Abstract
Calcium er en meget vigtig regulator af mange fysiologiske processer i vaskulære væv. De fleste endotelceller og glatte muskelceller fungerer meget afhængige af ændringer i intracellulært calcium ([Ca2 +] i) og nitrogenoxid (NO). For at forstå, hvordan [Ca2 +] i, NO og nedstrøms molekyler håndteres af et blodkar som respons på vasokonstriktorer og vasodilatorer, vi udviklet en ny teknik, der anvender calcium-mærkning (eller NO-mærkning) farvestoffer med to foton mikroskopi at måle calcium håndtering (eller NO produktion) i fartøjer isolerede blod. Beskrevet her er en detaljeret trin-for-trin procedure, der viser, hvordan man isolerer en aorta fra en rotte, label calcium eller NO inden for endotelceller eller glatte muskelceller, og image calcium transienter (eller NO-produktion) ved anvendelse af en to foton mikroskop efter fysiologisk eller farmakologiske stimuli. Fordelene ved anvendelse af fremgangsmåden er multi-fold: 1) er det muligt at simultanly måle calcium transienter i både endotelceller og glatte muskelceller som reaktion på forskellige stimuli; 2) den tillader en at billedet endotelceller og glatte muskelceller i deres native indstilling; 3) denne metode er meget følsom over for intracellulær calcium eller ingen ændringer og genererer billeder i høj opløsning til præcise målinger; og 4) beskrevne fremgangsmåde kan anvendes til måling af andre molekyler, såsom reaktive oxygenarter. Sammenfattende at anvendelse af to foton laser emission mikroskopi overvåge calcium transienter og NO produktionen i endotel og glatte muskelceller i en isoleret blodkar har givet kvantitative data af høj kvalitet og fremmet vores forståelse af de mekanismer, der regulerer vaskulær funktion.
Introduction
Calcium er en grundlæggende anden budbringer inden vaskulære celler, såsom endotel og glatte muskelceller. Det er den primære stimulus for vaskulær sammentrækning og spiller en stor rolle i vaskulær dilatation, herunder dens virkninger gennem NO generation inden for endotel. På grund af begrænsninger i imaging teknologier har det været næsten umuligt at observere calcium håndtering inden den intakte beholder. Udviklingen af to foton billeddannelse og oprettelse af nye calcium eller ingen mærkning farvestoffer, gør det muligt at billedet i en tilstrækkelig dybde og opløsning til at begynde at forstå calcium dynamik og NO produktionen i karrene.
To foton mikroskopi er for nylig blevet anvendt i væv, organer og endog hele dyreforsøg på grund af dets overlegne evne til at trænge dybt væv med lav baggrundsfluorescens og højt signal følsomhed. 1,2 Den smalle spektrum af to foton excitation ved illumination omdrejningspunkt og brugen af ikke-descanned detektorer er grundene to foton mikroskopi er overlegen i forhold til traditionelle konfokal mikroskopi. Konfokal mikroskopi kan ikke producere billeder af høj kvalitet på det nødvendige væv dybde på grund af auto-fluorescens og spredningen af out-of-fokus lys ind i konfokal pinhole. Vi har derfor udviklet en metode under anvendelse af en to foton mikroskop for at måle [Ca2 +] i signalering og NO-produktion i intakte, individuelle blodkarceller med høj opløsning og et lavt signal-til-støj-forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De eksperimentelle procedurer beskrevet nedenfor, blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Medical College of Wisconsin og var i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr.
1. Isolering af Rat Aorta
- Bedøver rotter med isofluran (5% induktion, 1,5 til 2,5% vedligeholdelse) eller en anden IACUC godkendt metode.
- Placer rotte i rygleje. For at blotlægge de abdominale organer, lave en lille ventral midtlinie incision gennem huden og det subkutane abdominal væv. Ved hjælp gazetamponer forsigtigt afbøje tarmene at blotlægge aorta og vena cava som vist i figur 1.
- Kort fortalt, stumpt dissekere aorta fra bindevævet og fra vena cava. Anvendelse af sutur, hæfte aorta så tæt som muligt til nyren. Dissekere ca 1-2 cm af aorta og læg den i en 15 ml konisk tuvære indeholdende normal fysiologisk saltopløsning (PSS, i mM: 140 NaCl, 1,2 MgCl2, 2 CaCl2, 4,5 KCI, 6 glucose, 10 HEPES) på is.
- Når aorta er isoleret, aflive dyret i henhold til godkendte IACUC protokoller. Ved afslutningen af alle ikke-overlevelse procedurer aflive dybt bedøvede dyr ved torakotomi inducere pneumothorax at sikre human død af dyret. 3
- Ved hjælp af en dissektion mikroskop, spids pincet, og microscissors dissekere fedt og bindevæv off af aorta. Når aorta er ren, skæres aorta på langs og læg den i PSS på is til senere.
2. Dye Loading og Inkubation
- Pipetter 7 ul 1 mM Fluo-04:00 farvestof, som leveres i DMSO-baseret løsning, i individuelle rør 500 pi, der er blevet dækket med aluminiumsfolie. Opbevar i fryseren ved -20 ˚C at bevare farvestof egenskaber over tid. Bemærk: Disse alikvoteres sålutions bør være stabile i mindst seks måneder.
- Før brug tillade farvestofopløsninger at varme op til stuetemperatur før åbning. Forbered arbejdsopløsninger umiddelbart før brug. Opbevar ikke fortyndede reagens til senere brug.
- Tilføj 7 pi færdiglavet 1 mM Fluo-4:00 farvestof opløst i DMSO-opløsning til 450 ul af PSS, der ikke indeholder calcium. Tilsæt 40 pi non DMSO baseret 10% pluronsyre løsning på lastning cocktail at hjælpe dispergere acetoxymethyl (AM) estere og forbedre belastning af calcium farvestof.
- Placer dissekerede aorta ind i pi rør 500 indeholdende loading cocktail (som beskrevet i 2.3) i 1 time. Dæk alle rør med folie og sted på en roterende rysteapparat ved stuetemperatur.
- For at overvåge NO produktionen i karrene, bruge DAF-FM diacetat farvestof. Inkubér aorta i en opløsning indeholdende 450 pi PSS, 40 pi pluronsyre og 5 pi 10 mM DAF-FM-diacetat. Svarende til calcium inkubation protokollen (beskrevet i 2.3), placere aortai en 500 pi røret med NO-farveopløsning dækket i folie og sted på en roterende ryster i 30 minutter ved 4 C efterfulgt af næste 30 minutter ved stuetemperatur.
- Når NO-produktion måles, bruge endotel NO syntase blocker, L-NAME, at blokere NO-produktion som en kontrol som vist i figur 4B. For denne procedure, tilføje til cocktail (som beskrevet på 2,5) 100 nM L-NAME for den sidste 30 min inkubation (ved RT).
3. Laser Scanning Two foton Microscopy Protocol
- Efter 1 h inkubation vaskes aorta 2 - 3 gange i rent PSS at fjerne ekstracellulær farvestof.
- Overfør aorta til en silikone-belagt skål indeholdende enten normal PSS eller Ca2 + -fri buffer (afhænger af den eksperimentelle protokol). Pin aorta ned på silicone coating med adventitia i kontakt med silicone (dvs. endothelceller lumen udsat for skålen åbning) ved hjælp af μ-formede ben. Alternativt kan du bruge en Slice Anchorgitter eller lim til at fastsætte vævet.
Bemærk: For at reducere stress og mulige mekaniske artefakter, overførsel og løse aorta i Ca2 + -fri løsning, og vent 5 - 10 min før start eksperimentet. - Tilslut en peristaltisk pumpe eller en sprøjte til silicone-coatede plade til automatisk eller manuel påføring af medikamenter eller til at ændre den ekstracellulære opløsning.
- Placer fadet under næsen stykke af opretstående to-foton mikroskop, og installere og placere en 25 × (NA 1,05 og arbejder afstand 2 mm) vand-nedsænkning objektiv over prøven. Bemærk: Hvis denne specifikke linse ikke er tilgængelig, skal du bruge et mål specifikt fremstillet til to foton billedbehandling, fordi det kan øge signal opløsning dramatisk sammenlignet med en almindelig målsætning.
- Aktiver to foton laser ved hjælp af softwaren (laseren begynder at pumpe og tænd). Tune laser excitation til 820 nm.
- Ved hjælp epifluorescens, find aorta og fokusere målsætningen påendoteloverfladen hjælp grov justering.
- Skift mikroskop i to foton laser scanning-tilstand, der sikrer, at excitation laser tilstand låst, de ikke-descanned detektorer er engageret og emissionsfiltre passende til den forventede emissionsspektrene er installeret. Bemærk: Her blev den FV10-MRL / R (495-540 nM), der anvendes.
- Start levende scanning under anvendelse af ca. 5% laser magt og fint fokusere mål for at visualisere endothelcellerne.
Bemærk: De endotelceller vil udvise et stærkt fluorescerende signal, når de inkuberes i normal PSS. Dette vil være mærkbart svagere, når skibene inkuberes i calcium-fri buffer. Endothelcellerne vil være til stede på toppen af den åbnede aorta og de glatte muskelceller kan ses lige under endotelceller (se figur 2). Fordi blodkarrene er hverken glat eller jævn, vil der være steder, hvor både glatte muskelceller og endotelceller er til stede. </ Li> - Når cellerne er i fokus, at programmet mikroskop software indsamle sekventielle billeder i hurtig scanning (raster scanning, 512 x 512 pixel vindue med en ramme samling frekvens på 1,1 s). Parallelt med Fluo-04:00 fluorescens, indsamle transmitteret lys billeder for at detektere ændringer i fartøj sammentrækning og bedre visualisere de eksperimentelle betingelser.
- Efter opsamling af baseline signal billeder, ændre Ca2 + ion koncentration i den eksterne løsning eller langsomt anvende farmakologiske stimulus agenter ved hjælp peristaltikpumpen mens billeddannelse. Overhold det fluorescerende signal stigning inden for de indlæste celler.
Bemærk: Endotelceller reagerer på ændringer i flow, anbefales det derfor at anvende lave laminare applikationer og køretøj test, før anvendelse af farmakologiske aktivatorer af Ca 2+ eller NO signalering. At genberegne intracellulær calcium til nM koncentrationsværdier i skibe lastet med Fluo-4 (dissociationskonstant for Fluo-4 is 345 nM), kunne fluorescensintensitet registreres ved baseline og efter tilsætning af ionomycin og MnCI2. 4
4. Billedbehandling og beregninger
- Download og installer Fiji billedbehandling pakke.
- Åbn billedfilen i Fiji. Ved at importere filen, opdele kanaler (transmitteret lys og fluorescerende signal) når du bliver bedt. Brug kun det fluorescerende signal til analyse af data.
- Inden for Fiji-programmet, skal du klikke på fanen analysere og rul ned til værktøjer mulighed. Under værktøjer mulighed, find den fane, der siger ROI manager og klik på det; et nyt vindue vises.
- Efter dette, skal du klikke på sæt målinger under fanen analysere. Vælg de specifikke målinger af interesse. For calcium forbigående målinger, brug den gennemsnitlige grå værdi mulighed.
- Med den cirkulære spor værktøjet begynder at spore regioner af interesse (ROI) og klik på "Tilføj" på ROI Manager skærmen for hver ROI. Når alle celler af interesse er blevet sporet, i ROI Manager vinduet, skal du vælge Multi Mål under "mere" fanen. Husk at enten gemme målingerne direkte eller kopiere og indsætte alle disse målinger i et regneark.
- Open * .txt fil eller Excel-regneark fra Fiji og overføre numre til en ny Origin regneark. Bemærk: Alternativt kan du bruge et program som Sigma Plot eller Prism til yderligere analyse.
- Inden for Origin-programmet, skal du bruge Plot → menu Linje + Symbol for at observere en oversigt over alle forbigående reaktioner. Fravælg de reagerer celler.
- Genberegne trace nummer til tidsskala (X-aksen), brug Kolonne → Indstil Kolonne Værdier og formere spor nummer kolonnen til billedsamling frekvens (i vores tilfælde 1.1s).
- Brug Analyse → Statistik på Rækker for alle valgte optagelser til at beregne Mean (Y-aksen) og Standard Error spor. Plot endelige graf for nuværende gruppe af celler Plot → Linje + Symbol.
- Det mean calcium forbigående beregning er beskrevet som følges.
- For total calcium frigivelse i Origin-programmet, skal du klikke på graf, derefter bruge menuen Analyse → Calculus → Integrer. Samlet integralet af arealet under kurven vises i Resultat Log.
- For forbigående kinetik, skal du klikke på graf, brug derefter menuen: Analyse → Ikke-lineær Curve Fit → Select Data Set (vælg X-aksen spænder fra maksimalt til slutningen af forbigående reaktion). Start Fitting → Vælg Funktion → Eksponentiel Decay 1 → Udført.
Bemærk: Eksponentiel fitting vises i Graph-vinduet og Resultat Log. Opnåede data (værdier) repræsenterer totale mængde af calcium frigivet, og kinetik for kanalerne medierede forbigående reaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For præcist at vurdere bidraget af calcium til vaskulær fysiologi (vasodilatation og vasokonstriktion), blev en protokol designet til at indlæse calcium farvestoffer i både endotelceller og glatte muskelceller i isolerede intakte aorta. Den generelle eksperimentelle oprettet afbildet i figur 1, viser den grundlæggende strategi til isolering og fremstilling af beholderen før billeddannelse. Kort fortalt, efter isolering af aorta fra rotter, skal det renses af fedt og bindevæv og slids på langs. Den åbnede aorta bør derefter anbringes i en foliedækket 500 pi rør indeholdende den kendte forberedt loading cocktail som beskrevet i protokollen og inkuberet ved stuetemperatur i 1 time med lys vipning. Efter inkuberingen skal aorta vaskes, pinned ned på en silikone-dækket plade med adventitia nærmest silikone og lumen opad, og overført til en opretstående to foton mikroskop til billeddannelse.
ONCe aorta er blevet placeret på mikroskopet og skibet er i fokus, skal endothelcellerne være let at lokalisere ved deres stærke fluorescerende emission (figur 2A). Endotelcellerne vil også være det første objekt for at komme i fokus, fordi lumen af fartøjet, som primært består af endotelceller, skal vende opad, når fartøjet er holdt nede. Foruden billeddannelse endotelceller, vil der være steder, hvor glatte muskelceller er synlige (figur 2B). Således både endotel og glatte muskelceller kunne identificeres inden for samme imaging felt (figur 2C). Har evnen til at afbilde både vaskulære celletyper inden for samme imaging felt kan føre til en bedre forståelse af, hvordan disse celler i fællesskab, dog uafhængigt, reagere på forskellige agonister og stimuli.
For at demonstrere anvendeligheden af denne metode, målinger af aorta celler kan reagere på tilsætning af etcetylcholine (ACh), en potent vasodilator, der specifikt forårsager ændringer i endothelet, blev bestemt. Som vist i figur 3A, kan endothelcellerne let ses mens inkuberet i normal PSS. Efter tilsætningen af ACh (figur 3B), endotelcellen fluorescensforøgelser indikerer, at intracellulær calciumindhold også er stigende. Kvantificeringen af den udsendte fluorescens fra ROI'er eller endothelcellerne, er vist i figur 3C. Efter tilsætningen af ACh, de intracellulære calcium indhold stiger hurtigt og derefter langsomt vender tilbage til basislinien. Stigningen i calcium inden for de endotelceller som respons på ACh er i overensstemmelse med tidligere rapporter. 5,6
Svarende til calcium undersøgelser, denne protokol er egnet til påvisning af endotel NO-produktion. Til disse eksperimenter blev aortaendotelceller ladet med DAF-FM-diacetat farvestof som vist påFigur 4A. Denne fremgangsmåde blev for nylig anvendt til at vise, at ingen produktion stigninger i en Ca 2 + -afhængig måde som reaktion på ACh stimulering. 6 vigtigt, efter behandling med L-NAME, en endotel NO syntase inhibitor, dette svar blev blokeret (figur 4B).
Et andet repræsentativt eksempel på, hvordan denne teknik kan anvendes til at måle intracellulært calcium er vist i Video 1, hvor calciumholdige opløsning blev tilsat til en beholder, der blev inkuberet i calciumfrit puffer. Når aorta indledningsvis inkuberet i calciumfri puffer (ved begyndelsen af videoen), endothelcellerne er svagt fluorescerende indikerer lave niveauer af calcium i cellerne. Men efter tilsætningen af normale PSS, cellerne straks reagere ved at øge [Ca2 +] i-koncentration og udsender høj intensitet fluorescens. Dette eksperiment viser, at cellerne er i live ogreagerer på eksterne stimuli. Dette eksperiment validerer også levedygtigheden af denne metode med dens udbytte af data af høj kvalitet.
Figur 1. Aorta Isolering og Eksperimentel Set Up. 1) Efter at bedøve rotterne, gør et snit i maven og isolere aorta fra bindevæv og vena cava. 2) Efter ekstraktion af aorta, rengøre karret af fedt og bindevæv og åbne beholderen ved at skære på langs. 3) Der inkuberes fartøjet i Fluo-04:00 farvestof i 1 time ved stuetemperatur med let vuggende. 4) Efter inkubation vaskes aorta, pin det på en silikone-belagt plade, lumen opad, og overføre den til den fase af en opretstående to-foton mikroskop. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Imaging glat muskulatur og endotelceller. Efter tilstrækkelig belastning af calcium-farvestof, er det muligt at billedet både glatte muskelceller og endotelceller. (A) Top, er et eksempel på Fluo 4 fluorescens af endotelceller i et isoleret rotteaorta. Bund, er en fluorescerende billede fusioneret med transmitteret lys visning (tilsvarende for B og C). (B), er et eksempel på Fluo 4 fluorescens af glatte muskelceller i en isoleret rotteaorta. (C) på grund af den ikke-ensartet tykkelse af aorta, er det også muligt at afbilde regioner, hvor både glat muskulatur og endotelceller er til stede. Scale barer er vist. Klik her for at se en større version afdette tal.
Figur 3. Måling Calcium transienter i endotelceller som reaktion på ACh. (A) Aorta blev oprindeligt fremstillet og inkuberet i normal PSS buffer til basislinieoptegnelser. (B) Efter tilsætning af acetylcholin (ACh), det fluorescerende signal, der udsendes af de endotelceller (ROI'er) Udvidet angiver stigende niveauer af calcium i cellerne. Målestok vises. (C) De calcium transienter i de endotelceller i respons på Ach blev beregnet ved hjælp af Origin-software. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Imaging nitrogenoxid i endotelceller. (A) Efter påsætning af aorta med DAF-FM diacetat farvestof og placere den på den fase af en to foton mikroskop, er det muligt at billedet NO-niveauer inden endotelcellerne hjælp udsendte fluorescens. (B) Efter inkubering med endotel NO syntase inhibitor, L-NAME, den samlede fluorescens faldt inden for de ROI'er, hvilket indikerer reducerede niveauer af NO i cellerne. Scale bar vises. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1. Eksempel på Endothelial Cell Lydhørhed over for ændringer i Calcium Concentration. Efter forberedelse og inkubation i Fluo-04:00 farvestof blev aorta vasket med calcium-fri buffer og placeret på den fase af en to foton mikroskop. Når fartøjet er placeret i calcium-fri buffer, de fleste af endothelcellerne er svagt fluorescerende. Efter tilsætning af normal PSS, endothelcellerne reagerer ved at øge intracellulær calciumkoncentration og udsender et stærkt fluorescenssignal.
Video 2. Eksempel på NO produktionen i endotelceller af isoltated rotteaorta. Efter forberedelse og inkubering i DAF-FM diacetat farvestof, aorta blev placeret på den fase af en to foton mikroskop. Efter tilsætningen af Ach i at badopløsning, endothelcellerne reagerer ved at forøge intracellulære NO produktion og udsender et stærkt fluorescenssignal. Klik her for at se denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksperimentel Oversigt. For bedre at forstå det bidrag af calcium og NO til vaskulær fysiologi blev en hidtil ukendt fremgangsmåde udviklet til at måle [Ca2 +] i og NO inden glat muskulatur og endotelceller af isolerede intakte aorta. Sammen denne protokol består af disse kritiske trin: 1) Mekanisk isolation og forberedelse (ikke enzymatisk fordøjelse) af fartøjet. Det er vigtigt at holde vævet sund og intakt så meget som muligt for at opnå optimale fysiologiske optagelser. 2) Inkubation i calcium-mærkning farvestof eller NO-mærkning farvestof med pluronsyre er kritisk, men for nogle andre fartøjer typer, kan en anden pluronsyre og inkubationstiden skal testes. 3) Korrekt fiksering af aorta til silicone-belagt skål med nettet og stifter vil give en stabil udsigt under billeddannelse med de to foton mikroskop. Fordi skibet vil snøre og spile, er det vigtigt at sørge for, at fartøjet er properly fastgjort til skålen for at undgå bevægelse artefakter, der kan opstå. 4) Kvantificering af resultaterne. Bemærk at forbigående amplitude kan ikke altid være den bedste parameter til at sammenligne de fysiologiske karakteristika af cellerne. Integralet af forbigående kan vise en bedre forskel på grund af total [Ca2 +] i eller NO-frigivelse.
Når forsøgene udføres korrekt, er det muligt at overvåge [Ca2 +] i (eller NO-niveauer) ændringer i respons på stimuli som vist i figur 3 & 4 og Video 1 & 2. Kombinationen af en ex vivo forberedelse og anvendelsen af to foton billeddannelse kan give bedre signal opløsning og præcise målinger af intracellulære processer i vaskulære væv. Her blev disse teknologier anvendes i kombination med den klassiske ikke-ratiometrisk Ca2 + og NO indikatorer (Fluo-4 AM og DAF-FM-diacetat, henholdsvis), tilmåle calcium transienter og NO-produktion i individuelle celler i en isoleret hele aorta. Vi mener, at denne teknik hjælper med at videresende vores viden om mekanismer, der regulerer [Ca2 +] i og NO-niveauer inden for de forskellige vaskulære celletyper.
Ændringer og fejlfinding. De grundlæggende principper for måling Ca2 + signalering i enkelte glatte muskelceller med følsomme ionophorer blev oprindeligt udgivet i 1985. 7 De fleste af de seneste metoder til billeddannelse Ca 2+ niveauer i de enkelte vaskulære celler har ansat en laser-scanning konfokal mikroskop og isolerede eller dyrkede præparater. For dynamiske væv som blodkar, er det vanskeligt at måle calcium eller NO-niveauer in vivo under anvendelse af mikroskopi-baserede teknikker. 2 Den vigtigste begrænsning er, at næsten alle blodkar på den arterielle side af cirkulationen har en intern elastisk lamina, der ligger mellem den endothelium og det inderste lag af glatte muskelceller. 8 Endvidere er de fleste af det ekstracellulære materiale mellem den glatte muskulatur og adventitia lag er collagen. 8 Elastin og kollagen er en væsentlig kilde til auto-fluorescens med høj intensitet og en bred vifte af excitationsbølgelængder . Den stærke baggrundsfluorescens koblet med øget lysspredning under konfokal billeddannelse producerer lavt signal opløsning og derfor reduceret påvisning af calcium signal- eller NO-produktion. Den begrænsende faktor for lastning fluorescerende prober i vaskulære celler i tilstrækkelige koncentrationer til at gøre meningsfulde målinger kan løses ved hjælp af en ex vivo forberedelse, en to foton mikroskop, og anvende en ny klasse af ionoforer, såsom Asante Rød, der udsender fluorescens ved lang bølgelængder, hvor der er mindre interferens fra auto-fluorescens af bindevæv og fibre. Men en af de vigtigste begrænsninger ved denne metode er, at det er difskeligt at kombinere to eller flere farvestoffer under billedbehandling. De excitation spektre for de fleste af de tilgængelige farvestoffer til to foton billedbehandling har brede, polymodale distributions- egenskaber, som gør det vanskeligt for måling af to forskellige ionophorer samtidigt. Imidlertid kunne lavt støjniveau hybrid detektorer anvendes til at indsnævre de detekterede emissioner spektre antagelse af, at de ionophorer udsender lys ved forskellige bølgelængder. For eksempel i denne beskrevne fremgangsmåde er det ikke muligt at måle både NO-produktion og Ca2 + -koncentration ændringer, fordi de emissionsniveauer spektre overlapper hinanden.
Vaskulære endotelceller, som er i direkte kontakt med blodgennemstrømning udsættes for væske forskydningsspænding og regulere vaskulær homeostase. 9 Den aktuelle fremgangsmåde kan også anvendes til at overvåge flow-induceret calcium transienter og NO-produktion i endotelceller ex vivo. Derudover kan denne fremgangsmåde anvendt med succes til at studere Ca 2+ koncention ændringer i glatte muskelceller af små modstand arterier udvundet fra nyren. I dette tilfælde bør de dissekerede små modstandskar inkuberes i Ca2 + -fri løsning for at undgå skader glatte muskelceller som følge af Ca2 + overbelastning. Denne modifikation kan også anvendes til aorta for at reducere celledød.
Perspektiver. Fluorescens-baserede imaging har været meget anvendt til at studere cellulære fysiologi in vitro; imidlertid har isoleret celle modeller ikke altid rekapitulere fysiologiske processer der opstår, når cellerne er i deres native miljø. Dette har begrænset anvendeligheden af cellelinier til translationel forskning. 10 Som beskrevet her, brug af ex vivo præparater har givet os mulighed for at overvåge cellulære adfærd i frisk isoleret væv, hvor alle lokale fysiologiske processer og interaktion med andre celletyper stadig forekommende . Med det stigende antal genetisk engineering teknologier til rådighed og udvikling af modeller, der rekapitule- humane sygdomme, ex vivo præparater vil være et nyttigt redskab for translationel forskning. For undersøgelserne er beskrevet her, blev Dahl Salt-Sensitive (SS / JrHsdMcwi) hypertensiv rotte stamme. SS rotte er en naturligt forekommende indavlede genetiske model af saltsensitiv hypertension, der sammenfatter mange aspekter af progressiv human hypertension. Denne model bliver brugt i vid udstrækning og har givet vigtige indsigter i mekanismerne bag salt-følsomhed og vaskulær dysfunktion. 11-13 Med denne rotte model har forskerne været i stand til at teste bidrag vigtige mekanismer til komplekse sygdomme (ligesom hypertension) ved hjælp ZFNs , Talens og CRISPR / Cas-baserede gen-redigering teknologier. 6,14-17 Brug den eksperimentelle procedure der er beskrevet her sammen med disse gen-redigering ressourcer, er det nu muligt at begynde at teste det bidrag af calcium og andre vigtige faktorer til salt -følsomhypertension og vaskulær dysfunktion i mange forskellige dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Dr. William Cashdollar og Northwestern Mutual Foundation Imaging Center ved Blood Research Institute of Wisconsin for at få hjælp med billeddiagnostiske undersøgelser. Vi takker også Dr. Daria Ilatovskaya for kritisk læsning af dette manuskript og hjælpsomme diskussion. Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health Tilskud HL108880 (til AS) og DP2-OD008396 (til AMG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-NAME | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
