Abstract
Kalsium er en meget viktig regulator for mange fysiologiske prosesser i vaskulære vev. De fleste endoteliale og glatte muskelceller funksjoner sterkt avhenge av forandringer i intracellulært kalsium ([Ca2 +] i) og nitrogenoksid (NO). For å forstå hvordan [Ca 2+] i, NO og nedstrøms molekyler håndteres av en blodåre som svar på vasoconstrictors og vasodilatorer, har vi utviklet en ny teknikk som gjelder kalsium-merking (eller NO-merking) fargestoffer med to foton mikroskopi å måle kalsium håndtering (eller NO-produksjon) i isolerte blodkar. Beskrevet her er en detaljerte trinn-for-trinn fremgangsmåte som demonstrerer hvordan å isolere en aorta fra en rotte, etikett kalsium eller NO i løpet av de endoteliale og glatte muskelceller, og bilde kalsium-transienter (eller NO-produksjon) ved hjelp av en to-foton mikroskop følgende fysiologiske eller farmakologiske stimuli. Fordelene med å bruke metoden er multi-fold: 1) er det mulig å samtidigly måle kalsium transienter i både endotelceller og glatte muskelceller som respons på forskjellige stimuli; 2) det gjør det mulig å image endotelceller og glatte muskelceller i sitt eget setting; 3) denne metoden er svært følsom for intracellulær kalsium eller ingen endringer og genererer høyoppløselige bilder for nøyaktige målinger; og 4) beskrevne metode kan anvendes til måling av andre molekyler, slik som reaktive oksygenarter. I sammendrag, til påføring av to foton laseremisjon mikros overvåke kalsium transienter og NO-produksjon i endotelceller og glatte muskelceller i en isolert blodkar har gitt høy kvalitet kvantitative data og fremmet vår forståelse av mekanismene som regulerer vaskulær funksjon.
Introduction
Kalsium er en fundamental andre budbringer i vaskulære celler som endotelceller og glatte muskelceller. Det er den primære stimulus for vaskulær kontraksjon og spiller en viktig rolle i vaskulær dilatasjon, inkludert dens virkninger gjennom ingen generasjon innen endotelet. På grunn av begrensninger av avbildningsteknologi, har det vært praktisk talt umulig å observere kalsium håndtering inne i intakt kar. Utviklingen av to foton imaging-systemer og etablering av nye kalsium eller ingen merking fargestoffer, som gjør det mulig å avbilde på en tilstrekkelig dybde og oppløsning for å begynne å forstå kalsiumdynamikk og NO produksjon innenfor blodkar.
To fotonmikroskopi har nylig blitt anvendt i vev, organer og til og med hele dyrestudier på grunn av sin overlegne evne til å penetrere dypt vev med lav bakgrunnsfluorescens og høy signalfølsomhet. 1,2 Den smale spekteret av to foton-eksitasjon ved illumination Brennpunkt og bruk av ikke-descanned detektorer er årsakene til at to foton mikroskopi er bedre enn tradisjonell konfokalmikroskopi. Konfokalmikroskopi kan ikke produsere bilder av høy kvalitet på den nødvendige vev dybde på grunn av auto-fluorescens og spredning av ut-av-fokus lys inn i konfokale pinhole. Vi har derfor utviklet en metode under anvendelse av en to-foton mikroskop for å måle [Ca2 +] signalering og NO-produksjon i intakte blodkar, individuelle celler med høy oppløsning og et lavt signal-støy-forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De eksperimentelle prosedyrer som er beskrevet nedenfor ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Medical College of Wisconsin og var i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.
1. Isolering av Rat Aorta
- Bedøve rotter med isofluran (5% induksjon, 1,5 til 2,5% vedlikehold) eller en annen IACUC godkjent metode.
- Plasser rotte i liggende stilling. For å avdekke abdominal organer, lage et lite ventral midtlinjen snitt gjennom huden og det subkutane abdominal vev. Bruke gasbind pads forsiktig bøye tarmen å avsløre aorta og vena cava som vist i figur 1.
- Kort, sløv dissekere aorta fra bindevev og fra vena cava. Ved hjelp av sutur, feste aorta så nær som mulig til nyrene. Dissekere ca 1 - 2 cm av aorta og legg den i en 15 ml konisk tuvære inneholdende normal fysiologisk saltløsning (PSS, i mM: 140 NaCl, 1,2 MgCl2, 2 CaCl2, 4,5 KCl, 6 glukose, 10 HEPES) på is.
- Når aorta isolert, avlive dyret i henhold til godkjente IACUC protokoller. Ved ferdigstillelse av alle ikke-overlevelse prosedyrer avlive dypt anestiserte dyr ved torakotomi indusere pneumothorax å sikre human død av dyret. 3
- Ved hjelp av en disseksjon mikroskop, fin-tipped tang, og microscissors dissekere fett og bindevev ut av aorta. Når aorta er ren, skjær aorta på langs og legg den i PSS på is for senere.
2. Dye Lasting og Inkubasjon
- Pipetter 7 ul av 1 mM Fluo-4 AM fargestoff, som tilføres i DMSO-basert løsning, i individuelle 500 pl rør som er dekket med aluminiumsfolie. Lagre i fryseren ved -20 ˚C å bevare fargeegenskaper over tid. Merk: disse alikvoteres sånologi bør være stabil i minst seks måneder.
- Før bruk, lar fargestoff løsninger for å varme opp til romtemperatur før den åpnes. Forberede arbeidsløsninger umiddelbart før bruk. Ikke oppbevar fortynnet reagens for senere bruk.
- Legg 7 mL av ferdiglaget 1 mM Fluo-4 AM fargestoff oppløst i DMSO-oppløsning til 450 ul av PSS som ikke inneholder noe kalsium. Legg 40 ul av non DMSO basert 10% Pluronic syreoppløsning til laste cocktail for å bidra til å spre acetoksymetyl- (AM) estere og forbedre lasting av kalsium fargestoff.
- Plasser de dissekerte Aorta inn i 500 pl rør inneholdende laste cocktail (som beskrevet i 2.3) i 1 time. Dekk alle rør med folie og legg på en roterende shaker på RT.
- Slik overvåker NO produksjon i blodkar, bruker DAF-FM diacetate fargestoff. Inkuber aorta i en oppløsning inneholdende 450 ul PSS, 40 pl Pluronic syre og 5 pl 10 mM DAF-FM-diacetat. Ligner på kalsium inkubasjon protokollen (beskrevet i 2.3), plasser aortai en 500 pl rør inneholdende NO-fargestoff oppløsning dekket med folie og sted på en roterende ryster i 30 minutter ved 4 C, etterfulgt av 30 min ved RT.
- Når NO-produksjon måles ved å bruke endotelial NO-syntase blokkering, L-NAME, for å blokkere NO-produksjon som en kontroll som vist i figur 4B. For at prosedyren, legge til cocktail (som beskrevet i 2.5) 100 nM L-NAME for de siste 30 min av inkubasjon (ved romtemperatur).
3. Laserskanning To foton Mikros Protocol
- Etter 1 time inkubering, vaskes aorta 2 - 3 ganger i rent PSS å fjerne ekstracellulære fargestoff.
- Overfør aorta til en silikonbelagt fatet inneholder enten normal PSS eller Ca 2+ -fri buffer (avhenger av forsøksprotokoll). Pin aorta ned på silikonbelegg med adventitia i kontakt med silikon (dvs. endotel lumen utsatt for fatet åpning) ved hjelp av μ-formete pinner. Alternativt kan du bruke en Slice Anchorrutenett eller lim for å fikse vev.
Merk: For å redusere stress og mulige mekaniske gjenstander, overføring og fikse aorta i Ca 2+ -Gratis løsning og vent 5-10 minutter før du starter forsøket. - Koble en peristaltisk pumpe eller sprøyte til silikonbelagt plate for automatisk eller manuell bruk av narkotika eller for å endre ekstracellulære løsningen.
- Sett fatet under nesen stykke oppreist to-foton mikroskop, og installere og plassere en 25 × (NA 1,05 og arbeidsavstand 2 mm) vann-nedsenking objektiv over prøven. Merk: Hvis dette spesifikke objektivet ikke er tilgjengelig, kan du bruke et objektiv spesielt produsert for to foton bildebehandling, fordi det kan øke signaloppløsningen dramatisk sammenlignet med en vanlig objektiv.
- Aktiver to foton laser bruke programvaren (laseren begynner å pumpe og slå på). Tune laser eksitasjon til 820 nm.
- Bruke epifluorescence, finn aorta og fokus målet påendoteloverflaten ved hjelp av grovjustering.
- Slå mikroskopet i to foton laserskanning modus, slik at eksitasjon laser modus låst, ikke-descanned detektorer er engasjert og emisjonsfiltre som passer til forventet emisjonsspekter er installert. Merk: Her ble den FV10-MRL / R (495-540 nm) som brukes.
- Start Live skanning med ca 5% laser makt og fint fokusere mål for å visualisere endotelceller.
Merk: endotelceller vil oppvise en sterkt fluorescerende signal når inkubert i normal PSS. Dette vil være merkbart svakere når fartøyene inkuberes i kalsium-free buffer. Endotelcellene vil være tilstede på toppen av den åpnede aorta og de glatte muskelceller kan ses like under endotelcellene (se figur 2). Fordi blodårer er ikke jevn og jevn, vil det være steder hvor begge glatte muskelceller og endotelceller er til stede. </ Li> - Når cellene er i fokus, til program mikroskop programvaren samle sekvensielle bilder i rask skannemodus (rasteravsøks, 512 x 512 pikslers vindu med en ramme samling frekvens på 1,1 s). Parallelt med Fluo-4 AM fluorescens, samle overført lys bilder for å detektere endringer i fartøyets sammentrekning og bedre visualforsøksbetingelsene.
- Etter innsamling av grunnlagssignal bilder, endre Ca 2+ ion konsentrasjonen i det ytre løsning eller sakte gjelder farmakologiske stimulansemidler hjelp av peristaltiske pumpen mens bildebehandling. Observere fluorescerende signal økning innenfor lastet cellene.
Merk: Endotelceller reagere på endringer i flyten, slik at det er anbefalt å bruke lave laminat applikasjoner og kjøretøy testing før påføring av farmakologiske aktivatorer av Ca 2+ eller NEI signalering. For å beregne intracellulær kalsium til NM konsentrasjonsverdier i skip lastet med Fluo-4 (dissosiasjonskonstanten for Fluo-4 is 345 nM), kan fluorescens intensitet bli registrert ved baseline og etter tilsetting av ionomycin og MnCl2. 4
4. Bildebehandling og beregninger
- Last ned og installer Fiji bildebehandling pakken.
- Åpne bildefilen i Fiji. Ved import av filen, splitte kanalene (overført lys og fluorescerende signal) når du blir bedt. Bruk bare det fluorescerende signal for dataanalyse.
- Innenfor Fiji program, klikk på analysere og bla ned til verktøy alternativet. Under verktøy alternativet, finner fanen som sier ROI leder og klikk på den; et nytt vindu vil vises.
- Etter dette, klikk på faste målinger under analysere kategorien. Velg de konkrete målinger av interesse. For kalsium forbigående målinger, bruke middelverdien grå verdi opsjon.
- Med den sirkulære kurveverktøyet begynne å spore regioner av interesse (ROI) og klikk "Legg til" på ROI leder skjermen for hver ROI. Når alle cellene i området har blitt sporet, i ROI leder vinduet, velg Multi Mål under "mer" -kategorien. Husk å enten lagre målingene direkte eller kopiere og lime inn alle disse målingene i et regneark.
- Åpne * .txt-fil eller Excel regneark fra Fiji og overføre tallene til en ny Origin regneark. Merk: Alternativt kan du bruke en hvilken som helst program som Sigma Plot eller Prism for videre analyse.
- Innenfor Origin-programmet, bruker Plot → Linje + Symbol menyen for å observere en oversikt over alle forbigående reaksjoner. Velge bort de svarer celler.
- Omberegne spor nummer til annen skala (X-aksen), bruker Kolonne → Still kolonneverdier og formere sporingsnummeret kolonnen til bildesamlingen frekvens (i vårt tilfelle 1.1s).
- Bruk Analyse → Statistikk på Rows for alle valgte innspillinger å beregne Mean (Y-aksen) og Standard Error spor. Plot endelige grafen for gjeldende gruppe av celler Plot → Linje + Symbol.
- Den mean kalsium transient beregningen er beskrevet som følger.
- For total kalsium utgivelse i Origin-programmet, klikk på grafen, deretter bruke menyen Analyse → Kalkulus → Integrere. Total integrert av arealet under kurven vises i Resultat Log.
- For forbigående kinetikk, klikk på grafen, deretter bruke menyen: Analyse → Ikke-lineær Curve Fit → Velg Data Set (velg X-aksen varierer fra maksimum til slutten av transient respons). Begynn Fitting → Select Function → eksponentiell 1 → Done.
Merk: Eksponentiell montering vises i grafen vinduet og resultatlogg. Oppnådde data (verdier) representerer total mengde kalsium frigitt, og kinetikken til kanalene mediert transient respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å kunne vurdere presist bidraget av kalsium til vaskulær fysiologi (vasodilatasjon og vasokonstriksjon), ble en protokoll utviklet for å laste kalsiumfargestoffer inn i både endotelceller og glattmuskelceller i aorta isolert intakt. Den generelle eksperimentelle oppstilling er vist i figur 1, viser den grunnleggende strategi for isolering og fremstilling av fartøyet før avbildning. I korthet, etter isolering av aorta fra rotte, bør renses for fett og bindevev og oppslisses i lengderetningen. Den åpnede aorta bør da plasseres i en folie-dekket 500 pl rør inneholdende den tidligere klare for lasting cocktail som beskrevet i protokollen og inkubert ved RT i 1 time med lys vugging. Etter inkubering bør aorta vaskes, holdt fast på et silikonbelagt plate med adventitia nærmest silikon og lumen oppover, og overføres til en oppreist to foton mikroskop for avbildning.
Once aorta har blitt plassert på mikroskopet, og fartøyet er i fokus, bør endotelcellene være lett å finne ved deres sterke fluorescensemisjon (figur 2A). Endotelcellene vil også være det første objektet å komme i fokus på grunn lumen av fartøyet, som hovedsakelig består av endotelceller, skal vende oppover når skipet er festet ned. I tillegg til bildebehandlings endotelceller, vil det være steder hvor glatte muskelceller er synlige (figur 2B). Således både endotelceller og glatte muskelceller kan identifiseres innenfor den samme bildefelt (figur 2C). Etter å ha evnen til å bilde både vaskulære celletyper i samme bildefelt kan føre til en bedre forståelse av hvordan disse cellene i fellesskap, men uavhengig av hverandre, svare til forskjellige agonister og stimuli.
For å demonstrere nytten av denne fremgangsmåten, målinger av aorta-celler som respons på tilsetningen av encetylcholine (ACh), en potent vasodilator som spesielt fører til endringer i endotelet, ble bestemt. Som vist i figur 3A, kan endotelcellene er lett å se mens inkubert i normal PSS. Etter tilsetning av ACh (figur 3B), endothelial celle fluorescens øker noe som indikerer at intracellulært kalsiuminnhold er også økende. Kvantifiseringen av den emitterte fluorescens fra ROIs, eller endotelceller, er vist i figur 3C. Etter tilsetning av ACh, de intracellulære kalsiuminnholdet øker returnerer hurtig og deretter langsomt tilbake til grunnlinjen. Økningen i kalsium i endotelceller som svar på ACh er forenlig med tidligere rapporter. 5,6
I likhet med kalsium studier, er denne protokoll egnet for deteksjon av endotel NO-produksjonen. For disse eksperimentene ble aorta-endotelceller lastet med DAF-FM-diacetat fargestoff som vistFigur 4A. Denne tilnærmingen ble nylig brukt til å vise at ingen produksjonsøkning i en Ca 2+ -avhengig måte i respons til ACH stimulering. 6 Viktigere, etter behandling med L-NAME, en endotelial NO syntasehemmer, dette svaret var blokkert (Figur 4B).
Et annet representativt eksempel på hvordan denne teknikken kan brukes til å måle intracellulær kalsium er vist i bilde 1, hvor kalsiumholdige oppløsning ble satt til et kar som ble inkubert i kalsium-fri buffer. Når aorta blir først inkubert i kalsium fri buffer (ved begynnelsen av videoen), endotelceller er svakt fluorescerende indikerer lave nivåer av kalsium i cellene. Imidlertid, etter tilsetning av normal PSS, cellene umiddelbart reagere ved å øke [Ca2 +] konsentrasjon og mitterende høy intensitet fluorescens. Dette forsøk viser at cellene er i live ogreagerer på ytre stimuli. Dette forsøk bekrefter også levedyktigheten til denne metoden med utbyttet av data av høy kvalitet.
Figur 1. Aorta Isolasjon og eksperimentell Set Up. 1) Etter bedøvelse rottene, gjør et snitt i buken og isolere aorta fra bindevev og vena cava. 2) Etter ekstraksjon av aorta, rense beholderen for fett og bindevev og åpne beholderen ved å kutte i lengderetningen. 3) Inkuber fartøyet i Fluo-4 AM fargestoff i 1 time ved RT med svak vugging. 4) Etter inkubasjon vaske aorta, fest den med en silikonbelagt plate, lumen vendt oppover, og overføre den til scenen av en oppreist to-foton mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Imaging glatt muskulatur og endotelceller. Etter at tilstrekkelig mengde av kalsium-fargestoff, er det mulig å avbilde begge glatte muskelceller og endotelceller. (A) Top, er et eksempel på Fluo 4 fluorescens av endotelceller i en isolert rotte-aorta. Bunn, er en fluoriserende bilde fusjonert med gjennomfallende lys vis (tilsvarende for B og C). (B), er et eksempel på Fluo 4 fluorescens av glatte muskelceller i en isolert rotte-aorta. (C) på grunn av ikke-uniform tykkelse av aorta, er det også mulig å avbilde regioner hvor både glatt muskulatur og endotelceller er tilstede. Skala barer vises. Klikk her for å se en større versjon avdette tallet.
Figur 3. Måle Kalsium transienter i endotelceller i Response til ACH. (A) Aorta ble opprinnelig utarbeidet og inkuberes i normal PSS buffer for baseline opptak. (B) Etter tilsetning av acetylkolin (ACh), den fluorescerende signal som utsendes av endotelcellene (ROIs) Forbedret indikerer økende nivåer av kalsium i cellene. Scale bar vises. (C) De kalsium transienter av endotelcellene i respons til Ach ble beregnet med Origin-programvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Imaging nitrogenoksid i endotelceller. (A) Etter lasting av aorta med DAF-FM diacetate fargestoff og plassere den på scenen av en to foton mikroskop, er det mulig å avbilde INGEN nivåer i endotelcellene bruker slippes fluorescens. (B) Etter inkubering med endotel NO syntase inhibitor, L-NAME, den totale fluorescens ble redusert i løpet av de ROIs, som indikerer reduserte nivåer av NO i cellene. Scale bar vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1. Eksempel på endotelcelle respons til endringer i Calcium-konsentrasjonn. Etter forberedelse og inkubasjon i Fluo-4 AM fargestoff, ble aorta vasket med kalsium-free buffer og plassert på scenen av en to foton mikroskop. Når fartøyet er plassert i den kalsium-fri buffer, de fleste av endoteliale celler er svakt fluorescerende. Etter tilsetning av normal PSS, endotelcellene svare ved å øke intracellulær kalsiumkonsentrasjon, og å avgi et sterkt fluorescerende signal.
Video 2. Eksempel på NO-produksjon i endotelceller isoltated rotte aorta. Etter fremstilling og inkubering i DAF-FM diacetat fargestoff, aorta ble plassert på et stadium av to foton mikroskop. Etter tilsetning av Ach i for badløsning, endotelcellene svare ved å øke intracellulær NO produksjon og utslipp av en sterk fluorescerende signal. Klikk her for å se denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksperimentell Oversikt. For bedre å forstå bidraget av kalsium og NO til vaskulær fysiologi, ble en ny fremgangsmåte utviklet for måling av [Ca2 +] og NO i glatt muskulatur og endotelceller isolert intakt aortaer. Sammen, består denne protokollen av disse kritiske trinn: 1) Mekanisk isolering og rensing (ikke enzymatisk fordøyelse) av fartøyet. Det er viktig å holde vevet sunne og intakt så mye som mulig for å oppnå optimale fysiologiske opptak. 2) Inkubasjon i kalsium-merking fargestoff eller NO-merking fargestoff med Pluronic syre er kritisk, men for enkelte andre typer fartøy, kan en annen Pluronic syre og inkubasjonstid trenger å bli testet. 3) Riktig fiksering av aorta til silikonbelagt tallerken med rutenettet og pins vil gi en stabil visning under bildebehandling med de to foton mikroskop. Fordi fartøyet vil constrict og utvider seg, er det viktig å sørge for at fartøyet er properly festet til parabolen for å unngå bevegelse gjenstander som kan oppstå. 4) Kvantifisering av resultatene. Vær oppmerksom på at transient amplitude ikke alltid være den beste parameteren for å sammenligne de fysiologiske egenskapene til cellene. Integralet av forbigående kan vise en bedre forskjell på grunn av total [Ca2 +] eller NO-frigivelse.
Når eksperimentene blir utført på riktig måte, er det mulig å overvåke [Ca2 +] i (eller ingen nivåer) endres som reaksjon på stimuli som er vist på figurene 3 og 4 og Video 1 & 2. Kombinasjonen av en ex vivo og forberedelse bruken av to foton avbildning kan gi bedre signaloppløsning og nøyaktige målinger av intracellulære prosesser i vaskulære vev. Her ble disse teknologiene brukes i kombinasjon med den klassiske ikke-proporsjonal Ca 2+ og ingen indikatorer (Fluo-4 AM og DAF-FM diacetat, henholdsvis), tilmåle kalsium transienter og NO-produksjon i individuelle celler i en isolert hele aorta. Vi tror at denne teknikken vil bidra til å videresende vår kunnskap om mekanismene som regulerer [Ca 2+] i og ingen nivåer innen de ulike vaskulære celletyper.
Modifikasjoner og feilsøking. De grunnleggende prinsippene for måling av Ca 2+ signale i enkle glatte muskelceller med sensitive ionoforer ble opprinnelig utgitt i 1985. 7 De fleste av de nyeste metoder for avbildning Ca 2+ nivåer i enkelte vaskulære celler har ansatt en laser-scanning konfokalmikroskop og isolert eller dyrkede preparater. For dynamisk vev som blodkar, er det vanskelig å måle kalsium eller ingen nivåer in vivo ved hjelp av mikroskopi-baserte teknikker. 2. Den største begrensningen er at nesten alle blodkar på den arterielle siden av sirkulasjonen har en indre elastisk lamina som ligger mellom den endothelium og det innerste lag av glatte muskelceller. 8 Videre er de fleste av ekstracellulært materiale mellom den glatte muskel og adventitia lag kollagen. 8 elastin og kollagen er en viktig kilde til auto-fluorescens med høy intensitet og et bredt spekter av eksitasjonsbølgelengdene . Den sterke bakgrunnsfluorescensen kombinert med økt lysspredning under confocal bildebehandling produserer lavt signal oppløsning og derfor redusert påvisning av kalsium signalisering eller NO produksjon. Den begrensende faktor på last fluorescerende prober i vaskulære celler i tilstrekkelige konsentrasjoner til å gjøre meningsfylte målinger kan løses ved hjelp av en ex vivo forberedelse, en to-foton mikroskop, og påføring av en ny klasse av ionoforer som Asante rødt, som emitterer fluorescens ved lang bølgelengder, der det er mindre forstyrrelser fra auto-fluorescens av bindevev og fiber. Imidlertid er en av de største begrensninger i denne metoden er at den er difskelig å kombinere to eller flere fargestoffer under bildebehandling. De eksitasjonsspektre for de fleste av de tilgjengelige fargestoffer for to foton bildebehandling har brede, polymodale distribusjons egenskaper, som gjør det vanskelig å måle to forskjellige ionoforer samtidig. Imidlertid kunne lavt støynivå hybrid detektorer brukes til å begrense de oppdagede utslipps spektre forutsatt at ionoforer sende ut lys ved ulike bølgelengder. For eksempel, i den beskrevne fremgangsmåten er det ikke mulig å måle både NO-produksjonen og Ca 2+ konsentrasjonsendringer, fordi emisjonsspektrumet overlapper hverandre.
Vaskulære endotelceller, som er i direkte kontakt med blodstrømmen blir utsatt for fluidskjærspenning og regulere vaskulær homeostase. 9 Den aktuelle fremgangsmåten kan også anvendes for å overvåke strømningsinduserte kalsium transienter og NO-produksjon i endotelceller ex vivo. I tillegg kan denne metoden med hell brukes til å studere Ca 2+ konsensjonsendringer i glatte muskelceller til liten motstand arterier ekstrahert fra nyrene. I dette tilfellet bør de dissekerte liten motstand arterier inkuberes i Ca2 + -fri løsning for å unngå glattmuskelcelleskader på grunn av Ca 2+ overbelastning. Denne modifikasjon kan også anvendes til aorta for å redusere celledød.
Perspektiver. Fluorescens-basert avbildning har blitt mye brukt for å undersøke cellulær fysiologi in vitro; imidlertid ikke isolerte cellemodeller ikke alltid rekapitulere fysiologiske prosesser som oppstår når cellene er i sitt opprinnelige miljø. Dette har begrenset anvendelse av cellelinjer til translasjonell forskning. 10 Som beskrevet her, bruk av ex vivo forberedelser har gitt oss muligheten til å overvåke mobilnettet oppførsel i fersk isolert vev der alle lokale fysiologiske prosesser og samhandling med andre celletyper er fortsatt skjer . Med det økende antall genetiske Engineering teknologier tilgjengelig og utvikling av modeller som rekapitulere menneskelige sykdommer, ex vivo forberedelsene vil være et nyttig verktøy for translasjonell forskning. For studiene som er beskrevet her, ble Dahl Salt-Sensitive (SS / JrHsdMcwi) hypertensive rotter belastning brukt. SS rotte er en naturlig forekommende innavlet genetisk modell av salt-sensitive hypertensjon som sammenfatter mange aspekter ved progressiv human hypertensjon. Denne modellen blir brukt mye og har gitt viktig innsikt i mekanismene bak salt-følsomhet og vaskulær dysfunksjon. 11-13 Med dette rottemodell, har forskerne kunnet teste bidrag viktige mekanismer til komplekse sykdommer (som hypertensjon) bruker ZFNs , Talens, og CRISPR / Cas-baserte gen-redigering teknologier. 6,14-17 Bruke den eksperimentelle prosedyren beskrevet her sammen med disse gen-redigering ressurser, er det nå mulig å begynne å teste bidrag av kalsium og andre viktige faktorer for å salt -sensitivehypertensjon og vaskulær dysfunksjon i mange forskjellige dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. William Cashdollar, og Northwestern Mutual Foundation Imaging Center ved Blod Research Institute of Wisconsin for å få hjelp med bildediagnostikk. Vi takker også Dr. Daria Ilatovskaya for kritisk lesning av dette manuskriptet og nyttig diskusjon. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health Grants HL108880 (til AS) og DP2-OD008396 (til AMG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-NAME | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
