Summary

Rechtop Imaging van<em> Drosophila</em> Egg Chambers

Published: March 13, 2015
doi:

Summary

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

Abstract

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Introduction

Studie van Drosophila melanogaster heeft grote inzichten in de genetische regulatie van diverse verschijnselen. Met name is er uitgebreid onderzoek ei ontwikkeling, omdat oögenese biedt handelbaar manier om veel verschillende ontwikkelingsprocessen, waaronder weefsel patronen, cel polariteit, celcyclus schakelen en translationele regulering 1,2,3,4 onderzoeken. Een belangrijke morfogene gebeurtenis tijdens oögenese is de specificatie verwerving van motiliteit en migratie van een set cellen genaamd grens cellen (beoordeeld in 5). Aangezien celmigratie is een belangrijk kenmerk van dierlijke morfogenese en omdat de genetische regulatie van dit proces is goed geconserveerd mechanismen vastgesteld vliegen waarschijnlijk belangrijk in andere contexten zijn. Zo onderzoeken we de moleculaire controle van de grens cel migratie. Voor onze studies hebben we een nieuwe methode om de voorste polen ontwikkelen eieren observeren ontwikkeldwaar de grens cellen ontstaan, te onderzoeken hoe ze zich ontwikkelen in detail.

In de eierstok, ei kamers in verschillende ontwikkelingsstadia bestaan ​​langs ketens genaamd ovarioles, die zijn ingekapseld in een dunne omhulling (Figuur 1A). Elk ei kamer zal gaan om een ​​ei te vormen. Tijdens oögenese, moet een aantal verschillende celtypen te ontwikkelen op een gecoördineerde manier. De D. melanogaster ei kamer bestaat uit 16 kiembaan cellen, waaronder één eicel, omgeven door een single-layer folliculair epitheel 6. Een klein aantal gespecialiseerde cellen, genaamd poolcellen, ontstaat op de voorste en achterste polen van het epitheel. De 6-8 grens cellen ontstaan ​​in de voorste epitheel van het ei kamer, veroorzaakt door de polaire cellen 5,7. Medio oögenese (fase 9), de grens cellen los te maken van hun buren en migreren tussen de verpleegkundige cellen om de eicel te bereiken op de achterkant van het ei kamer 5,7. Deze beweging moet worden bereiktterwijl de grens cellen blijven in een cluster rond twee niet-polaire beweeglijke cellen, waardoor dit een soort collectieve celmigratie. Succesvolle migratie van de grens celcluster zorgt voor een goede ontwikkeling van de micropyle van de eierschaal, die nodig is voor bevruchting.

De voorste polaire cellen instrueren grens lot van de cel door het activeren van een signaaltransductie cascade. Polar cellen scheiden een cytokine, Unpaired (UPD), dat bindt aan een transmembraan receptor, Domeless (DOME), op aangrenzende follikel cellen tijdens fase 8 van eicelontwikkeling 8,9. De binding van UPD veroorzaakt Janus tyrosine kinase (JAK) tot fosforylering het Signal Transducer en Activator van de transcriptie (STAT) 8,10,11. STAT dan naar de kern om transcriptie te activeren. Langzaam Border Cells (SLBO) is een transcriptiefactor die een directe transcriptionele doel van STAT en is ook vereist voor grens celmigratie 12. Zijdelings uitzicht ei kamers geven thoed STAT activiteit wordt geregeld in een gradiënt over de voorste epitheel 8,11,13. Follikelcellen dichtst bij de polaire cellen de hoogste niveaus van geactiveerde STAT aldus worden zij rand cellen en binnenvallen aangrenzende kiemlijn weefsel.

Om te begrijpen hoe de grens cellen worden gespecificeerd binnen en losmaken van het epitheel, moeten we om te zien hoe het weefsel wordt georganiseerd. Als we ei kamers bekijken vanuit een anterieure-on perspectief, zouden we radiale symmetrie van STAT activiteit verwachten in de follikel cellen rondom de polaire cellen. Een eindaanzicht ook beter verschillen van membraaneiwitten en cel-cel-interfaces tonen vóór en tijdens losmaken dan vergeleken cellen in verschillende beeldvlakken. Omdat ei kamers zijn langwerpig en aan elkaar steel cellen, zij regelen op objectglaasjes lateraal, waardoor het moeilijk om de voorste architectuur observeren. Zo veel informatie over de cellen bij de polen van de ei kamer heeftis afgeleid uit een zijdelings uitzicht. Hoewel sommige informatie kan worden verkregen via algoritmische 3-D reconstructies van optische secties, lichtverstrooiing, fotobleken, en de armere grenzen van de resolutie in de Z-as te maken van deze informatie minder gedetailleerd en betrouwbaar in de afwezigheid van dure technieken als super-resolutie microscopie 14 . Andere soorten doorsnede Beeldvormende (bijvoorbeeld elektronenmicroscopie of microtoom snijden) dat uitgebreide manipulatie van weefsels, zoals uitdroging, waardoor de kans op artefacten. Zo, een nieuwe methode om de afbeelding D. ontwikkelden we melanogaster ei kamers terwijl rechtop. Deze methode heeft zijn nut al bewezen in het ophelderen hoe beweeglijke cellen zijn gedoemd (zie Representatieve resultaten en Manning et al, onder review), en zal waarschijnlijk meer in het algemeen waardevol in studies van andere aspecten van oögenese zijn.

Protocol

1. Dissectie van Ovarioles Breng ongeveer vijftien 2-4 dagen oude vrouwtjes en een paar mannetjes om een ​​frisse vlieg voedsel flacon met toegevoegde actieve droge gist. Gebruik katoen als een plug voor de flesjes, en voeg een paar druppels water aan de katoen om de luchtvochtigheid hoog te houden. Plaats flacon in een 25 ° C incubator gedurende 14-16 uur bij podiummonitoren 8-10 ei kamers maximaliseren. OPMERKING: Incubatie varieert afhankelijk van de temperatuur en de gewenste fase. <…

Representative Results

De opstaande beeldvormingswerkwijze konden we direct de organisatie van cellen in de voorste folliculaire epithelium zien in stap 8. een algemene merker voor follikel lot van de cel, de ogen Afwezig (EYA) proteïne, alsmede de nucleaire DNA merker DAPI vertoonde zelfs expressie in dit gebied van cellen, en dat voor alle cellen konden worden waargenomen met gelijke kleuring intensiteit (Figuur 2B "). Eiwitten geregeld in reactie op de cytokine UPD toonde echter variabele patronen en expressieniveaus…

Discussion

Hier wordt een methode beschrijven we te monteren en het imago kleine, ontwikkelen ei kamers van een end-on perspectief. Gemeenschappelijke technieken voor beeldvorming ei kamers zijn geoptimaliseerd voor een zijdelings uitzicht en in de eerste plaats maken een nauwkeurige visualisatie van medio-laterale follikel cellen na kleuring met fluorescerende antilichamen. Het gebruik van Z-stacks of 3-D reconstructies helpt bij het ​​bekijken van meerdere focale vlakken, maar is nog steeds onvoldoende voor subcellulaire res…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We appreciate assistance from members of the fly community, particularly Dr. Denise Montell, Dr. Lynn Cooley, and Dr. Pernille Rorth, for reagents. We thank Flybase, the Bloomington Drosophila Stock Center, and Developmental Studies Hybridoma Bank for information and providing fly stocks and antibodies, respectively. LM is supported by the Department of Education Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) training fellowship (P200A120017) and by a NIGMS Initiative for Maximizing Student Development Grant (2 R25-GM55036). A portion of the microscopy work was supported by NSF MRI grant DBI-0722569 and the Keith R. Porter Core Imaging Facility. Research was supported in part by a NSF CAREER Award (1054422) and a Basil O’Connor Starter Scholar Award from the March of Dimes, both awarded to MSG.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
0.1 M Potassium phosphate Buffer (KPO4 Buffer) Add 3.1 g of NaH2PO4•H2O and 10.9 g of Na2HPO4 (anhydrous) to distilled H2O to make a volume of 1 L. The pH of the final solution will be 7.4. This buffer can be stored for up to 1 mo at 4°C.
16% Paraformaldehyde aqueous solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 15710 methanol-free to preserve GFP fluorescence
30G x 1/2 inch needle  VWR BD305106 Regular bevel
Active Dry Yeast Genesee Scientific 62-103 To fatten female flies
Bovine Serum Albumin PAA-cell culture company A15-701 Used in NP40 Wash Buffer
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11295-10 Dumostar alloy, biologie tip; sharp tips are essential for ovariole dissection
DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma Aldrich D9542 5mg/ml stock solution  
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 16140-071 Added to supplement dissection medium (10%) 
Glass culture tube VWR 47729-576 14mL
Glass Depression Slides VWR 470019-020 1.2 mm Thick, Double Cavity
Glycerin Jelly  Electron Microsocpy Sciences 17998-10 Mounting media
Glycerol IBI Scientific IB15760 70% in PBS
IGEPAL CA-630 Sigma Aldrich I3021-500ML (interchangable for Nonidet P-40)  Used in NP40 Wash Buffer 
Leica Fluorescent Stereoscope  Leica Microsystems
Leica SP5 Confocal Microscope Leica Microsystems 40x/0.55NA dry objective 
Micro spatula  VWR 82027-518 Stainless steel
Microknife  Roboz Surgical Instrument Company 37-7546 45ᵒ angle
Microscope Slide VWR 16004-368 75x25x1 mm
NP40 Wash Buffer 50mM TRIS-HCL, 150mM NaCl, 0.5% Ipegal, 1mg/ml BSA, and 0.02% sodium azide
Penicillin-Streptomycin-Glutamine Life Technologies 10378-016 Added to supplement dissection medium (0.6X)
Petridish- Polysterine, sterile VWR 82050-548 60Wx15H mm
Phosphate Buffer Saline Sigma Aldrich P3813-10PAK 10 packs of Powder
Potassium phosphate dibasic Sigma Aldrich P3786-500G Used in 0.1M KPO4 Buffer 
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P9791-500G Used in 0.1M KPO4 Buffer 
Schneider’s Insect Medium Life Technologies
11720018
With L-glutamine and sodium bicarbonate
Sodium azide Sigma Aldrich S2002-25G Used in fluorescent antibody staining
Sodium chloride Sigma Aldrich S3014-500G Used in NP40 Wash Buffer
TRIS-HCL IBI Scientific IB70144 1M TRIS-HCL, pH 7.4
Volocity 3D Image Analysis Software PerkinElmer For processing confocal Z-stacks

References

  1. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
  2. Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
  3. Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Semin Cell Dev Biol. 19 (3), 271-282 (2008).
  4. Bilder, D., Haigo, S. L. Expanding the morphogenetic repertoire: perspectives from the Drosophila egg. Dev Cell. 22 (1), 12-23 (2012).
  5. Montell, D. J., Yoon, W. H., Starz-Gaiano, M. Group choreography: mechanisms orchestrating the collective movement of border cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 13 (10), 631-645 (2012).
  6. Spradling, A. C., Bate, M., Marinez-Arias, A. Developmental genetics of oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster. , 1-70 (1993).
  7. Montell, D. J. Border-cell migration: the race is on. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 13-24 (2003).
  8. Silver, D., Geisbrecht, E., Montell, D. Requirement for JAK/STAT signaling throughout border cell migration in Drosophila. Development. 132 (15), 3483-3492 (2005).
  9. Ghiglione, C., et al. The Drosophila cytokine receptor Domeless controls border cell migration and epithelial polarization during oogenesis. Development. 129 (23), 5437-5447 (2002).
  10. Denef, N., Schüpbach, T. Patterning: JAK-STAT signalling in the Drosophila follicular epithelium. Curr Biol. 13 (10), R388-R390 (2003).
  11. Beccari, S., Teixeira, L., Rørth, P. The JAK/STAT pathway is required for border cell migration during Drosophila oogenesis. Mech Dev. 111 (1-2), 115-123 (2002).
  12. Montell, D., Rorth, P., Spradling, A. slow border cells, a locus required for a developmentally regulated cell migration during oogenesis, encodes Drosophila C/EBP. Cell. 71 (1), 51-62 (1992).
  13. Xi, R., McGregor, J., Harrison, D. A gradient of JAK pathway activity patterns the anterior-posterior axis of the follicular epithelium. Dev Cell. 4 (2), 167-177 (2003).
  14. Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 285-314 (2010).
  15. McDonald, J., Pinheiro, E., Kadlec, L., Schupbach, T., Montell, D. Multiple EGFR ligands participate in guiding migrating border cells. Dev Biol. 296 (1), 94-103 (2006).
  16. Van de Bor, V., Zimniak, G., Cérézo, D., Schaub, S., Noselli, S. Asymmetric localisation of cytokine mRNA is essential for JAK/STAT activation during cell invasiveness. Development. 138 (7), 1383-1393 (2011).
  17. Hayashi, Y., et al. Glypicans regulate JAK/STAT signaling and distribution of the Unpaired morphogen. Development. 139 (22), 4162-4171 (2012).
  18. Airoldi, S. J., McLean, P. F., Shimada, Y., Cooley, L. Intercellular protein movement in syncytial Drosophila follicle cells. J Cell Sci. 124 (Pt 23), 4077-4086 (2011).
  19. Rørth, P., et al. Systematic gain-of-function genetics in Drosophila). Development. 125 (6), 1049-1057 (1998).
  20. Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
  21. Shimada, Y., Burn, K. M., Niwa, R., Cooley, L. Reversible response of protein localization and microtubule organization to nutrient stress during Drosophila early oogenesis. Dev Biol. 355 (2), 250-262 (2011).
  22. Quiñones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. Genetics. 175 (3), 1089-1104 (2007).
  23. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175 (3), 1505-1531 (2007).
  24. Belu, M., et al. Upright imaging of Drosophila embryos. J Vis Exp. (43), (2010).
  25. Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Dev Dyn. 237 (11), 3252-3259 (2008).

Play Video

Cite This Article
Manning, L., Starz-Gaiano, M. Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers. J. Vis. Exp. (97), e52636, doi:10.3791/52636 (2015).

View Video