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Biology

Intracellular सीए की दो photon इमेजिंग Published: June 10, 2015 doi: 10.3791/52734
Automatic Translation
1,2, 1, 4, 1,2,3, 1
1Departments of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Human and Molecular Genetics Center, Medical College of Wisconsin, 3Cardiovascular Center, Medical College of Wisconsin, 4Blood Research Institute of Wisconsin

Abstract

कैल्शियम संवहनी ऊतकों में कई शारीरिक प्रक्रियाओं का एक बहुत ही महत्वपूर्ण नियामक है। अधिकांश endothelial और चिकनी पेशी कार्यों अत्यधिक intracellular कैल्शियम ([सीए 2 +] मैं) और नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) में बदलाव पर निर्भर करते हैं। आदेश में दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ रंगों [सीए 2 +] मैं कोई और नीचे की ओर अणुओं vasoconstrictors और vasodilators के जवाब में एक रक्त वाहिका द्वारा नियंत्रित किया जाता है, हम कैल्शियम लेबलिंग लागू होता है कि एक उपन्यास तकनीक (या कोई लेबलिंग) विकसित समझने के लिए कैसे पृथक रक्त वाहिकाओं में कैल्शियम हैंडलिंग (या कोई उत्पादन) को मापने के लिए। यहाँ वर्णित एक चूहे, लेबल कैल्शियम से या सं एन्दोथेलिअल या चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के भीतर एक महाधमनी को अलग, और छवि कैल्शियम यात्रियों (या कोई उत्पादन) शारीरिक के बाद एक दो फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए दर्शाता है कि एक विस्तृत कदम दर कदम प्रक्रिया है या औषधीय उत्तेजनाओं। विधि का उपयोग कर के लाभों को कई गुना कर रहे हैं: 1) यह एक साथ करना संभव हैly के endothelial कोशिकाओं और विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं दोनों में कैल्शियम यात्रियों को मापने; 2) यह छवि endothelial कोशिकाओं और उनके मूल सेटिंग में चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को एक अनुमति देता है; 3) इस विधि intracellular कैल्शियम या कोई बदलाव नहीं है और सटीक मापन के लिए उच्च संकल्प छवियों को उत्पन्न करने के लिए बहुत ही संवेदनशील है; और 4) में वर्णित दृष्टिकोण ऐसे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के रूप में अन्य अणुओं की माप के लिए लागू किया जा सकता है। सारांश में, दो फोटॉन लेजर उत्सर्जन माइक्रोस्कोपी के आवेदन कैल्शियम यात्रियों और एक अलग रक्त वाहिनियों के endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में सं उत्पादन उच्च गुणवत्ता मात्रात्मक डेटा प्रदान की है और नाड़ी समारोह को विनियमित करने के तंत्र के बारे में हमारी समझ को बढ़ावा दिया है पर नजर रखने के लिए।

Introduction

कैल्शियम ऐसे endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के रूप में नाड़ी कोशिकाओं के भीतर एक मौलिक दूसरा दूत है। यह संवहनी संकुचन के लिए प्राथमिक प्रेरणा है और अन्तःचूचुक के भीतर कोई पीढ़ी के माध्यम से अपने प्रभाव सहित, नाड़ी फैलाव में एक प्रमुख भूमिका निभाता है। कारण इमेजिंग प्रौद्योगिकी की सीमाओं के कारण, इसे बरकरार पोत के भीतर कैल्शियम से निपटने के निरीक्षण करने के लिए लगभग असंभव हो गया है। दो photon इमेजिंग सिस्टम और नई कैल्शियम का निर्माण या कोई रंजक लेबलिंग के विकास, कैल्शियम की गतिशीलता और वाहिका संरचना के भीतर कोई उत्पादन समझने के लिए शुरू करने के लिए पर्याप्त गहराई और संकल्प पर छवि के लिए यह संभव बनाता है।

दो photon माइक्रोस्कोपी हाल ही में ऊतक, अंगों और क्योंकि गहरा कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और उच्च संकेत संवेदनशीलता के साथ ऊतकों घुसना करने के लिए अपने बेहतर करने की क्षमता की भी पूरी जानवरों के अध्ययन में लागू किया गया है। 1,2 illuminat पर दो photon उत्तेजना की संकीर्ण स्पेक्ट्रमआयन केन्द्र बिन्दु और गैर descanned डिटेक्टरों का उपयोग दो photon माइक्रोस्कोपी पारंपरिक confocal माइक्रोस्कोपी से बेहतर है क्यों कारण हैं। Confocal माइक्रोस्कोपी के कारण ऑटो प्रतिदीप्ति और confocal पिनहोल में बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश के प्रकीर्णन के लिए आवश्यक ऊतक गहराई पर उच्च गुणवत्ता के चित्र का उत्पादन नहीं कर सकते हैं। नतीजतन, हम [सीए 2 +] मैं संकेत को मापने के लिए एक दो फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक विधि और उच्च संकल्प और एक कम संकेत करने वाली शोर अनुपात के साथ बरकरार, व्यक्तिगत रक्त वाहिनियों की कोशिकाओं में सं उत्पादन विकसित किया है।

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Protocol

नीचे वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं विस्कॉन्सिन के मेडिकल कॉलेज में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) ने मंजूरी दे दी है और प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार थे।

चूहा महाधमनी के 1. अलगाव

  1. Isoflurane (5% प्रेरण, 1.5% से 2.5 अनुरक्षण) या किसी अन्य IACUC के साथ चूहों चतनाशून्य विधि को मंजूरी दे दी।
  2. एक लापरवाह स्थिति में चूहे रखें। पेट अंगों को बेनकाब करने के लिए, त्वचा और चमड़े के नीचे पेट के ऊतकों के माध्यम से एक छोटा सा उदर midline चीरा बनाते हैं। चित्र 1 में दिखाया के रूप में प्रयोग धुंध पैड धीरे महाधमनी और वेना कावा का पर्दाफाश करने के लिए आंतों मोड़ना।
  3. संक्षेप में, संयोजी ऊतक से और वेना कावा से महाधमनी काटना कुंद। गुर्दे के लिए संभव के रूप में करीब महाधमनी बंद टाई, सीवन का उपयोग करना। महाधमनी के 2 सेमी और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार टू में यह जगह - 1 के बारे में काटनासामान्य शारीरिक नमक समाधान युक्त होना (पीएसएस मिमी में: 140 NaCl, 1.2 2 MgCl, 2 2 CaCl, 4.5 KCl, 6 ग्लूकोज, 10 HEPES) बर्फ पर।
  4. महाधमनी पृथक हो जाने के बाद मंजूरी दे दी IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार पशु euthanize। सभी गैर-अस्तित्व के पूरा होने पर प्रक्रियाओं जानवर की मानवीय निधन सुनिश्चित करने के लिए वातिलवक्ष उत्प्रेरण thoracotomy के द्वारा गहराई से anaesthetized जानवरों euthanize। 3
  5. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, संदंश ठीक इत्तला दे दी है, और microscissors के महाधमनी के बंद वसा और संयोजी ऊतक काटना। महाधमनी साफ है एक बार, अनुलंबीय महाधमनी में कटौती और बाद के लिए बर्फ पर पीएसएस में जगह है।

2. डाई लोड हो रहा है और ऊष्मायन

  1. Pipet एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया गया है कि अलग-अलग 500 μl ट्यूबों में, DMSO के आधारित समाधान में आपूर्ति की है, जो 1 मिमी Fluo-04:00 डाई, के 7 μl। समय के साथ डाई को बरकरार रखने के लिए -20 सी में फ्रीजर में स्टोर। नोट: ये तो aliquotedlutions कम से कम छह महीने के लिए स्थिर होना चाहिए।
  2. उपयोग करने से पहले, डाई समाधान खोलने से पहले आरटी के लिए गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं। तुरंत उपयोग करने से पहले काम कर समाधान तैयार करें। बाद में उपयोग के लिए पतला अभिकर्मक दुकान नहीं है।
  3. कोई कैल्शियम युक्त पी एस एस के 450 उल करने के लिए DMSO के समाधान में भंग कर तैयार कर दिया है 1 मिमी Fluo-04:00 डाई के 7 μl जोड़ें। Acetoxymethyl (एएम) एस्टर फैलाने में मदद मिलेगी और कैल्शियम डाई लोड हो रहा है सुधार करने के लिए लोड हो रहा है कॉकटेल करने के लिए गैर DMSO के आधार पर 10% Pluronic एसिड समाधान के 40 μl जोड़ें।
  4. 1 घंटे के लिए (के रूप में 2.3 में वर्णित है) लोड हो रहा है कॉकटेल युक्त 500 μl ट्यूबों में विच्छेदित aortas रखें। आरटी पर एक घूर्णन प्रकार के बरतन पर पन्नी और जगह के साथ सभी ट्यूबों को कवर किया।
  5. Vasculature में सं उत्पादन पर नजर रखने के लिए, DAF-एफएम Diacetate डाई का उपयोग करें। 450 μl पीएसएस, 40 μl pluronic एसिड और 10 मिमी से DAF-एफएम Diacetate के 5 μl युक्त समाधान में महाधमनी सेते हैं। (2.3 में वर्णित) कैल्शियम ऊष्मायन प्रोटोकॉल के लिए इसी प्रकार, महाधमनी जगहआरटी पर अगले 30 मिनट के द्वारा पीछा 4 सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक घूर्णन प्रकार के बरतन पर पन्नी और जगह में शामिल नो-डाई समाधान युक्त 500 μl ट्यूब में।
  6. सं उत्पादन मापा जाता है, 4B चित्रा में दिखाया गया के रूप में एक नियंत्रण के रूप में कोई उत्पादन ब्लॉक करने के लिए, एन्दोथेलिअल सं सिन्थेज़ अवरोधक, एल नाम का उपयोग। उस प्रक्रिया के लिए, (आरटी पर) ऊष्मायन के अंतिम 30 मिनट के लिए (2.5 में वर्णित) कॉकटेल 100 एनएम एल-नाम जोड़ने के लिए।

3. लेजर स्कैनिंग दो photon माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल

  1. कोशिकी डाई दूर करने के लिए स्वच्छ पीएसएस में 3 बार - 1 घंटे ऊष्मायन के बाद, महाधमनी 2 धो लें।
  2. सामान्य पीएसएस या सीए 2 + मुक्त बफर (प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है) या तो युक्त एक सिलिकॉन लेपित डिश के लिए महाधमनी स्थानांतरण। सिलिकॉन के साथ संपर्क में बाह्यकंचुक के साथ नीचे सिलिकॉन कोटिंग पर महाधमनी पिन (यानी, पकवान खोलने के संपर्क में एन्दोथेलिअल लुमेन) μ के आकार का पिन का उपयोग कर। वैकल्पिक रूप से, एक टुकड़ा एंकर का उपयोगग्रिड या गोंद ऊतक ठीक करने के लिए।
    नोट: तनाव और संभव यांत्रिक कलाकृतियों, हस्तांतरण को कम करने और सीए में 2 + मुक्त समाधान महाधमनी को ठीक करने और 5 इंतजार करने के लिए - प्रयोग शुरू करने से पहले 10 मिनट।
  3. एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप या ड्रग्स का स्वत: या मैनुअल आवेदन के लिए या बाह्य समाधान को बदलने के लिए सिलिकॉन लेपित थाली करने के लिए एक सिरिंज कनेक्ट।
  4. ईमानदार दो photon माइक्रोस्कोप की नाक टुकड़ा नीचे पकवान प्लेस, और स्थापित करने और नमूना ऊपर एक 25 × (एनए 1.05 और काम की दूरी 2 मिमी) पानी विसर्जन उद्देश्य लेंस की स्थिति। नोट: इस विशिष्ट लेंस उपलब्ध नहीं है, तो यह एक नियमित उद्देश्य के साथ तुलना में नाटकीय रूप से संकेत संकल्प में वृद्धि कर सकते हैं, क्योंकि, विशेष रूप से दो photon इमेजिंग के लिए निर्मित एक उद्देश्य का उपयोग करें।
  5. सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दो फोटॉन लेजर सक्रिय (लेजर पंप और चालू करने के लिए शुरू होता है)। ट्यून 820 एनएम लेजर उत्तेजना।
  6. Epifluorescence का प्रयोग, महाधमनी का पता लगाने और पर ध्यान केंद्रित करने के उद्देश्यमोटे समायोजन का उपयोग कर endothelial सतह।
  7. उत्तेजना लेजर मोड बंद कर दिया, गैर descanned डिटेक्टरों लगे हुए हैं और उम्मीद है और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के लिए उपयुक्त उत्सर्जन फिल्टर स्थापित कर रहे हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए दो फोटॉन लेजर स्कैनिंग मोड में माइक्रोस्कोप स्विच करें। नोट: यहाँ, FV10-MRL / आर (495 एनएम 540 के लिए) का इस्तेमाल किया गया था।
  8. लगभग 5% लेजर शक्ति का उपयोग करते हुए लाइव स्कैनिंग शुरू और पतले endothelial कोशिकाओं कल्पना करने के क्रम में उद्देश्य ध्यान केंद्रित।
    नोट: सामान्य पीएसएस में incubated जब endothelial कोशिकाओं एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत प्रदर्शन करेंगे। वाहिकाओं कैल्शियम मुक्त बफर में incubated हैं जब यह काफ़ी कमजोर हो जाएगा। endothelial कोशिकाओं खोला महाधमनी के ऊपर और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं सिर्फ endothelial कोशिकाओं (देखें चित्र 2) के नीचे देखा जा सकता है पर उपस्थित रहेंगे। रक्त वाहिकाओं चिकनी न ही यह भी, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं दोनों मौजूद हैं स्थानों पर जहां वहाँ होगा न तो कर रहे हैं। </ ली>
  9. कोशिकाओं को ध्यान में हैं एक बार, माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर प्रोग्राम तेजी से स्कैन मोड में अनुक्रमिक छवियों (रेखापुंज स्कैन, 1.1 एस के एक फ्रेम संग्रह आवृत्ति के साथ 512 x 512 पिक्सेल विंडो) लेने के लिए। Fluo-04:00 प्रतिदीप्ति के साथ समानांतर में, पोत संकुचन में परिवर्तन का पता लगाने के लिए और बेहतर प्रयोगात्मक शर्तों कल्पना करने के क्रम में प्रकाश छवियों प्रेषित लीजिए।
  10. आधारभूत संकेत छवियों का संग्रह करने के बाद, बाहरी समाधान में सीए 2 + आयन एकाग्रता को बदलने या धीरे-धीरे क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप इमेजिंग समय का उपयोग औषधीय प्रोत्साहन एजेंटों लागू होते हैं। भरी हुई कोशिकाओं के भीतर फ्लोरोसेंट संकेत वृद्धि का निरीक्षण।
    नोट: endothelial कोशिकाओं, प्रवाह में परिवर्तन करने के लिए इस प्रकार यह सीए 2 + या सं संकेतन के औषधीय activators के आवेदन से पहले कम लामिना अनुप्रयोगों और वाहन परीक्षण का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है जवाब। Fluo-4 (Fluo-4 के लिए मैं हदबंदी निरंतर साथ भरी हुई वाहिकाओं में एनएम एकाग्रता मूल्यों के intracellular कैल्शियम पुनर्गणना के लिएएस 345 एनएम), प्रतिदीप्ति तीव्रता आधारभूत और ionomycin और MnCl 2 के अलावा के बाद दर्ज किया जा सकता है। 4

4. इमेज प्रोसेसिंग और गणना

  1. डाउनलोड करें और फिजी छवि प्रसंस्करण पैकेज स्थापित करें।
  2. फिजी में छवि फ़ाइल खोलें। जब प्रेरित फ़ाइल आयात करने पर, चैनल (प्रेषित प्रकाश और फ्लोरोसेंट संकेत) विभाजित। डेटा विश्लेषण के लिए केवल फ्लोरोसेंट संकेत का प्रयोग करें।
  3. फिजी कार्यक्रम के भीतर, विश्लेषण टैब पर क्लिक करें और उपकरणों के विकल्प के लिए नीचे स्क्रॉल। उपकरण विकल्प के तहत, रॉय प्रबंधक का कहना है कि टैब लगता है और उस पर क्लिक करें; एक नई विंडो खुलकर आएगी।
  4. इस के बाद, विश्लेषण टैब के अंतर्गत निर्धारित माप पर क्लिक करें। ब्याज की विशिष्ट माप का चयन करें। कैल्शियम क्षणिक माप के लिए, मतलब ग्रे मूल्य विकल्प का उपयोग करें।
  5. परिपत्र का पता लगाने के उपकरण के साथ, ब्याज (आरओआई) के क्षेत्रों का पता लगाने के लिए और हर R के लिए आरओआई प्रबंधक स्क्रीन पर "जोड़ें" क्लिक करने के लिए शुरूपुराना। एक बार ब्याज की सभी कोशिकाओं आरओआई प्रबंधक विंडो में, "अधिक" टैब के तहत मल्टी उपाय का चयन करें, का पता लगाया गया है। एक स्प्रेडशीट में इन मापों के सभी सीधे माप बचाने या कॉपी और पेस्ट करने के लिए या तो याद रखें।
  6. ओपन * .txt फ़ाइल या एक्सेल स्प्रेडशीट फिजी से और एक नया उत्पत्ति वर्कशीट करने के लिए संख्या हस्तांतरण। नोट: वैकल्पिक रूप से, आगे के विश्लेषण के लिए सिग्मा प्लॉट या चश्मे की तरह किसी भी कार्यक्रम का उपयोग करें।
  7. उत्पत्ति कार्यक्रम के भीतर, सब क्षणिक प्रतिक्रियाओं के एक सिंहावलोकन निरीक्षण करने के लिए लाइन + प्रतीक मेनू → प्लॉट का उपयोग करें। अनुत्तरदायी कोशिकाओं का चयन रद्द करें।
  8. समय के पैमाने (एक्स अक्ष) का पता लगाने संख्या पुनर्गणना, स्तंभ → सेट स्तंभ मान का उपयोग करें और (हमारे मामले 1.1s में) छवि संग्रह आवृत्ति को ट्रेस संख्या स्तंभ गुणा।
  9. मीन (वाई अक्ष) और मानक त्रुटि का पता लगाने की गणना करने के लिए सभी चयनित रिकॉर्डिंग के लिए पंक्तियों पर विश्लेषण → सांख्यिकी का प्रयोग करें। कोशिकाओं के मौजूदा समूह लाइन + प्रतीक → साजिश के लिए अंतिम ग्राफ साजिश।
  10. विदेश मंत्रालयबाद के रूप में एन कैल्शियम क्षणिक गणना में वर्णित है।
    1. उत्पत्ति कार्यक्रम के भीतर कुल कैल्शियम रिहाई के लिए, फिर, ग्राफ़ पर क्लिक करें मेनू विश्लेषण → पथरी का उपयोग → एकीकृत। वक्र के तहत क्षेत्र की कुल अभिन्न रिजल्ट प्रवेश में दिखाई देता है।
    2. (एक्स अक्ष क्षणिक प्रतिक्रिया का अंत करने के लिए अधिकतम से लेकर चुनें) विश्लेषण → गैर रेखीय वक्र फिट → चयन करें डाटा सेट: क्षणिक कैनेटीक्स के लिए, ग्राफ़ पर क्लिक करें, फिर मेनू का उपयोग करें। डन → घातीय क्षय 1 → चयन करें फंक्शन → फिटिंग प्रारंभ करें।
      घातीय फिटिंग ग्राफ विंडो में प्रकट होता है और प्रवेश Result: ध्यान दें। प्राप्त आंकड़ों (मान) जारी किया कैल्शियम की कुल राशि का प्रतिनिधित्व करते हैं, और चैनल के कैनेटीक्स क्षणिक प्रतिक्रिया मध्यस्थता।

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Representative Results

सही रूप में संवहनी फिजियोलॉजी (वाहिकाप्रसरण और वाहिकासंकीर्णन) करने के लिए कैल्शियम के योगदान का आकलन करने के लिए, एक प्रोटोकॉल endothelial कोशिकाओं और पृथक बरकरार aortae में चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं दोनों में कैल्शियम रंगों लोड करने के लिए डिजाइन किया गया था। चित्रा 1 में चित्रित की स्थापना की सामान्य प्रयोगात्मक, अलगाव और इमेजिंग से पहले पोत की तैयारी के लिए बुनियादी रणनीति को दर्शाता है। संक्षेप में, चूहे से महाधमनी के अलगाव के बाद, यह वसा और संयोजी ऊतक की साफ किया जाना चाहिए और अनुलंबीय भट्ठा। खोला महाधमनी तो प्रकाश कमाल के साथ 1 घंटे के लिए आरटी पर प्रोटोकॉल में वर्णित और incubated के रूप में पूर्व तैयार लोड हो रहा है कॉकटेल युक्त एक पन्नी से ढके 500 μl ट्यूब में रखा जाना चाहिए। ऊष्मायन के बाद, महाधमनी ऊपर की तरफ सिलिकॉन और लुमेन निकटतम बाह्यकंचुक के साथ एक सिलिकॉन कवर प्लेट पर नीचे टिकी, धोया जाना चाहिए, और इमेजिंग के लिए एक ईमानदार दो फोटॉन खुर्दबीन के लिए स्थानांतरित कर दिया।

Oncई महाधमनी माइक्रोस्कोप पर रखा गया है और पोत ध्यान में है, endothelial कोशिकाओं अपने मजबूत फ्लोरोसेंट उत्सर्जन (2A चित्रा) द्वारा पता लगाने के लिए आसान होना चाहिए। endothelial कोशिकाओं भी पोत नीचे टिकी है जब मुख्य रूप से endothelial कोशिकाओं से बना होता है जो पोत, के लुमेन, ऊपर की ओर का सामना करना पड़ जाना चाहिए क्योंकि ध्यान में आने के लिए सबसे पहले वस्तु हो जाएगा। Endothelial कोशिकाओं इमेजिंग के अलावा, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (चित्रा 2 बी) दिखाई दे रहे हैं जहां स्थानों की जाएगी। इस प्रकार endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं दोनों एक ही इमेजिंग क्षेत्र (चित्रा -2) में पहचाना जा सकता है। एक ही इमेजिंग के क्षेत्र के भीतर छवि दोनों संवहनी प्रकार की कोशिकाओं के लिए क्षमता वाले इन कोशिकाओं को संयुक्त रूप से, अभी तक स्वतंत्र रूप से अलग एगोनिस्ट और उत्तेजनाओं का जवाब कैसे की एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

इस पद्धति की उपयोगिता का प्रदर्शन करने के लिए, महाधमनी कोशिकाओं की माप एक के अलावा के लिए जवाबदेहीcetylcholine (ACH), विशेष रूप से अन्तःचूचुक भीतर परिवर्तन का कारण बनता है कि एक शक्तिशाली vasodilator है, निर्धारित किया गया था। चित्रा 3 ए में दिखाया गया के रूप में सामान्य पीएसएस में incubated है, जबकि endothelial कोशिकाओं को आसानी से देखा जा सकता है। Ach (3B चित्रा) के अलावा के बाद, endothelial सेल प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है इंट्रासेल्युलर कैल्शियम की मात्रा भी बढ़ती जा रही है कि यह दर्शाता है। ROIs, या endothelial कोशिकाओं से उत्सर्जित प्रतिदीप्ति की मात्रा का ठहराव, चित्रा -3 सी में दिखाया गया है। Ach के अलावा के बाद, इंट्रासेल्युलर कैल्शियम की मात्रा बढ़ जाती है तेजी से और फिर धीरे धीरे वापस आधारभूत करने के लिए देता है। ach के जवाब में endothelial कोशिकाओं के भीतर कैल्शियम में वृद्धि पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है। 5,6

कैल्शियम के अध्ययन के लिए इसी प्रकार, इस प्रोटोकॉल सं उत्पादन endothelial का पता लगाने के लिए उपयुक्त है। पर दिखाया के रूप में इन प्रयोगों के लिए, महाधमनी endothelial कोशिकाओं से DAF-एफएम Diacetate डाई के साथ भरी हुई थीचित्रा -4 ए। यह दृष्टिकोण हाल ही में ach उत्तेजना के जवाब में एक सीए 2 + निर्भर तरीके से सं उत्पादन बढ़ जाता है। 6 महत्वपूर्ण बात है, एल नाम, एक endothelial सं सिन्थेज़ अवरोध करनेवाला के साथ इलाज के बाद, इस प्रतिक्रिया (चित्रा 4 बी) ब्लॉक किया गया था कि प्रदर्शन करने के लिए उपयोग किया गया था।

इस तकनीक intracellular कैल्शियम को मापने के लिए लागू किया जा सकता है की एक अन्य प्रतिनिधि उदाहरण कैल्शियम युक्त समाधान कैल्शियम मुक्त बफर में incubated किया गया था कि एक पोत को जोड़ा गया है, जहां 1 वीडियो में दिखाया गया है। महाधमनी शुरू में (वीडियो की शुरुआत में) कैल्शियम मुक्त बफर में incubated रहे हैं, endothelial कोशिकाओं कोशिकाओं में कैल्शियम के निम्न स्तर का संकेत कमजोर फ्लोरोसेंट हैं। हालांकि, सामान्य पीएसएस के बाद इसके अलावा, कोशिकाओं तुरंत बढ़ रही है [सीए 2 +] मैं एकाग्रता और उच्च तीव्रता प्रतिदीप्ति उत्सर्जन से जवाब। इस प्रयोग कोशिकाओं को जिंदा कर रहे हैं कि पता चलता है औरबाहरी उत्तेजनाओं के लिए उत्तरदायी। इस प्रयोग को भी उच्च गुणवत्ता वाले डेटा की अपनी उपज के साथ इस पद्धति की व्यवहार्यता पुष्टि की।

चित्र 1
चित्रा 1. महाधमनी अलगाव और प्रयोगात्मक सेट अप। 1) चूहों anesthetizing के बाद, पेट में एक चीरा बनाने और संयोजी ऊतक और वेना कावा से महाधमनी अलग। 2) महाधमनी की निकासी के बाद, वसा और संयोजी ऊतक के पोत को साफ और अनुलंबीय काटने से पोत खुला। 3) मामूली कमाल के साथ आरटी पर 1 घंटे के लिए Fluo-04:00 डाई में पोत को सेते हैं। 4) ऊष्मायन के बाद, महाधमनी धोने ऊपर की ओर का सामना करना पड़ लुमेन, एक सिलिकॉन लेपित थाली पर यह पिन, और एक ईमानदार दो photon खुर्दबीन के मंच को हस्तांतरण। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. इमेजिंग चिकनी मांसपेशियों और endothelial कोशिकाओं। कैल्शियम-डाई की पर्याप्त लोड करने के बाद, यह चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं दोनों छवि के लिए संभव है। (ए) के ऊपर एक अलग चूहे महाधमनी में endothelial कोशिकाओं के Fluo 4 प्रतिदीप्ति का एक उदाहरण है। नीचे, एक फ्लोरोसेंट छवि (इसी प्रकार बी और सी के लिए) प्रेषित प्रकाश को देखने के साथ विलय कर दिया है। (बी), एक अलग चूहे महाधमनी में चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के Fluo 4 प्रतिदीप्ति का एक उदाहरण है। कारण महाधमनी के गैर वर्दी मोटाई के लिए (सी), यह चिकनी मांसपेशियों और endothelial कोशिकाओं दोनों मौजूद हैं, जहां छवि क्षेत्रों के लिए भी संभव है। स्केल सलाखों दिखाए जाते हैं। का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा।

चित्र तीन
Ach के जवाब में endothelial कोशिकाओं में कैल्शियम यात्रियों मापने चित्रा 3.। (ए) महाधमनी शुरू में तैयार किया है और आधारभूत रिकॉर्डिंग के लिए सामान्य पीएसएस बफर में incubated किया गया था। एसीटाइलकोलीन (ACH), कोशिकाओं के भीतर कैल्शियम के बढ़ते स्तर का संकेत बढ़ाया endothelial कोशिकाओं (ROIs) द्वारा उत्सर्जित फ्लोरोसेंट संकेत के अलावा के बाद (बी)। स्केल बार दिखाया गया है। (सी) Ach के जवाब में endothelial कोशिकाओं की कैल्शियम यात्रियों की उत्पत्ति सॉफ्टवेयर का उपयोग कर की गणना की गई। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4endothelial कोशिकाओं में आर /> चित्रा 4. इमेजिंग नाइट्रिक ऑक्साइड। (ए) से DAF-एफएम Diacetate डाई के साथ महाधमनी लोड हो रहा है और एक दो फोटॉन खुर्दबीन के मंच पर रखने के बाद, यह छवि के लिए endothelial कोशिकाओं के भीतर कोई स्तर संभव है उत्सर्जित प्रतिदीप्ति का उपयोग कर। (बी) एन्दोथेलिअल सं सिन्थेज़ अवरोध करनेवाला, एल नाम के साथ ऊष्मायन के बाद, समग्र प्रतिदीप्ति कोशिकाओं के भीतर नहीं के कम स्तर का संकेत है, ROIs के भीतर कम किया है। स्केल बार दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1
कैल्शियम concentratio में बदलाव के लिए Endothelial सेल जवाबदेही का वीडियो 1. उदाहरणएन। Fluo-04:00 डाई में तैयारी और ऊष्मायन के बाद, महाधमनी कैल्शियम मुक्त बफर के साथ धोया और एक दो फोटॉन खुर्दबीन के मंच पर रखा गया था। पोत कैल्शियम मुक्त बफर में रखा जाता है, endothelial कोशिकाओं के सबसे कमजोर फ्लोरोसेंट हैं। सामान्य पीएसएस के अलावा के बाद, endothelial कोशिकाओं intracellular कैल्शियम एकाग्रता बढ़ती है और एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत उत्सर्जन से जवाब।

वीडियो 2
वीडियो isoltated चूहे महाधमनी के endothelial कोशिकाओं। में सं उत्पादन 2. उदाहरण DAF-एफएम Diacetate डाई में तैयारी और ऊष्मायन के बाद, महाधमनी एक दो फोटॉन खुर्दबीन के मंच पर रखा गया था। स्नान समाधान करने में Ach के अलावा के बाद, endothelial कोशिकाओं इंट्रासेल्युलर एन वृद्धि से जवाबहे उत्पादन और एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत उत्सर्जन। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रायोगिक अवलोकन। बेहतर नाड़ी शरीर विज्ञान के लिए कोई कैल्शियम के योगदान को समझने और करने के लिए, एक उपन्यास विधि को मापने के लिए विकसित किया गया था [सीए 2 +] मैं और कोई चिकनी मांसपेशियों और पृथक बरकरार aortas के endothelial कोशिकाओं के भीतर। 1) यांत्रिक अलगाव और तैयारी (एंजाइमी नहीं पाचन) पोत की: साथ में, इस प्रोटोकॉल इन महत्वपूर्ण कदम के होते हैं। यह इष्टतम शारीरिक रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए संभव के रूप में ज्यादा के रूप में स्वस्थ और बरकरार ऊतक रखने के लिए महत्वपूर्ण है। Pluronic एसिड के साथ 2) कैल्शियम लेबलिंग डाई में ऊष्मायन है या नहीं, लेबलिंग डाई कुछ अन्य जहाजों प्रकार के लिए, एक अलग pluronic एसिड और ऊष्मायन समय परीक्षण किया जा करने की आवश्यकता हो सकती है, तथापि, महत्वपूर्ण है। ग्रिड और पिन के साथ सिलिकॉन लेपित डिश के लिए महाधमनी के 3) उचित निर्धारण दो फोटॉन खुर्दबीन के साथ इमेजिंग के दौरान एक स्थिर दृश्य प्रदान करेगा। पोत कसना और चौड़ा करना होगा, क्योंकि वह पोत prope है कि सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैरेलवे पैदा हो सकता है कि आंदोलन कलाकृतियों से बचने के लिए डिश के लिए तय की। परिणामों की 4) मात्रा। क्षणिक आयाम हमेशा कोशिकाओं की शारीरिक विशेषताओं की तुलना करने के लिए सबसे अच्छा पैरामीटर नहीं हो सकता है कि कृपया ध्यान दें। क्षणिक का अभिन्न कारण कुल [सीए 2 +] मैं या नहीं रिलीज करने के लिए एक बेहतर फर्क दिखा सकते हैं।

प्रयोगों के सही ढंग से प्रदर्शन कर रहे हैं, यह नजर रखने के लिए संभव है [सीए 2 +] मैं (या कोई स्तर) वीडियो 1 और 2। एक पूर्व vivo तैयारी के संयोजन के आंकड़े 3 व 4 और रूप में दिखाया गया उत्तेजनाओं के जवाब में परिवर्तन और दो photon इमेजिंग के उपयोग के बेहतर संकेत संकल्प और संवहनी ऊतकों में intracellular प्रक्रियाओं की सटीक मापन प्रदान कर सकते हैं। इधर, इन प्रौद्योगिकियों शास्त्रीय गैर ratiometric सीए 2 + और ​​कोई संकेतक (Fluo-4 बजे और DAF-एफएम Diacetate, क्रमशः) के साथ संयोजन में लागू किया गयाकैल्शियम यात्रियों और एक पृथक पूरे महाधमनी के व्यक्ति की कोशिकाओं में सं उत्पादन को मापने। हम इस तकनीक तंत्र विनियमन के बारे में हमारे ज्ञान को आगे करने में मदद मिलेगी का मानना ​​है कि [सीए 2 +] मैं और विभिन्न संवहनी प्रकार की कोशिकाओं के भीतर कोई स्तरों।

संशोधन और समस्या निवारण। संवेदनशील ionophores साथ ही चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में सीए 2 + संकेतन को मापने के बुनियादी सिद्धांतों के शुरू में 1985 में प्रकाशित किया गया था 7 एक लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन और पृथक कार्यरत है सीए व्यक्ति नाड़ी कोशिकाओं में 2 + स्तरों इमेजिंग के लिए हाल के तरीकों में से अधिकांश या सुसंस्कृत तैयारी। रक्त वाहिकाओं की तरह गतिशील ऊतकों के लिए, यह कैल्शियम या माइक्रोस्कोपी आधारित तकनीक का उपयोग vivo में कोई स्तर को मापने के लिए मुश्किल है। 2 यहाँ मुख्य सीमा परिसंचरण की धमनी पक्ष पर लगभग सभी रक्त वाहिकाओं के बीच स्थित है कि एक आंतरिक लोचदार पटल है endotहीलियम और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के सबसे भीतरी परत। 8 इसके अलावा, चिकनी मांसपेशियों और बाह्यकंचुक परत के बीच बाह्य सामग्री के अधिकांश। Elastin 8 कोलेजन और कोलेजन उच्च तीव्रता और उत्तेजना तरंग दैर्ध्य की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ ऑटो प्रतिदीप्ति का एक प्रमुख स्रोत हैं । confocal इमेजिंग के दौरान वृद्धि हुई रोशनी बिखरने के साथ युग्मित मजबूत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम संकेत संकल्प और कैल्शियम संकेतन या सं उत्पादन की इसलिए, कम पता लगाने पैदा करता है। सार्थक मापन करने के लिए पर्याप्त मात्रा में नाड़ी कोशिकाओं में लोड हो रहा है फ्लोरोसेंट जांच की सीमित कारक ऐसे समय पर प्रतिदीप्ति का उत्सर्जन करता है जो Asante लाल, के रूप में ionophores, का एक नया वर्ग एक पूर्व vivo तैयारी, एक दो फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग, और लागू करने के द्वारा हल किया जा सकता संयोजी ऊतक और फाइबर के ऑटो प्रतिदीप्ति से कम हस्तक्षेप है, जहां तरंग दैर्ध्य,। हालांकि, इस पद्धति का मुख्य सीमाओं में से एक यह अलग है कि हैइमेजिंग के दौरान दो या दो से अधिक रंगों के संयोजन करने के लिए ficult। दो photon इमेजिंग के लिए उपलब्ध रंगों से ज्यादातर के लिए उत्तेजना स्पेक्ट्रम एक साथ दो अलग ionophores को मापने के लिए यह मुश्किल बनाने के लिए जो विस्तृत, polymodal वितरण विशेषताओं, है। हालांकि, कम शोर संकर डिटेक्टरों ionophores अलग तरंग दैर्ध्य में प्रकाश का उत्सर्जन यह सोचते हैं कि पता चला उत्सर्जन स्पेक्ट्रम संकीर्ण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह वर्णित प्रक्रिया में यह उत्सर्जन स्पेक्ट्रम ओवरलैप नहीं है क्योंकि उत्पादन और सीए 2 + एकाग्रता परिवर्तन दोनों को मापने के लिए संभव नहीं है।

रक्त प्रवाह के साथ सीधे संपर्क में हैं कि संवहनी endothelial कोशिकाओं द्रव कतरनी तनाव से अवगत कराया और नाड़ी homeostasis को विनियमित। 9 वर्तमान पद्धति का भी प्रवाह प्रेरित कैल्शियम यात्रियों और endothelial कोशिकाओं पूर्व vivo में सं उत्पादन पर नजर रखने के लिए लागू किया जा सकता है कर रहे हैं। साथ ही, इस पद्धति को सफलतापूर्वक सीए 2 + concentra का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता हैगुर्दे से निकाले छोटे प्रतिरोध धमनियों की चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में tion बदल जाता है। इस मामले में, विच्छेदित छोटे प्रतिरोध धमनियों के कारण सीए 2 + अधिभार के लिए चिकनी मांसपेशी कोशिका क्षति से बचने के लिए सीए में 2 + मुक्त समाधान incubated किया जाना चाहिए। इस संशोधन भी कोशिका मृत्यु को कम करने के लिए महाधमनी के लिए लागू किया जा सकता है।

परिप्रेक्ष्य। प्रतिदीप्ति आधारित इमेजिंग व्यापक रूप से इन विट्रो में सेलुलर फिजियोलॉजी अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, पृथक सेल मॉडल हमेशा कोशिकाओं उनके पैतृक माहौल में रहे होते हैं कि जब शारीरिक प्रक्रियाओं पुनरावृत्ति नहीं है। यहाँ वर्णित के रूप में यह। शोधों के लिए 10 सेल लाइनों की प्रयोज्यता सीमित है अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ सभी स्थानीय शारीरिक प्रक्रियाओं और बातचीत अभी भी उत्पन्न कर रहे हैं, जहां पूर्व vivo तैयारी के उपयोग हमें हौसले से अलग ऊतकों में सेलुलर व्यवहार पर नजर रखने का अवसर दिया गया है । आनुवंशिक उद्योगों की बढ़ती संख्या के साथeering उपलब्ध प्रौद्योगिकियों और मानव रोगों पुनरावृत्ति कि मॉडल का विकास, पूर्व vivo तैयारी के शोधों के लिए एक उपयोगी उपकरण हो जाएगा। यहाँ वर्णित अध्ययन के लिए, डाहल नमक के प्रति संवेदनशील (एस एस / JrHsdMcwi) उच्च रक्तचाप से ग्रस्त चूहा तनाव इस्तेमाल किया गया था। एसएस चूहे प्रगतिशील मानव उच्च रक्तचाप के कई पहलुओं का स्मरण दिलाता है कि नमक के प्रति संवेदनशील उच्च रक्तचाप के एक स्वाभाविक रूप से होने वाली जन्मजात आनुवंशिक मॉडल है। इस मॉडल को बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया जा रहा है और इस चूहे मॉडल के साथ नमक संवेदनशीलता और नाड़ी में शिथिलता। 11-13 अंतर्निहित तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है, शोधकर्ताओं ZFNs का उपयोग कर (हाइपरटेंशन) की तरह जटिल रोगों के लिए कुंजी तंत्र के योगदान को परीक्षण करने के लिए सक्षम किया गया है , इन जीन-संपादन संसाधनों के साथ यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रिया का उपयोग करना TALENS, और CRISPR / कैस आधारित जीन-संपादन प्रौद्योगिकियों। 6,14-17, यह नमक के लिए कैल्शियम और अन्य महत्वपूर्ण कारकों का योगदान परीक्षण शुरू करने के लिए अब संभव है -sensitiveउच्च रक्तचाप और कई अलग अलग पशु मॉडल में संवहनी में शिथिलता।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

हम इमेजिंग अध्ययन के साथ मदद के लिए डॉ विलियम Cashdollar, और विस्कॉन्सिन के रक्त अनुसंधान संस्थान में नॉर्थवेस्टर्न म्युचुअल फाउंडेशन इमेजिंग सेंटर धन्यवाद। हम भी इस पांडुलिपि और उपयोगी चर्चा के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ दारिया Ilatovskaya धन्यवाद। इस अध्ययन (के रूप में करने के लिए) स्वास्थ्य अनुदान HL108880 के राष्ट्रीय संस्थानों और (एएमजी को) DP2-OD008396 द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAF-FM Life Technologies D-23842
Fluo-4 AM Life Technologies F14217 500 µl in DMSO
Pluronic F-68 solution Sigma-Aldrich P5556
L-NAME Tocris 0665
Olympus upright microscope Olympus Fluoview FV1000
MaiTai HP DeepSee-OL  Spectra Physics Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm
Filters Olympus FV10-MRL/R  495 to 540 nm 
25× water-immersion objective lens Olympus XLPL25XWMP N.A. 1.05 and working distance 2 mm
Slice Anchor grid  Warner Instrument  SHD-27LH
Other basic reagents  Sigma-Aldrich

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References

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 100 दो photon माइक्रोस्कोपी प्रतिदीप्ति वाहिका intracellular कैल्शियम fluo-4 बजे नाइट्रिक ऑक्साइड DAF-एफएम महाधमनी चूहा
Intracellular सीए की दो photon इमेजिंग<sup&gt; 2 +</sup&gt; एक अलग चूहा महाधमनी के रख रखाव और endothelial में नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं
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Endres, B. T., Staruschenko, A.,… More

Endres, B. T., Staruschenko, A., Schulte, M., Geurts, A. M., Palygin, O. Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta. J. Vis. Exp. (100), e52734, doi:10.3791/52734 (2015).

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