Introduction
Den bakterielle cellesyklus styrer både replikasjon av genomet, og delingen av datterceller. Viktigere, som antibiotikaresistens er en voksende trussel mot folkehelsen, presenterer bakterienes cellesyklusen en uutnyttet mål for antibiotika utvikling.
I bakterien Caulobacter crescentus, fører hver celle syklus til en asymmetrisk divisjon har resultert i to datterceller med forskjellige skjebner (Figur 1a) 1,2. En datter celle arver en flagellum og er bevegelige mens den andre datter arver en stilk og er fastsittende. En integrert genetisk krets styrer cellecyklusprogresjonen og celle skjebne ved transkripsjonsregulering, fosfor-signalering, og regulert proteolyse tre. I tillegg kromosomreplikasjon og samtidige segregering avkastning datterceller som inneholder nøyaktig én kopi av kromosom 4. Viktigere, kan disse to celletyper hurtig separeres ved Colloidal silisiumdioksyd partikkeltetthet sentrifugering i synchronizable NA1000 stamme 5-7 som tillater isolering av Swarmer cellene fra resten av befolkningen med høye utbytter (figur 1B). Isolert Swarmer cellene deretter fortsette synkront gjennom asymmetrisk celledeling. Her, vi detalj protokollen som brukes for å synkronisere Caulobacter belastning NA1000. Vi gir protokoller og vanlige feilsøkingstips for både stor og liten skala synkroniseringer. Dette eksperimentelle prosedyren gir et kraftig verktøy for å avhøre den spatiotemporal kontroll av Caulobacter cellesyklusen og celle skjebne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Storskala Synchrony - Optimal for Western Blot, Microarray / RNA-Seq, og andre vesentlige Intensive Analyser
- Fra en fryse lager eller en plate, blir en 5 ml O / N kultur av stamme NA1000 ved risting ved 28 ° C i PYE medium.
- Inokulere 0,5 ml av cellene fra trinn 1 i 25 ml M2G (tabell 1-2) og ristes ved 28 ° C inntil kulturen når en OD 600 på mellom 0,5 og 0,6.
- Inokulere cellene i 1 liter M2G og ristes ved 28 ° C.
- Når OD 600 når 0,5 til 0,6, bekrefte tilstedeværelse av Swarmer celler ved hjelp av flytende montert fase mikroskopi. Spot 1 mL av celler på et glass lysbilde, dekk med et dekkglass, og bilde av fase mikroskopi. Bekrefte tilstedeværelse av Swarmer celler ved å visualisere hurtig svømming celler i populasjonen.
- Spinn-celler i 15 minutter ved 7 kxg ved 4 ° C i en JA-10 rotor.
- Kast supernatanten og legge 180 ml kald M2 (Tabell 1-2) og forsiktig resuspend alle cellene ved hjelp av en serologisk pipette. Kast løst pelleterte celler; de er predivisional og forfulgt celler.
- Legg 60 ml kald Kolloidalt silika løsning (husk å blande den Kolloidalt silika suspensjon godt før du legger til cellene) og bland cellesuspensjonen godt.
- Hell cellesuspensjonen inn i åtte 30 ml rør og spinne i 30 minutter ved 6,4 kxg ved 4 ° C i en JA-20 rotor.
MERK: Man bør se to forskjellige band; den Swarmer bandet er den nedre bandet mens forfulgt / predivisional cellene er i topp band (figur 1B). - Aspirere nøye toppen bandet av og fjerne væsken til ~ 1 cm over Swarmer band (nedre band).
- (Kritisk) Ved hjelp av en Pasteur pipette, forsiktig fjerne Swarmer band og plassere inn i et rent rør. Å vaske bort Kolloidalt silika, topp røret av med kaldt M2 og spinne i 10 min ved 6.4 kxg ved 4 ° C i en JA-20 rotor.
- Kast supernatanten forsiktig og resuspenderCellene i 20 ml kald M2 og spinn i 10 minutter ved 6,4 kxg ved 4 ° C i en JA-20 rotor.
- Resuspender alle pellets i 30 ml kald M2 og måle OD 600 ved hjelp av et spektrofotometer og tomt ved hjelp av kald M2 medium. Lagre en fil for fase bildebehandling for å se etter Swarmer celler; 90-95% av cellene bør være svermere.
- Spinne ned cellene i 5 min ved 6,4 kxg ved 4 ° C i en JA-20 rotor. Resuspender cellene i 28 ° C M2G medium, slik at en 600 er ~ 0,3-0,4 og begynne risting ved 28 ° C.
MERK: Typiske avkastning er mellom 30 og 60 ml av Swarmer cellekultur fra 1L av usynkroniserte celler. - Begynne å ta tidspunkter (villtype kultur vil ta cirka 135-140 minutter å dele) 8,9. Ved hvert tidspunkt, måle OD 600. Sjekk at OD 600 etter delingen er ca 2X den innledende OD 600.
- For vestlige blot eller genuttrykk analyser, fjerne 1mL prøver av cuLTURE på de ønskede tidspunkter, spinne ned ved maks hastighet på en tabletop sentrifuger i 30 sek, raskt dekanter eller aspirer medium, og flash fryse cellen pellet i flytende nitrogen. Lagring av celler ved -80 ° C inntil analyse nedstrøms.
2. Småskala Synchrony - Optimal for Mikros
- Fra en fryse lager eller en plate, blir en 5 ml O / N kultur risting ved 28 ° C i M2G.
- Fortynne i 15 ml M2G (tabell 1-2) og vokse til midten av log (OD 600 = 0,5-0,6).
- Sentrifugering ved 6.4 kxg i 10 min ved 4 ° C i en JA-20 rotor, og resuspender i 1 ml kald M2 (tabell 1-2) og overføring til et 2 ml mikrosentrifugerør.
- Spinn ved 15 kxg for 3 min i en mikro rør til pellets celler, aspirer av supernatanten, sette pellet på is, og resuspender i 900 ul kald M2.
- Legg 900 ul kald PVP belagt, kolloidalt silica og spinn i 20 minutter ved 15 kxg ved 4 ° C i en mikrofonrocentrifuge tube.
- (Kritisk) Sug eller pipettér av toppen forfulgt / predivisional celle band og samle bunnen Swarmer bandet inn i en ny mikrosentrifuge tube.
- Vask Swarmer cellene to ganger i 1 ml kald M2 samtidig sentrifugering ved 15 kxg i 3 min.
- Før sentrifugering, beveger cellene inn i en på forhånd avkjølt 1 ml prøverør av glass og måle OD 600 av cellene i forhold til et emne av M2.
- Resuspender den endelige cellepelleten i 28 ° C M2G ved en OD mellom 0,3 til 0,4 og riste / roll-celler ved 28 ° C.
MERK: Typiske avkastning er mellom 2 og 4 ml Swarmer cellekultur. - For mikroskopi eksperimenter, på ønsket tidspunkt sted en ul av celler på en M2G agarose pad for bildebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Synkronisering vanligvis gir to bånd av celler (figur 1B): den Swarmer bandet, som har en høyere tetthet, og en stilk / predivisional cellebånd med lavere tetthet. For å sikre effektiv synkronisering vanlige kontroller omfatter overvåking av OD 600 og måle nivåene av Ctra protein av western blot på forskjellige cellesyklus tidspunkter. OD 600 bør øke med omtrent 2 ganger i løpet av cellesyklusen (figur 2). Western blot for cellesyklus hovedregulator Ctra er en nyttig kontroll for å verifisere en god synkronitet (figur 2). Ctra anvendes i Swarmer celle for å blokkere DNA-replikasjon og degraderes ved inntreden av DNA-replikasjon 10. Ctra deretter syntetisert senere i cellesyklus og aktiverer transkripsjon av en rekke utviklingsmessige gener inkludert mange komponenter i flagellum 11,12. En vellykket synkronisering vil ha thans oscillerende mønster av Ctra protein nivåer.
Figur 1. cellesyklus Caulobacter crescentus. (A) En tegneserie skjematisk av Swarmer cellesyklusen. De Swarmer cellene differensieres til replikering kompetente forfulgt celler ved å trekke tilbake pili, mate flag, og initiere DNA replikasjon. Sirklene og theta strukturene vist inne i cellen skisserer representerer hvilende og reproduserende kromosomer. Cellene deretter videre gjennom cellesyklusen bygge et enkelt flagellum på polpunktet på motsatt side av stilken. Ved divisjon, to unike celletyper genereres, en replikering blokkert motile Swarmer celle og en replikering kompetent stasjonær forfulgt celle. (B) Representative resultater for densitetssentrifugering. Lavere tetthet forfulgt og predivisional celler flyte nær toppen av gradienten, mens tett Swarmer cellene ende opp mot bunnen av røret. Skala barer er en mikrometer i fase mikroskopi bilder. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Representative resultater for en vellykket Swarmer celle synkront. Den cellemasse målt ved OD 600 bør langsomt øke og til slutt dobbelte i løpet av analysen. 1 ml alikvoter ble pipettert inn i plast kyvetter fra en stor celle synkront og OD 600 målt ved anvendelse av et spektrofotometer ved de angitte tidspunkter. I tillegg bør Ctra cellesyklushoved regulatorisk protein være til stede i Swarmer celle for å blokkere DNA-replikasjon, etterfulgt av en rask nedbrytningsamtidig med initiering av DNA-replikasjon. Ctra regenereres så senere i cellesyklusen for å aktivere uttrykk for mange utviklings gener inkludert kritiske flagellære og pili komponenter. Western blot for cellesyklus mester regulatorisk protein Ctra ble utført ved å ta en ml porsjoner av en storstilt synkronitet. Cellene ble resuspendert i 250 ul prøvebuffer Laemmlli pr OD 600, separert på en 10% Tris-Gly PAGE, overført til PVDF, og blottet med anti-antistoff ctra. Mislykkede synkronitet prosedyrer føre til Ctra vestlige blotter med ingen endring i protein nivåer. α-Ctra antistoff 12 ble inkubert i en 1: 10.000 fortynning i 1,5 timer i 3% melk TBST og vasket tre ganger i TBST. Geit-α-kanin sekundært ble deretter tilsatt ved 1: 10000 fortynning i TBST 3% melk i 1 time, vasket tre ganger med TBST, og avbildes på filmen ved hjelp av en kjemiluminescerende deteksjonssett. Vennligstklikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Na 2 HPO 4 | 17,4 g |
| KH 2 PO 4 | 10,6 g |
| NH4CI | 10 g |
| H 2 O | Resuspender i en L & autoklav |
Tabell 1. 20X M2 Salts oppskrift.
| 20X M2 Salts | 50 ml | |
| 0,5 M MgSO4 | 1 ml | |
| 20% Glukose | 10 ml | Erstatning for H 2 O i M2 |
| Jernholdig sulfat chelat Solution | 1 ml | |
| 0,1 M CaCl2 | 5 ml | Legg siste til AVOID nedbør |
| H 2 O | Fyll opp til 1 L | |
| Sterilt filter med 0,22 mikrometer filter |
Tabell 2. M2 og M2G oppskrift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVP Coated Colloidal Silica (Percoll) | Sigma-Aldrich | P4937 | |
| Colloidal Silica (Ludox AS-40) | Sigma-Aldrich | 420840 | |
| JA10 Rotor | Beckman-Coulter | 369687 | |
| JA20 Rotor | Beckman-Coulter | 334831 | |
| Ferrous Sulfate Chelate Solution | Sigma-Aldrich | F0518 | |
| 30 ml Centrifuge Tubes | Corning | 8445 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| KH2PO4 | VWR | BDH9268-500G | |
| NH4Cl | Amresco | 0621-500g |
References
- McAdams, H. H., Shapiro, L. System-level design of bacterial cell cycle control. FEBS Lett. 583, 3984-3991 (2009).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. The architecture and conservation pattern of whole-cell control circuitry. J. Mol. Biol. 409, 28-35 (2011).
- McAdams, H. H., Shapiro, L. A bacterial cell-cycle regulatory network operating in time and space. Science. 301, 1874-1877 (2003).
- Ptacin, J. L., Shapiro, L. Initiating bacterial mitosis: understanding the mechanism of ParA-mediated chromosome segregation. Cell Cycle. 9, 4033-4034 (2010).
- Evinger, M., Agabian, N. Envelope-associated nucleoid from Caulobacter crescentus stalked and swarmer cells. J. Bacteriol. 132, 294-301 (1977).
- Tsai, J. W., Alley, M. R. Proteolysis of the Caulobacter McpA chemoreceptor is cell cycle regulated by a ClpX-dependent pathway. J. Bacteriol. 183, 5001-5007 (2001).
- Marks, M. E., et al. The genetic basis of laboratory adaptation in Caulobacter crescentus. J. Bacteriol. 192, 3678-3688 (2010).
- Ely, B. Genetics of Caulobacter crescentus. Methods Enzymol. 204, 372-384 (1991).
- Williams, B., Bhat, N., Chien, P., Shapiro, L. ClpXP and ClpAP proteolytic activity on divisome substrates is differentially regulated following the Caulobacter asymmetric cell division. Mol. Microbiol. 93, 853-866 (2014).
- Quon, K. C., Yang, B., Domian, I. J., Shapiro, L., Marczynski, G. T. Negative control of bacterial DNA replication by a cell cycle regulatory protein that binds at the chromosome origin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 120-125 (1998).
- Laub, M. T., Chen, S. L., Shapiro, L., McAdams, H. H. Genes directly controlled by CtrA, a master regulator of the Caulobacter cell cycle. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 4632-4637 (2002).
- Quon, K. C., Marczynski, G. T., Shapiro, L. Cell cycle control by an essential bacterial two-component signal transduction protein. Cell. 84, 83-93 (1996).
- Ferullo, D. J., Cooper, D. L., Moore, H. R., Lovett, S. T. Cell cycle synchronization of Escherichia coli using the stringent response, with fluorescence labeling assays for DNA content and replication. Methods. 48, 8-13 (2009).
- Degnen, S. T., Newton, A. Chromosome replication during development in Caulobacter crescentus. J. Mol. Biol. 64, 671-680 (1972).
- Bates, D., et al. The Escherichia coli baby cell column: a novel cell synchronization method provides new insight into the bacterial cell cycle. Mol. Microbiol. 57, 380-391 (2005).
- Abel, S., et al. Bi-modal distribution of the second messenger c-di-GMP controls cell fate and asymmetry during the caulobacter cell cycle. PLoS Genet. 9, e1003744 (2013).
- Johnson, R. C., Ely, B. Isolation of spontaneously derived mutants of Caulobacter crescentus. Genetics. 86, 25-32 (1977).
- Britos, L., et al. Regulatory response to carbon starvation in Caulobacter crescentus. PLoS One. 6, e18179 (2011).
- Boutte, C. C., Crosson, S. The complex logic of stringent response regulation in Caulobacter crescentus: starvation signalling in an oligotrophic environment. Mol. Microbiol. 80, 695-714 (2011).
