüm hücreleri uspend. Gevşek pelet hücreleri atın; bunlar predivisional ve saplı hücrelerdir.
- Soğuk Kolloidal silika çözeltisi 60 ml ekleyin ve iyice karıştırın hücre süspansiyonu (iyi hücrelere eklemeden önce Kolloidal silika süspansiyonu karıştırmak için emin olun).
- Sekiz 30 ml tüpler içinde hücre süspansiyonu dökün ve bir JA-20 rotor içinde 4 ° C'de 6.4 KXG C'de 30 dakika boyunca dönerler.
NOT: Bir iki ayrı bantları görmelisiniz; saplı / predivisional hücreler üst bant (Şekil 1B) iken swarmer bant alt grubudur. - Dikkatle kapalı üst bandı aspire ve swarmer bant (alt bant) Yukarıda ~ 1 cm sıvıyı çıkarmak.
- Pasteur pipeti kullanarak (Kritik), dikkatlice swarmer bandı çıkarın ve temiz bir tüpe yerleştirin. JA-20 rotor içinde 4 ° C'de 6.4 KXG 10 dakika boyunca koloidal silis, iyi soğuk M2 ile tüp kapalı ve spin aşındırmak için.
- Dikkatle süpernatant atmak ve tekrar süspansiyon20 soğuk M2 ml JA-20 rotor içinde 4 ° C'de 6.4 KXG 10 dakika boyunca bir dönüş hücreler.
- Soğuk M2 30 ml içine tüm pelet yeniden süspanse ve bir spektrofotometre kullanılarak OD 600 ölçmek ve soğuk M2 ortamı kullanarak boş. Hücreler swarmer kontrol etmek için faz görüntüleme için 1 ul kaydedin; Hücrelerin% 90-95 diğer canlılar olmalıdır.
- JA-20 rotor içinde 4 ° C'de 6.4 KXG 5 dakika boyunca hücreler dönerler. 28 ° C M2G ortam içinde yeniden süspanse edilen hücreler, 600 ~ 0.3-0.4 ve 28 ° C'de çalkalanarak başlar, böylece.
NOT: Tipik verimler 30 ve eşitlenmemiş hücrelerin 1L den swarmer hücre kültürü 60ml arasındadır. - Zaman noktaları (vahşi tip kültür bölmek için yaklaşık 135-140 dakika sürecektir) 8,9 alarak başlayın. Her zaman noktasında, OD 600 ölçer. Bölünmeden sonra OD 600 yaklaşık 2X başlangıç OD 600 olduğunu kontrol edin.
- Western blot ya da gen sentezleme tahlilleri için, cu 1 ml alikotları kaldırmaİstenen zaman noktalarında lture, hızlı bir şekilde 30 saniye için bir masa üstü santrifüjü içinde maksimum hızda aşağı spin süzün veya orta havalandırın, ve sıvı nitrojen içinde hücre pelletini dondurma. Alt baş analiz edilinceye kadar -80 ° C'de hücreler saklayın.
2. Küçük ölçekli Synchrony - Mikroskopi için Optimal
- Bir dondurucu stok veya bir plaktan, 5 ml'lik bir O / N kültür m2g 28 ° C'de çalkalanarak büyür.
- M2G 15 ml (Tablo 1-2) sulandırmak ve orta-log (OD = 0.5-0.6 600) kadar büyür.
- 1 ml soğuk M2 (Tablo 1-2) ve 2 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpüne transfer JA-20 rotor içinde 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6.4 KXG dönerler ve süspansiyon haline getirin.
- Süpernatantı aspire, hücreler topak haline getirilip, bir mikrosantrifüj tüpü içinde, 3 dakika için 15 KXG Spin soğuk M2 900 ul buz üzerinde pelet ve tekrar süspansiyon koydu.
- Bir mikrofon 4 ° C'de 15 KXG C'de 20 dakika koloidal silis ve spin kaplama soğuk PVP 900 ul eklerocentrifuge tüp.
- (Kritik) aspire garnitürü saplı / predivisional hücre bandı kapalı pipetlemeyin ve yeni bir mikrosantrifüj tüp içine bant swarmer alt toplamak veya.
- 3 dakika boyunca 15 KXG santrifüj edilirken, M2, 1 ml swarmer hücreler iki kez yıkayın.
- Son sıkma önce, önceden soğutulmuş bir 1 ml'lik bir cam deney tüpü içine hücreleri taşımak ve M2 bir boşluk ile karşılaştırıldığında hücrelerin OD 600 ölçer.
- 0,3 arasında bir OD 28 ° C M2G içine son hücre pelletini - 0.4 ve 28 ° C'de / rulo hücreleri sallayın.
Not: Tipik verimler swarmer hücre kültürünün 2 ila 4 ml dir. - Görüntüleme için bir M2G agaroz ped üzerine hücrelerin istenilen zaman noktaları yer 1 ul mikroskopi deneyleri için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Daha yüksek bir yoğunluğa sahip swarmer bandı, ve daha düşük yoğunluklu bir saplı / predivisional hücre bandı: eşitleme genellikle hücrelerin iki bant (Şekil 1B) verir. Etkili bir senkronizasyon ortak kontrol OD 600 izleme ve farklı hücre döngüsü zaman noktalarında western blot ile CtrA'nın protein seviyelerinin ölçülmesi dahildir sağlamak. OD 600, hücre döngüsü sırasında (Şekil 2) boyunca, yaklaşık 2 kat artış gerekir. hücre döngüsü ana regülatör CtrA'nın için batı leke iyi senkronizasyonunu (Şekil 2) doğrulamak için yararlı bir kontroldür. CtrA'nın DNA replikasyonunu bloke etme swarmer hücre kullanılmaktadır ve DNA replikasyonu 10 başlamasından sonra düşer. CtrA'nın daha sonra hücre döngüsünün sentezlenmiş ve flagellum'un 11,12 birçok bileşenleri de dahil olmak üzere gelişme genlerin bir ev sahibi transkripsiyonunu aktive eder. Başarılı bir senkronizasyonu t olacaktırCtrA'nın protein seviyelerinin onun salınım düzeni.
Şekil 1. Caulobacter crescentus hücre döngüsü (A). Swarmer hücre döngüsünün bir çizgi şematik. swarmer hücreleri, pili geri çekilmesi flagella çıkarılması ve DNA replikasyonunu başlatan olarak replikasyon yapabilen bir saplı hücreleri içinde farklılık gösterir. çevreler ve hücre hatları içinde gösterilen teta yapılar sakin ve kopyalayan kromozom temsil eder. Hücreler daha sonra sap zıt kutbunda tek kamçılı bina, hücre döngüsü yoluyla ilerleme. Bölünme üzerine, iki eşsiz hücre tipleri üretilir, bir çoğaltma (B) yoğunluk santrifüj için Temsilcisi sonuçları.. Hücre ve bir çoğaltma yetkili sabit saplı hücrenin swarmer hareketli bloke Alt yoğunluk saplı ve predivhücrelerin swarmer yoğun tüpün altına doğru sonuna kadar ise isional hücreler degrade üstüne yakın yüzer. Ölçek çubukları faz mikroskobu görüntüleri 1 mikron bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil hücre senkronizasyonu swarmer başarılı 2. Temsilcisi sonuçları. OD 600 ile ölçülen hücre kütlesi yavaş yavaş artırmak ve sonuçta testinin boyunca iki katına çıkacaktır. 1 ml'lik eş payları, bir büyük hücreli eşzamanlı ve belirtilen zaman noktalarında bir spektrofotometre kullanılarak ölçülen OD 600 plastik küvetler içine pipetlenmiştir. Buna ek olarak, CtrA'nın hücre döngüsü ana düzenleyici protein, bir süratli bir degradasyonu ile, ardından DNA replikasyonunu bloke etmek swarmer hücresinde mevcut olmalıdırDNA replikasyonunun başlatılması ile çakışık. CtrA'nın o zaman kritik kamçılı ve pili bileşenleri de dahil olmak üzere pek çok gelişme genin ifadesinin aktive edilmesi için, daha sonra hücre döngüsü yeniden üretilir. Hücre döngüsü ana düzenleyici protein CtrA Western blotlar büyük ölçekli senkronize 1 ml'lik numuneler alınarak yapıldı. Hücreler PVDF transfer% 10 TRIS-GLY PAGE, üzerinde ayrıldı, OD 600 250 ul Laemmlli numune tamponu yeniden süspansiyon haline getirildi, ve anti-CtrA'nın antikoru ile lekelenir. Başarısız senkron işlemleri protein düzeylerinde değişiklik CtrA'nın Western lekeleme yol açar. α-CtrA'nın antikor 12 bir 1 ° C enkübe edilmiştir:% 3 süt TBST içinde 1.5 saat için 10,000 seyreltme ve TBST içinde 3 kez yıkanmıştır. Keçi α-Tavşan daha sonra 1 ilave edildi ikincil:. 1 saat için 10,000 seyrelti,% 3 süt TBST, TBST ile 3 kez yıkandı ve kemilüminesan deteksiyon kiti kullanılarak film görüntüsü , lütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
| Na 2 HPO 4 | 17.4 g |
| KH 2 PO 4 | 10.6 gr |
| NH4CI | 10 g |
| H2O | 1 L & otoklav içinde süspanse |
Tablo 1. 20X M2 Tuzları Tarif.
| 20X M2 Tuzlar | 50 mi | |
| 0.5 M MgSO 4 | 1 mi | |
| % 20 Glukoz | 10 mi | M2, H2O için Yedek |
| Demir Sülfat Şelat Çözüm | 1 mi | |
| 0.1 M CaCl2 | 5 mi | Av son ekleoid yağış |
| H2O | 1 L doldurun | |
| 0.22 uM filtre ile steril filtre |
Tablo 2. M2 ve M2G tarifi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVP Coated Colloidal Silica (Percoll) | Sigma-Aldrich | P4937 | |
| Colloidal Silica (Ludox AS-40) | Sigma-Aldrich | 420840 | |
| JA10 Rotor | Beckman-Coulter | 369687 | |
| JA20 Rotor | Beckman-Coulter | 334831 | |
| Ferrous Sulfate Chelate Solution | Sigma-Aldrich | F0518 | |
| 30 ml Centrifuge Tubes | Corning | 8445 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-500g |
References
- McAdams, H. H., Shapiro, L. System-level design of bacterial cell cycle control. FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry. J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space. Science. 301, 1874-1877 (2003).
- Ptacin, J. L., Shapiro, L. Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation. Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).
- Evinger, M., Agabian, N. Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells. J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).
- Tsai, J. W., Alley, M. R. Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway. J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).
- Marks, M. E., et al. The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus. J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).
- Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).
- Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division. Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).
- Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).
- Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).
- Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein. Cell. 84, 83-93 (1996).
- Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication. Methods. 48, 8-13 (2009).
- Degnen, S. T., Newton, A. Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus. J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).
- Bates, D., et al. The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle. Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).
- Abel, S., et al. Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle. PLoS Genet. 9, e1003744 (2013).
- Johnson, R. C., Ely, B. Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus. Genetics. 86, 25-32 (1977).
- Britos, L., et al. Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus. PLoS One. 6, e18179 (2011).
- Boutte, C. C., Crosson, S. The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment. Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).
