Summary
Protokolle für die Untersuchung Brustkrebs-Zellmigration, Proliferation und Kolonisierung in menschlichen Knochengewebe Explantation Modellsystem beschrieben.
Abstract
Bone ist die häufigste Stelle der Metastasierung von Brustkrebs. Obwohl es allgemein, dass der Mikro Einflüsse Krebszellverhalten akzeptiert wird, wird wenig über Brustkrebszell Eigenschaften und Verhaltensweisen in der nativen Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe bekannt. Wir haben Ansätze zu verfolgen, zu quantifizieren und zu modulieren menschlichen Brustkrebszellen in der Mikroumgebung des entwickelten kultivierten menschlichen Knochengewebefragmenten aus gebrauchten Femurköpfe nach Hüft-TEP Operationen isoliert. Verwendung Brustkrebszellen für Luciferase konstruiert und verstärkt grün fluoreszierende Protein (EGFP) Expression sind wir in der Lage, reproduzierbar zu quantifizieren Migration und Proliferation Muster mit Biolumineszenz-Bildgebung (BLI), Spur Zell-Wechselwirkungen innerhalb der Knochenfragmente mittels Fluoreszenzmikroskopie und auszuwerten Brustzellen nach Besiedlung mit Durchflusszytometrie. Die wichtigsten Vorteile dieses Modells sind: 1) eine native, architektonisch intaktem Gewebe MicroEnvironment relevanten Zelltypen des Menschen beinhaltet, und 2) direkten Zugriff auf die Mikroumgebung, die eine schnelle quantitative und qualitative Überwachung und Störung der Brust und Knochenzelleigenschaften, Verhaltensweisen und Interaktionen ermöglicht. Eine Haupteinschränkung, derzeit ist die finite Lebensfähigkeit der Gewebefragmente, die das Fenster der Studie, um Kurzzeitkultur beschränkt. Anwendungen des Modellsystems umfassen die Untersuchung der Grundlagen der Biologie von Brustkrebs und anderen Knochensuchmalignomen in der metastatischen Nische, und die Entwicklung therapeutischer Strategien zur zielgerichteter Brustkrebszellen in Knochengewebe.
Introduction
Die Tumor-Mikroumgebung wird weithin als ein kritischer Faktor für die Krebszelle Verhalten bei Brustkrebs Progression und Metastasen erkannt verteilt 1-3. Das Ziel der hier vorgestellten Verfahren ist die Untersuchung von Brustkrebs-Zellen in der Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe, die häufigste Stelle der Brustkrebsmetastase 4-6 erleichtern. Knochen von mineralisierten und Mark Fächer 7-9, die beide beherbergen Zellen sezerniert Faktoren bei metastasierendem Progression 10,11 verwickelt zusammen. Obwohl weit verbreitet in vivo Mausmodellen zu erleichtern systemische Studien des metastatischen Prozesses 12-15, Zell-Wechselwirkungen innerhalb des Skeletts sind nicht für die Beobachtung und direkten Störung leicht zugänglich. Modellsysteme für die Untersuchung und Kultivierung von Maus-Knochengewebe und Knochenmarkzellen der Maus einen besseren Zugang und haben viele Erkenntnisse über Sprechen und Mechanismen, die Brustkrebs-Zell m ergabetastasis der murinen Gerüst 16-22. Studien haben jedoch ergeben, dass es artspezifische Muster osteotropism für Knochengewebe 23,24 sein. Diese Muster inhärent speziesspezifische Unterschiede in der Knochengewebeeigenschaften, von Differenzen aus veränderten Knochenmarkspopulationen in immundefizienten Mäusen 11 und / oder der relativ jungen Alter der Mäuse in Experimenten verwendet, von denen alle voraussichtlich Determinanten des Knochens beziehen könnte Mikroumgebung.
In vitro-Ansätzen zur Untersuchung Brustkrebszellen in menschlichen Knochen Kokulturen wurden typischerweise auf bestimmten Knochenzelltypen wie Mark abgeleiteten Osteoblasten oder Stromazellen als Monolayer kultiviert oder in konstruierte 3-dimensionale Modellsysteme 25-35 konzentriert. Obwohl 2-dimensionalen Zellkulturmodellen haben die Hauptstütze der in vitro gebildeten Ansätze für die Krebsforschung ist seit langem bekannt, dass das Zellverhalten ist grundsätzlich in m verändertonolayer Kultursystemen 18,36,37. Dies hat zur Entwicklung von technisch Mikroumgebungen, die die Komplexität von 3-dimensionalen lebenden Geweben, einschließlich Matrix- und Gerüst basierende Modelle von natürlichen Materialien wie Collagen nachahmen geführt, oder synthetische Polymere geimpft mit spezifischen Zelltypen, die gewebeartige Mikroumgebungen zu schaffen 36-41. Engineered Ansätze haben auch die Verwendung von Bioreaktor Plattformen zu kontrollieren und zu untersuchen das hormonelle Milieu der Mikro 18,19,41-43. Obwohl biomimetische Modelle und Bioreaktoren bieten viele Elemente eines komplexen Gewebemikroumgebung, in einer kontrollierten Umgebung und wurden erfolgreich angewendet, um die Studie von Brustkrebs Metastasen in Knochen 18,19,35,42,43 voranzubringen, müssen entwickelt Modellsysteme in der Regel nicht übernehmen das gesamte Spektrum von Zelltypen und extrazelluläre Matrixkomponenten innerhalb der nativen Knochen Umwelt vorhanden.
Bis vor kurzem BrustkrebsZellen wurden nicht innerhalb der nativen intakten, 3-dimensional-Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe untersucht worden. Vor kurzem berichteten wir die Entwicklung eines Co-Kultur-Modell mit menschlichen Knochengewebefragmenten aus Hüft isoliert (THR) Chirurgie Proben 44. Diese Proben bergen sowohl die Mineralisierung und Knochenmark Fächer notwendig, Mechanismen Mikrometastasen in Kurzzeitkultur zugrunde zu studieren. In früheren Arbeiten haben wir Proof-of-Prinzip für die Verwendung von Biolumineszenz-Bildgebung (BLI), die Proliferation von Luciferase-exprimierenden Brustkrebszellen (MDA-MB-231-Fluc) co-kultiviert mit Knochenfragmente 44 zu überwachen. Hier haben wir für das Studium der Brust Zellkrebs Proliferation, Kolonisierung und Migration im Rahmen der nativen Mikroumgebung mit menschlichen Knochen Gewebeexplantaten Gehende bestehende experimentelle Protokolle.
Zuerst ein Protokoll für Co-Kultivierung Brustkrebszellen neben Knochenfragmenten an Brust messen präsentieren wirZellproliferation mit BLI. In diesem Abschnitt werden die Brustzellsuspensionen Zellflecken in 6-well Platten angrenzend an Knochenfragmente, die durch Stücke von Knochenwachs immobilisiert werden ausgesät. Kontrollvertiefungen enthalten Knochenwachs, aber keine Knochenfragment. Sobald Zellflecken zu befestigen, ist Medium gegeben und die Platte wird für 24 Stunden, nach der Biolumineszenz-Signalintensität (mit Zellzahl assoziiert) mit BLI gemessen kultiviert. Im nächsten Schritt stellen wir Verfahren zur Co-Kultivierung Brustkrebszellen direkt auf Knochenfragmente beimpft, um Ansiedlung und Vermehrung zu studieren. Hier werden die Brustzellsuspensionen werden direkt auf die Knochengewebefragmenten, die in Kultur durch BLI und Fluoreszenzmikroskopie über die Zeit überwacht werden, um Kolonisation und Zellzahl verfolgen pipettiert. In diesem Verfahren wird der Markraum kann von den Knochenfragmenten zu jedem Zeitpunkt für die Analyse von kolonisierten Brustkrebszellen durch Durchflusszytometrie gespült werden oder Mark-Lebensfähigkeitstests.
Darüber hinaus haben wir deSchreiber zwei verschiedene Ansätze zur Messung von Brustkrebszellmigration. Im ersten Verfahren wird zur Messung der Migration in Richtung Knochengewebekulturüberständen Schritten beschrieben. In diesem Protokoll die Brustkrebszellen ausgesät werden, auf die inneren, oberen Flächen der Transwell einfügen Membranen mit einer 8 um Porengröße (wie in 1A gezeigt). Die Einsätze werden dann in einer Aufnahmeplatte mit Vertiefungen, die Knochengewebe Überstand oder Kontrollmedium platziert. Im Laufe von 20 Stunden Inkubationszeit eine kleine Anzahl von Brustkrebszellen wandern durch den Einsatz Membranen in die unteren Gewebekulturvertiefungen, wo sie für den Nachweis durch BLI befestigen. In der zweiten Migrations-Verfahren die Brustkrebszellen werden auf die untere Außenflächen Transwell-Einsatz Membranen ausgesät. Knochengewebefragmente werden in die Einsatzschalen gelegt und die Brustkrebszellen wandern nach oben durch die Membranen an den Knochenfragmenten zu kolonisieren (wie in 1B dargestellt), diewerden dann aufgenommen mit BLI.
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Protocol
Kugelköpfe wurden von Patienten nach elektiven THR Chirurgie in der Abteilung für Orthopädische Chirurgie an der Stanford University School of Medicine gesammelt. Alle Gewebe wurden als de-identifizierte Proben in Übereinstimmung mit den Vorschriften der Stanford University Research Compliance Office gesammelt.
1. Auswählen einer Brustkrebszelllinie (n)
- Erhalten oder Transfektion die gewünschte Brustkrebszelllinie (n) mit einem Luciferase-GFP-Reporterkonstrukt. Die folgenden Versuche wurden durch Transfektion mit dem Transposon Sleeping Beauty Plasmid PKT2 / Lubig unter Verwendung der MDA-MB-231 und MCF-7 Brustkrebs-Zelllinien für die stabile Expression von Firefly Luziferase entwickelt (Fluc) und enhanced green fluorescent protein (EGFP) und die Transposase Plasmid pK / hUbiC-SB11 45,46.
HINWEIS: Die transfizierten Zelllinien werden als MDA-MB-231-FluC-EGFP und MCF-7-FluC-EGFP bezeichnet.
2. Isolieren Tissue Fragments von Hüftköpfe
- Nach THR Chirurgie, sammeln die verworfen Hüftkopf in einem sterilen Behälter mit physiologischer Kochsalzlösung gefüllt. Die Probe wird im Labor und verarbeiten es in 1-3 Stunden nach der Operation. Hinweis: wenn es eine Verzögerung in der Verarbeitung, Man gibt die Probe bei 4 ° C.
- Bereiten Sie einen Arbeitsbereich, indem Sie die folgenden Elemente auf einem saugfähigen Matte in einer laminaren Strömung Gewebekultur Haube: sterile Handschuhe, chirurgische Zange, Zangen, Becherglas mit 70% igem Isopropanol, Instrumente und Gewebekulturgefäße gründlich wie unten für jede Art von Experiment festgelegt .
- Das Tragen eines sterilen OP-Handschuh, um die Runde Femurkopf in einer Hand zu halten, verwenden Sie die Zange in der anderen Hand, um Trabekelknochen Fragmente gewünschter Größe (~ 2-5 mm) von der freiliegenden oberen Welle des Oberschenkelknochens zu extrahieren. Übertragen Knochenfragmente in das Kulturgefäß (beispielsweise 6, 12 oder 24-Well-Gewebekulturplatte oder Migration Kammer), abhängig von der Art der Proliferation, colonization oder Migration Experiment wie in den Schritten 3, 4 oder 5 beschrieben.
HINWEIS: Knochengewebefragmenten sollte wie oben, nachdem Sie die ersten Schritte für jede spezifische Proliferation, Kolonisierung oder Migrationsassay beschrieben geerntet werden. Fragmente in einem Größenbereich, wie in Abbildung 2 dargestellt. Fragmente können vor oder nach Versuchen zum Zwecke der Standardisierung abzuwägen.
3. Co-Kultivierung von Brustkrebszellen Angrenzend an Knochenfragmente zu Brustzellproliferation messen Mit BLI
- Vor dem Experiment Eine Suspension, die 2 x 10 5 Brustkrebszellen / 50 ul, und bereiten Stopfen aus Knochenwachs zur Immobilisierung von Knochenfragmenten in Kultur. Schneiden Sie ein P200 Mikropipettenspitze in 3 Teile, verwenden Sie das schmale Ende der größte Stück in einem "Cookie-Cutter" Art und Weise, um kleine (~ 35 mg) Knochenstücke Wachs geschnitten. Verwenden Sie das breite Ende der kleinste Stück, um die Knochenwachs Stecker in eine Petrischale ausgeworfenfür die Lagerung.
- Legen Sie ein Stück Knochenwachs auf der 12-Uhr-Position jeder Vertiefung und drücken Sie leicht mit einem sterilen Handschuhen Zeigefinger.
- Je 50 ul der Zellsuspension mit 1 x 10 5 Brustkrebszellen in DMEM-10% FBS + Pen-Strep in der Mitte jeder Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen. (Alternativ Samenzellen in einem verteilten Muster, falls gewünscht.) Die Platte wird in einem 37 ° C Brutschrank für 45 Minuten, um die Zellhaftung zu fördern.
- Zeigen 1 Knochenfragment auf 1 Stück Knochen Wachs für jeden experimentellen gut und sanften Druck mit der Knochenzange, um sie zu sichern. Führen Experimenten in dreifacher Ausfertigung, dass 3 Knochenfragmente von einem bestimmten THR Probe werden in den ersten drei Vertiefungen gegeben, während die unteren drei Brunnen enthalten Knochenwachs nur als Kontrolle.
- Unter Verwendung einer 5 ml-Pipette vorsichtig und langsam zu liefern 5 ml DMEM-10% FBS zu der Seite jeder Vertiefung zu vermeiden Verdrängen der Brustzellen oder Knochenfragmenten. Die Platte wird in eine 3776; C Gewebekultur-Inkubator für 20-24 Std.
- Um Biolumineszenz-Bildgebung durchzuführen (BLI) entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und fügen Luciferinsubstrat (um eine Konzentration von 300 ug / ml zu erreichen) in jede Vertiefung. Bild die Platte sofort in einem IVIS Imaging Platform mit den folgenden Parametern: Blende von 1, kleine Binning, Belichtungszeit von 1 Sekunde, Ebene D. Messen Sie die Signalintensität der einzelnen sowie durchschnittliche Strahldichte (Photonen / Sekunde / Quadratzentimeter / Steradiant).
- Verwenden Sie Imaging-Software zu definieren, Regions of Interest (ROI), die durchschnittliche Strahlung für alle experimentellen und Kontrollvertiefungen zu quantifizieren. Export durchschnittliche Strahlungswerte in ein Excel-Blatt, Statistiken führen und Grafiken erstellen.
4. Co-Kultivierung von Brustkrebszellen direkt Gesetzte Auf Knochenfragmente zur Kolonisation und Cell Number Studieren
- Verwenden einer Pinzette, um Knochenfragmente direkt in die leeren Wells einer 24-Well-Gewebekulturplatte (1 Fragment / Vertiefung) zu platzieren.
- Pipette 50 ul Zellsuspension Tröpfchen aus DMEM-10% FBS mit 1 X 3-6 Oktober Brustkrebszellen direkt aufeinander Knochenfragment. Die Platte wird in einem 37 ° C Brutschrank für 45 Minuten, um die Zellhaftung zu fördern. Hinzuzufügen sanft 1-2 ml DMEM-10% FBS in die Seite jeder Vertiefung, so daß das Fragment wird vollständig in einem Medium eingetaucht ist. Inkubieren der Platte in einem 37 ° C Brutschrank für 20-24 Std.
- Nach der Inkubation verwenden Pinzette jedes Knochengewebefragment in ein frisches 24-Well-Platte mit 1 ml DMEM-10% FBS in jede Vertiefung zu übertragen. Um BLI durchzuführen, führen Sie die Schritte 3,6-3,7 oben. Zusätzlich können Fragmente mit einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden, oder gespült, um den Markpopulation für Analysen der Brustkrebs-Zellzahlen und den Eigenschaften wie in Schritt 6 beschrieben, erhalten.
- Um die intakten Fragmente zur qualitativen Bewertung durch Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet folgenden BLI, Pipette 5 ul von fluoreszierenden Bisphosphonat Markierungslösung (preVergleich nach den Anweisungen des Herstellers) in jede Vertiefung, um die mineralisierte spicules der Knochenfragmente zu markieren. Die Platte in der Gewebekultur-Inkubator für weitere 24 Stunden.
- Nach 24 Stunden der Kultur in der Leuchtstoff Bisphosphonat Etikettierungslösung Verwenden einer Pinzette, um die Fragmente zu Gewebekulturplatten mit Phenolrot-freiem Medium und Ausblick mit einem Fluoreszenzmikroskop für Bild GFP (485 nm) und Bisphosphonat-Etikett (680 nm) konfiguriert übertragen.
5. Mess Migration von Brustkrebszellen zu Knochengewebe Fragmente und kultivierten Knochenfragment Stände
- Migration in Richtung Knochengewebekulturüberstand.
HINWEIS: Führen Experimenten in dreifacher Ausführung, so daß 3-Fragmenten aus einem gegebenen THR Probe verwendet werden, um 3-Überstände zu erzeugen. Für jedes Experiment wird die Migration auf drei Vertiefungen, die Knochenüberständen gegen drei Brunnen, die nur Steuermedium verglichen.- Geneknochen tisklagen Ständen indem Knochenfragmente in die Wells einer 12-Well-Platte mit 2,2 ml DMEM-10% FBS pro Mulde. Kultur in einem 37 ° C Brutschrank für 24 Stunden. Ziehen Sie das Medium nach 24 Stunden und ersetzen mit 2,2 ml frischem DMEM-10% FBS. Treat Kontrollvertiefungen enthaltenden DMEM-10% FBS in der gleichen Weise.
HINWEIS: Das Medium wird nach 24 Stunden geändert, um Faktoren als Reaktion auf Gewebetrauma nach einer Operation erfolgen abgesondert zu entfernen. Weil Knochengewebe Überstände werden in generierten FBS enthaltenden Medium, Vertiefungen, die FBS enthaltenden Medium nur enthalten, um für die Beiträge der FBS, um Brustkrebs-Zellmigration steuern. - Nach 48 Stunden, sammeln 0,9 ml jedes Überstands / Steuermedium und Pipette in die Vertiefungen einer Aufnahmeplatte. Die Einsätze werden später in diese Vertiefungen gelegt werden. Inkubieren Sie die Aufnahmeplatte in der Gewebekultur-Inkubator während der Aussaat der Einsätze. Hinweis: Der verbleibende Überstand (~ 1 ml nach dem Eindampfen) können für die Analyse von Sekretom facto gesammeltrs auf Wunsch 44.
- Um die Transwell-Einsätze Saatgut, legen Sie sie in ein Standard, leere 24-Well-Gewebekulturplatte. Pipette 350 ul Zellsuspension, die 1 x 10 5 Brustkrebszellen in DMEM-10% FBS auf das obere, innere Membranoberfläche jedes Einsatzes, wie in 1A gezeigt. Legen Sie die Platte mit 24 Vertiefungen, die die gesetzten Einsätze in den 37 ° C Brutschrank für 45 Minuten, um die Befestigung zu fördern.
- Sobald die Zellen an den Einsätzen befestigt sind, verwenden Zange, um die Einsätze an der Aufnahmeplatte nach den Anweisungen des Herstellers übertragen. Angle jeder Einsatz, wenn Sie diese in den Receiver auch um eine Blasenbildung zwischen dem Einsatz Membran und der Empfänger auch Überstand zu verhindern. Inkubieren des Empfängerplatte mit Einlagen für 20 h in einem 37 ° C Brutschrank.
HINWEIS: Blasen zwischen dem Einsatz Membran und der Empfänger auch supernatan Überprüfen Sie die Unterseite der Aufnahmeplattet. Sind Blasen sichtbar, entfernen Sie die spezifische Einsätze und legen Sie sie wieder in den Empfänger gut, bis keine Luftblasen vorhanden sind. - Nach 20 h Verwendung einer Pinzette, um die Einsätze von der Aufnahmeplatte zu entfernen. Unter Verwendung der Verfahren in Schritten von 3,6 bis 3,7 durchgeführt BLI für Bild in die Zellen, die in migriert und auf den Boden der Aufnahmeplatte Brunnen angeschlossen haben.
- Geneknochen tisklagen Ständen indem Knochenfragmente in die Wells einer 12-Well-Platte mit 2,2 ml DMEM-10% FBS pro Mulde. Kultur in einem 37 ° C Brutschrank für 24 Stunden. Ziehen Sie das Medium nach 24 Stunden und ersetzen mit 2,2 ml frischem DMEM-10% FBS. Treat Kontrollvertiefungen enthaltenden DMEM-10% FBS in der gleichen Weise.
- Migration in Richtung Knochengewebefragmenten.
HINWEIS: Führen Sie Versuche in dreifacher Ausfertigung, dass 3-Fragmenten aus einem gegebenen THR Probe werden in 3 verschiedene Inserts platziert und 3 Glasperlen werden in 3 verschiedene Einsätze als Kontrollen gelegt.- Bereiten Sie die Aufnahmeplatte durch Pipettieren von 0,9 ml DMEM-10% FBS in jede Vertiefung. Legen Sie sie in den Brutschrank, während der Vorbereitung der Einsätze.
- Um die Einsätze Saatgut, kehren sie auf der Oberfläche eines Kunststoffmikrozentrifugenröhrchen Box, die einen Deckel hat. Pipettieren Sie 50 ul Zellsuspension Tropfen DMEM-10% FBS, die 1 x 10 5 Brustkrebszellen direkt auf die äußere, untere Fläche jedes Einsatzes Membran (zugewandte auf der invertierten Einsätze). Bedecken Sie die Mikrozentrifugenröhrchen Box mit dem Deckel aufgeschlagen und übertragen sie an die 37 ° C-Inkubator Gewebe für 45 Minuten, um die Zellhaftung zu fördern.
- Übertragen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen Feld, um die Gewebekultur Kapuze, und verwenden Sie Pinzette, um die gesetzten Einsätze rechten Seite nach oben drehen und sie in die Vertiefungen der Aufnahmeplatte. Pipette 0,450 ml DMEM-10% FBS in jede Einsatzschale. Mit einer Pinzette, übertragen Sie einen Knochengewebe Fragment (ca. 3 mm) in jede vorbereitete Einsatzschale. Optional können Sie mit Glasperlen als negative Kontrollen in weitere Bohrungen. Die Platte wird in einem Gewebekultur-Inkubator für 20 Stunden.
- Um die Migration zu messen, bereiten Sie einen Standard-24-Well-Gewebekulturplatte mit 1 ml DMEM-10% FBS pro Vertiefung. Entfernen Sie die Aufnahmeplatte aus dem Inkubator und verwenden Pinzette, um die Knochenfragmente und Perlen aus jeweils in separate Vertiefungen der Standardplatte übertragen einfügen. Luciferin hinzufügenSubstrat in jede Vertiefung (um eine Endkonzentration von 300 ug / ml zu erreichen) und führen BLI unter Verwendung der Verfahren in den Schritten 3,6-3,7.
6. Zusätzliche Pre- und Post-experimentellen Analysen
- Analyse gespült Mark.
- Übertragen einer Knochenfragment in eine 70 & mgr; m Zellsieb an der Spitze einer konischen 50 ml-Röhrchen gegeben. Verwenden einer 10 ml-Spritze mit einer 25 G Nadel, um kräftig zu spülen das Fragment mit 10 ml PBS, um eine Suspension von Knochenmarkzellen in der konischen Röhre zu erhalten. Zentrifuge wurde die Zellsuspension 3 Minuten bei 300 × g und 21 ° C, saugt den Überstand und Resuspendieren der pelletierten Zellen in PBS oder andere gewünschte Lösung für die Durchflusszytometrie.
HINWEIS: Resuspension Volumen wird in Abhängigkeit von der Größe der Zellpellet nach der Zentrifugation und der Anwendung variieren. - Für Lebensfähigkeitstests ~ 75-300 ul-Volumina von PBS angemessen sind, und diese Suspensionen können analysiert werden unter Verwendung von im Handel erhältlichen fluorescence basierend Lebensfähigkeitstests nach den Anweisungen des Herstellers, pipettiert in einen herkömmlichen Hämozytometer und mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop gezählt.
- Für die Durchflusszytometrie oder Sortierung basierend auf der Erfassung GFP-positiven Brustkrebszellen, Zellpellet in 1 ml PBS, enthaltend 2% FBS, 2 mM EDTA und 10 mM HEPES, so dass die Konzentration 1 x 10 6 Zellen / ml.
- Übertragen einer Knochenfragment in eine 70 & mgr; m Zellsieb an der Spitze einer konischen 50 ml-Röhrchen gegeben. Verwenden einer 10 ml-Spritze mit einer 25 G Nadel, um kräftig zu spülen das Fragment mit 10 ml PBS, um eine Suspension von Knochenmarkzellen in der konischen Röhre zu erhalten. Zentrifuge wurde die Zellsuspension 3 Minuten bei 300 × g und 21 ° C, saugt den Überstand und Resuspendieren der pelletierten Zellen in PBS oder andere gewünschte Lösung für die Durchflusszytometrie.
- H & E-Färbung und Immunhistochemie.
- Um die Fragmente für Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung und / oder Immunhistochemie Dabei legen die Fragmente in Plastikkassetten mit einer Nummer 2 Bleistift markiert, und tauchen in einen Behälter mit 10% gepuffertem Formalin für 24 Stunden aufgefüllt.
- Prozess-Gewebe für Paraffineinbettung, Schneiden und Färben Verwendung von Routineprotokollen, die eine Entkalkung Schritt für die mineralisierten Nadeln in jedem Fragment Konto gehören.
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Representative Results
Isolieren von Gewebefragmenten aus Hüftköpfe
Kugelköpfe wurden aus einer gleichen Anzahl von männlichen und weiblichen Patienten (44-90 Jahre) nach elektiven Hüft-Chirurgie in der Abteilung für Orthopädische Chirurgie an der Stanford University School of Medicine gesammelt. Jedes verworfen Hüftkopf enthält einen kleinen Teil des oberen Oberschenkel, die trabekuläre Knochengewebe des mineralisierten Nadeln und Mark zusammen birgt. Dieses Gewebe ist durch die chirurgisch freiQuerSchnitt der Welle (2A) unter Verwendung einer chirurgischen Zange, kleine Fragmente zu extrahieren zugänglich. Die Histologie der extrahierten Stücke ist in 2B gezeigt und enthüllt die mineralisierten und Knochenmark-Komponenten. Die Erscheinung der extrahierten Stücken variiert über Kugelköpfe von verschiedenen Patienten erhalten wurde, im Bereich von gelb bis rot je nach Adipozyten Gehalt des Knochenmarks, wie in 2C gezeigt. We zeigen die Verwendung dieser Knochengewebefragmenten in kurzfristigen Assays zur dynamischen Interaktionen mit Brustkrebszellen für Luciferase und EGFP-Expression gentechnisch messen.
Co-Kultivierung von Brustkrebszellen neben Knochenfragmente zu Brustzellproliferation messen mit Biolumineszenz Imaging
Die Kulturplatte Setup für Kokultivierung MDA-MB-231-FluC-EGFP Brustkrebszellen benachbart immobilisierten Knochenfragmenten an Brustkrebs-Zellproliferation mit BLI Messung ist in 3A gezeigt. BLI der Platte bei 24 Stunden ist in 3B aus 3 Experimenten dargestellt und BLI Signal und zeigt erhöhte Zellproliferation in Gegenwart vs. Abwesenheit von Knochenfragmenten ist in 3C gezeigt.
Co-Kultivierung von Brustkrebszellen direkt auf Knochenfragmente Gesetzte zur Kolonisation und Cell Number Studieren
Colonization von MCF-7-Fluc-EGFP cEllen ausgesät direkt auf Knochengewebefragmenten als über BLI nach 24 Stunden gemessen, ist in 4A dargestellt, zeigen verringerte Signal mit sinkenden Aussaatdichte verbunden. Ein direkt-seeded-Fragment in 48 h in 4B gezeigt, nach Markierung mit fluoreszierenden biphosophonate Reagenz, wie durch Fluoreszenz-Mikroskopie abgebildet, um Kolonisierung der Brustkrebszellen innerhalb der mineralisierten und Mark Abteile offenbaren. Diese Besiedlungsmuster sind auch in post-experimentell für immunhistochemische Färbung mit Zytokeratin Antikörper (4C und 4D) verarbeitet direkt ausgesät Fragmente ergab.
Mess Migration von Brustkrebszellen zu Knochengewebe Fragmente und kultivierten Knochenfragment Stände
Migration von MDA-231-Fluc-EGFP-Zellen in porösen Membranen Migration in Richtung Knochengewebe Kulturüberständen und in Knochenfragmente mit B erkanntLI, wie in 5 gezeigt eine robuste Migrationsmuster zu Kulturüberständen aus drei Fragmenten eines gegebenen THR Probe abgeleitet ist in 5A, die in Vertiefungen, die Knochengewebe Stand vs. Kontrollmedium erhöhte Migration zeigt gezeigt. Auch wenn nicht alle Migrationsmuster sind diese robusten, Migration in Richtung Knochenständen ist in der Regel größer als in Richtung Steuermedium in den meisten Experimenten. Eine typische Wanderungsmuster in Knochenfragmente von einem gegebenen THR Stufe ist in 5B gezeigt.
Analyse Flushed Marrows
Darüber hinaus veranschaulichen wir, dass Markzellen aus kolonisiert Fragmente gespült werden, und unter diesen Zellen mittels Durchflusszytometrie (6B), BLI (6C) eingesetzte gespült Brustkrebszellen erkannt werden, und / oder Fluoreszenzmikroskopie (6D) .
Mess Viability
Abbildung 1: bis Migrationsversuche einstellen. (A) In "vorwärts Migration" Experimente werden die Empfängerplatte Brunnen mit zuvor generierten Knochengewebe Kulturüberständen gefüllt. Brustkrebszellen, die in Einsatzschalen DME-10% FBS enthält, auf der inneren, oberen Flächen der Transwell ausgesät Membranen migrieren durch die Membranen und heften sich an den Boden der Vertiefungen für die Erfassung durch BLI. 
Abbildung 2: Isolierung Gewebestücke aus Kugelköpfe. (A) Extrahieren von Fragmenten von trabekulären Knochen mit einer chirurgischen Zange. (B) Histologie Fragment unmittelbar nach der Extraktion aus Femur Gewebe fixiert, die mineralisierten (weißer Pfeil) und Mark (schwarzer Pfeil) Fächer. (C) Trabecular Knochenfragmente aus zwei verschiedenen extrahiert Femurköpfe demonstrieren Variation in Rot gegen Gelb Markgehalt. 
Abbildung 3: Co-Kultivierung von Brustkrebszellen neben Knochenfragmenten zu Brustzellproliferation zu messen mit Biolumineszenz-Bildgebung. (A) Kultur Plattenaufbau zur Kokultivierung MDA-MB-231-FluC-EGFP Brustkrebszellen benachbart immobilisierten Knochenfragmenten, wie durch Pfeile angegeben: Zellflecken (Blau), Knochenwachs (schwarz), und Knochenfragment (red ). Die Position der Knochenwachs wird durch einen schwarzen gepunkteten Kreis angegeben. Die Platte wird vor der Zugabe des Mediums gezeigt. Die Top-3 Brunnen enthalten Knochenfragmente Knochenwachs und den unteren drei Brunnen angebunden enthalten nur Knochenwachs. (B) BLI der Platte bei 24 Stunden. (C) Quantifizierung von BLI Signale für MDA-MB-231-Fluc-EGFP-Zellen die in Gegenwart (violette Balken) vs. Abwesenheit (grüne Balken) Von Fragmenten aus drei THR Proben wie beschrieben kultiviert. Für jede Probe THR, Bars stellen Durchschnittswerte über 3 BLI Fragment haltigen gemessen - gegenüber 3 Kontrollvertiefungen. Dieses Ergebnis zeigt eine höhere Proliferation in Gegenwart vs. Abwesenheit von Knochenfragmenten. Fehlerbalken stellen Standardfehler (p <0,01). Mit Genehmigung 44 wiedergegeben. 
Abbildung 4: Nachweis von Brustkrebszellen direkt auf Knochenfragmente ausgesät. (A) Colonization von MCF-7-Fluc-EGFP-Zellen direkt auf Knochengewebefragmenten ausgesät wie von BLI nach 24 Stunden festgestellt, zeigt verringerte Signal mit sinkenden Aussaatdichte verbunden. (B) direkt ausgesät Fragment bei 48 Stunden nach der Aussaat, und 24 Stunden nach der Markierung mit Fluoreszenz biphosophonate Reagenz. Die Fluoreszenzmikroskopie zeigt EGFP + Brustkrebszellen alssociated mit einem mineralisierten spicule (grüner Pfeil), und Fettzellen im Markraum (weiße Pfeile). Diese Besiedlung Muster sind auch in für die immunhistochemische Färbung mit AE1 / AE3 pan-Zytokeratin-Antikörper folgenden 72 h Co-Kultur (C) und (D) verarbeitet direkt ausgesät Fragmente ergab. In (C) Cytokeratin-positiven Brustkrebszellen, die durch Pfeile bezeichnet ist, beobachtet benachbart Adipozyten im Markraum. In (D) ein Zytokeratin-positiven Brustkrebszellen beobachtet wird zu einem mineralisierten spicule angebracht. (C) und (D) wiedergegeben mit Genehmigung 44. 
Fig. 5: Messung der Migration von Brustkrebszellen zu Knochengewebefragmenten und kultivierten Knochenfragment Stände Migration von MDA-MB-231-fLuc-EGFP-Zellen in porösen Membranen Migration in Richtung Knochengewebe Kulturüberständen und in Knochenfragmente nach 24 Stunden mit BLI erkannt. (A) BLI-Signal aufschlussreich verbesserte Migration in Richtung Kulturüberständen von einem bestimmten THR abgeleiteten Proben vs. Kontrollmedium. (B ) BLI-Signal zeigt, Migrationsmuster von Brustkrebszellen in 3 Knochenfragmente aus einer einzigen Probe THR. Knochengewebe-Fragmente werden durch weiß gepunkteten Kreisen bezeichnet. Kontrollvertiefungen, enthaltend Glasperlen sind auf der Unterseite dargestellt. 
Abb. 6:. Der Nachweis von MDA-MB-231fLUC-EGFP Zellen in Kürbisse aus kolonisiert Fragmente gespült (A) Fragmente ohne (links) und mit (rechts) kolonisiert Brustkrebszellen, wie von BLI erkannt (B) Analyse der Kürbisse gespült von den Fragmenten (A) fLow-Zytometrie. EGFP-positiven Brustkrebs-Zellen in Knochenmark von der BLI-positive Fragment gespült erkannt, aber nicht die BLI-negative Fragment. (C) BLI Erkennung von Brustkrebs Zellkolonien aus der Kultur von Knochenmark von einem BLI-positive Fragment gespült resultieren. (D) Fluoreszenzmikroskopie der Markraum von einem BLI-positive Fragment gespült, zeigt MDA-MB-231fLUC-EFGP Zellen in einem Feld von Markzellen. 
Fig. 7: Mess Lebensfähigkeit Lebensfähigkeit für Markzellen von Gewebefragmenten aus 4 THR isoliert gespült Proben unmittelbar nach der Gewinnung und bei 24, 48, 72 Stunden und 6 Tagen in Kultur in DMEM-10% FBS. Das Medium wurde nach 24 und 72 h geändert wurde.
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Discussion
Mehra et al. Wurden bereits beschrieben die Obduktion Sammlung und Analyse von Knochenproben von metastasierendem Prostatakrebs-Patienten zum Zeitpunkt der Autopsie entnommen und enthüllt hochwertigen Gewebe und Validierung der Verwendung von menschlichen Knochenproben, um die metastatischen Prozess 47 zu studieren. Hier haben wir Protokolle zur Erhebung, Verarbeitung und Nutzung von menschlichen verworfen Femurköpfe folgenden THR Operation in einer kurzfristigen Co-Kultursystem, um Brustzellmigration, Ansiedlung und Vermehrung zu studieren erhalten Knochengewebefragmenten beschrieben. Ca. 300.000 Hüft-Operationen werden jährlich in den USA (American Academy of Orthopedic Surgeons; Orthoinfo.aaos.org) durchgeführt, und diese Proben werden in der Regel verworfen. Eine der häufigsten Indikationen für diese Operation ist Arthrose des Hüftgelenks, was zu allmählicher Abbau der Knorpelflächen für den Hüftkopf, die in den gemeinsamen Schmerz führt. Während der gesamten Hüfte replacemHNO-Chirurgie ein kleiner Teil der oberen Femur wird zusammen mit der Hüftkopf entfernt. Der Oberschenkel ist eine gemeinsame Website von Brustkrebs Metastasen 48, und diese Proben enthalten trabekulären Knochengewebe, die Website von metastasierendem Brustkrebs Zellbesiedlung. Die meisten Patienten, die Hüftoperation unterziehen sind 50-80 Jahre alt, eine Altersgruppe, die die Jahre der Spitzen Brustkrebs-Inzidenz Klammern. Somit sind diese Gewebe eine wertvolle Ressource für die Untersuchung der Brustkrebs Knochen metastasiertem Nische.
Es gibt einige kritische Schritte und Überlegungen mit diesen Techniken. Zunächst ist eine gute Qualität chirurgische ronguer wesentlichen zum Extrahieren der kleinen trabekulären Knochenfragmente während der Oberschenkelkopf in die entgegengesetzte, behandschuhten Hand. Zange wird nicht funktionieren, weil sie nicht stabil genug, um haltigen mineralisierten spicules Trabekelgewebe extrahieren. Ein weiterer wichtiger Aspekt in diesen Tests bezieht sich auf Brustzelllinie Handhabung und Passagieren, insbesonsondere im Hinblick auf die Migrationsassays. Die langfristigen Durchgang und / oder Variabilität der Trypsinierung Verfahren kann auf die sequentielle Auswahl von mehr / weniger zäh Zellpopulationen führen, die möglicherweise Änderung der Migrations Antworten in Experimenten. Ein weiteres Problem bezieht sich auf die Standardisierung von Experimenten, da die Variabilität von Patienten unterschiedlichen Alters und Krankheitszuständen erhalten chirurgischen Gewebe. Um dieses Problem anzugehen, nutzen wir ein intraindividuelle Versuchsanordnung, bei der alle Variablen werden dreifach getestet (zB über drei Fragmente / experimental Brunnen gegen drei Fragmente / Kontroll-Wells) mit Fragmenten aus Gewebeprobe eines bestimmten Patienten. Variablen können mit dieser Entwurf auf Proben von mehreren Patienten ein Innersubjekt Einweg-ANOVA für Daten über Replikate getestet werden, und mit Hilfe des gepaarten T-Test für die Daten gemittelt über Replikate analysiert statistische Signifikanz, und / oder. Und schließlich ein Hauptbeschränkung dieses Verfahrens ist die kurze Fenster viability während Explantatkultur.
Unsere Messungen ergaben Mark Bewohnbarkeit von ~ 90% am Tag der Erhebung, im Einklang mit Lebensfähigkeit Messungen Knochenmarkaspiraten 49 erhalten. Mit der Zeit jedoch, beobachteten wir einen allmählichen Rückgang in den Tagen zwei und drei, mit dramatischen Verlust der Lebensfähigkeit von Tag 6. Obwohl wir nicht die Tragfähigkeit des mineralisierten Raum gemessen, empfehlen qualitative Beobachtungen, dass es eine ähnliche Abnahme der Lebensfähigkeit Knochenbelag Osteoblasten und Osteozyten, wie in 4D zu sehen. Basierend auf diesen Experimenten haben wir unsere Kulturexperimenten auf Kurzzeitstudien über 48 oder 72 h durchgeführt beschränkt. Vorläufige Experimente (nicht enthalten) an, dass die Lebensfähigkeit kann mit handelsüblichen Medien formuliert, um Markzellen aufrecht verbessert werden. Wir haben jedoch nicht den Markzellpopulationen in diesen Experimenten ist, und weiß nicht, ob die verbesserten Lebensfähigkeit Ergebnisse aus dem ausgewähltenAuswuchs bestimmter Markzellpopulationen. Die Entwicklung der Protokolle zu erhalten und zu erweitern die Lebensfähigkeit dieser Explantaten wird wichtig sein, dieses Modellsystems voranzutreiben.
Obwohl dieses Modell wird auf kurze Zeiträume beschränkt, seine entscheidende Vorteile gegenüber anderen Methoden sind die folgenden Funktionen: 1) intakten 3-dimensionalen Gewebe beherbergen relevanten Zelltypen, die den menschlichen Knochenmikroumgebung, 2) Zugang zu den Knochen-Mikroumgebung für die Überwachung bilden und störenden dynamischen Wechselwirkungen, 3) eine hohe Zahl von Fragmenten pro Probe für die Wiederholungsexperimenten und 4) geringe Kosten im Vergleich zu Tiermodellen.
Während wir Assays zur Untersuchung des Brustkrebses Knochenmetastasen beschrieben, können diese Proben und Ansätze leicht auf die Untersuchung von anderen knochensuch Malignitäten wie Prostatakrebs, sowie andere Knochen-Pathologien verlängert. Wir haben den verworfen Femurköpfe vor allem als so verwendeturce der Gewebefragmente, bilden diese Proben auch eine zusätzliche Quelle von menschlichem Knochenmark, die traditionell durch Knochenmark-Aspiration von jungen Freiwilligen gesammelt. Und schließlich, während wir Ansätze unter Verwendung von Zelllinien für Biolumineszenz und Fluoreszenz entwickelt, beschrieben, die meisten der Verfahren kann für die Verwendung mit anderen Zellen verändert werden, wenn diese Zelllinien und / oder Bildgebungsplattformen sind nicht verfügbar.
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Acknowledgments
Diese Studien wurden finanziert zum Teil durch Zuschüsse aus dem Alternative Forschungs- und Entwicklungsgemeinschaft (107.588), das National Institute of Health (1U54CA136465-04S1) und dem California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Wir danken Drs. Andrew Wilber und R. Scott McIvor für die großzügige Spende ihrer
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| McCoy's 5A Medium (1X) | Life Technologies | 16600-082 | Supplement all McCoy's with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16000-044 | |
| Penicillen Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Blastocidin (10 mgl/ml) | InvivoGen | ant-bl | Supplement media used for transfected cell lines. |
| Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size) | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml) | Life Technologies | L-8220 | |
| Sterile Cell Strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Bone wax | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 Imaging Platform | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image Software Program | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL Imaging System | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 breast cancer cells | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 breast cancer cells | ATCC | HTB-26 | |
| Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody | DAKO Cytomation | Clone (AE1/AE3) |
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