Abstract
Kalcium är en mycket viktig regulator av många fysiologiska processer i kärlvävnader. De flesta endotelceller och glatta muskelceller fungerar mycket beroende på förändringar i intracellulär kalcium ([Ca2 +] i) och kväveoxid (NO). För att förstå hur [Ca2 +] i, NO och molekyler nedströms hanteras av ett blodkärl som svar på kärlsammandragande och kärlvidgande, har vi utvecklat en ny teknik som gäller kalcium märkning (eller NO-märkning) färgämnen med två foton mikroskopi för att mäta kalciumhantering (eller NO-produktion) i isolerade blodkärl. Beskrivs här är en detaljerad steg-för-steg som visar hur du isolera en aorta från en råtta, etikett kalcium eller NEJ inom endotelceller eller glatta muskelceller, och bild kalcium transienter (eller NO-produktion) med en två photon mikroskop efter fysiologisk eller farmakologiska stimuli. Fördelarna med användning av metoden är multi-faldig: 1) är det möjligt att samtidigtly mäta kalcium transienter i både endotelceller och glatta muskelceller som svar på olika stimuli; 2) det tillåter en att avbilda endotelceller och glatt muskel-celler i deras nativa miljö; 3) denna metod är mycket känslig för intracellulär kalcium eller inga förändringar och genererar högupplösta bilder för exakta mätningar; och 4) beskrivna tillvägagångssätt kan tillämpas på mätning av andra molekyler, såsom reaktiva syrespecies. Sammanfattningsvis applicering av två foton laseremissions mikroskopi övervaka kalcium transienter och NO-produktion i endotelceller och glatta muskelceller i en isolerad blodkärl har gett kvantitativa data av hög kvalitet och främja vår förståelse av de mekanismer som reglerar kärlfunktionen.
Introduction
Kalcium är en fundamental andra budbärare inom vaskulära celler såsom endotelceller och glatta muskelceller. Det är den primära stimulans för kärlsammandragning och spelar en viktig roll i kärlutvidgning, inklusive dess effekter genom NO generation inom endotel. På grund av begränsningar av avbildningstekniker, har det varit praktiskt taget omöjligt att observera kalcium hantering inom den intakta kärlet. Utvecklingen av två foton bildsystem och skapandet av nya kalcium eller ingen märkning färgämnen, gör det möjligt att bilden på ett tillräckligt djup och upplösning för att börja förstå kalcium dynamik och NO-produktion inom kärlsystemet.
Två foton mikroskopi har nyligen tillämpats i vävnads, organ och även hela djurstudier på grund av dess överlägsna förmåga att djupt penetrera vävnader med låg bakgrundsfluorescens och hög signalkänslighet. 1,2 Den smala spektrum av två-foton-excitation vid Illumination brännpunkt och användning av icke-descanned detektorer är anledningarna till två foton mikroskopi är överlägsen traditionella konfokalmikroskopi. Konfokalmikroskopi kan inte producera högkvalitativa bilder med den nödvändiga vävnadsdjupet på grund av auto-fluorescens och spridningen av out-of-fokus ljus in i konfokala hål. Därför har vi utvecklat en metod där en två photon mikroskop för att mäta [Ca2 +] i signalering och NO-produktion i intakta, enskilda blodkärlsceller med hög upplösning och en låg signal-brusförhållande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De experimentella förfaranden som beskrivs nedan har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Medical College of Wisconsin och var i enlighet med National Institutes of Health Guide för skötsel och användning av försöksdjur.
1. Isolering av Rat Aorta
- Söva råttorna med isofluran (5% induktion, 1,5 till 2,5% underhåll) eller någon annan IACUC godkänd metod.
- Placera råttan i ryggläge. För att exponera bukorganen, gör ett litet ventralt mittlinjesnitt genom huden och den subkutana bukvävnad. Använda gaskuddar avleda försiktigt tarmarna för att exponera aorta och vena cava, såsom visas i fig 1.
- I korthet, trubbigt dissekera aorta från bindväv och från hålvenen. Med sutur, fästa aortan så nära som möjligt till njuren. Dissekera ca 1 - 2 cm i aorta och placera det i en 15 ml konisk tuvara med vanligt fysiologisk saltlösning (PSS, i mM: 140 NaCl, 1,2 MgCl2, 2 CaCl2, 4,5 KCl, 6 Glukos, 10 HEPES) på is.
- När aorta isoleras, avliva djuret enligt godkända IACUC protokoll. Vid slutförandet av alla icke-överlevnad förfaranden avliva djupt bedövade djur genom torakotomi inducera pneumothorax att säkerställa humana nedläggningen av djuret. 3
- Med hjälp av en dissektion mikroskop, spetsig pincett, och microscissors dissekera fett och bindväv bort från aorta. När aorta är ren, skär aorta i längdled och placera den i PSS på is till senare.
2. Dye Lastning och inkubation
- Pipet 7 il 1 mM Fluo-04:00 färgämne, som levereras i DMSO-baserad lösning, i individuella 500 il rör som har täckts med aluminiumfolie. Förvara i frysen vid -20 ° C för att bevara färgegenskaperna över tid. Obs: dessa alikvoteras såningar bör vara stabila under åtminstone sex månader.
- Före användning, tillåta färgämneslösningar för att värma upp till RT innan den öppnas. Bered arbetslösningar omedelbart före användning. Förvara inte utspädda reagens för senare användning.
- Lägg 7 pl av färdiga 1 mM Fluo-04:00 färgämne upplöst i DMSO-lösning till 450 ul av PSS som inte innehåller någon kalcium. Tillsätt 40 pl av icke DMSO baserad 10% pluronsyra lösning på last cocktail för att skingra acetoximetyl- (AM) estrar och förbättra lastning av kalcium färgämne.
- Placera de dissekerade artärer i 500 | il rör innehållande lastnings cocktail (som beskrivs i 2,3) under 1 h. Täck alla rör med folie och lägg på en roterande skakare vid RT.
- Om du vill övervaka NO-produktion i kärlsystemet, använda DAF-FM diacetat färgämne. Inkubera aorta i en lösning innehållande 450 | j, l PSS, 40 | il pluronsyra och 5 | il av 10 mM DAF-FM-diacetat. I likhet med kalcium inkubation protokollet (beskrivs i punkt 2.3), placera aortai en 500 | il rör innehållande NO-färgämneslösningen täckt i folie och placera på en roterande skakanordning under 30 min vid 4 C, följt av nästa 30 min vid RT.
- När NO-produktion mäts, använd endotelial NO-syntas blockerare, L-NAME, att blockera NO-produktion som en kontroll, såsom visas i figur 4B. För detta förfarande, lägg till cocktail (som beskrivs i 2,5) 100 nM L-NAME för den sista 30 minuter av inkubation (vid RT).
3. Laserskanning Två foton mikroskopi protokoll
- Efter 1 timme inkubation, tvätta aorta 2 - 3 gånger i rent PSS för att avlägsna extracellulära färg.
- Överför aorta till en silikonbelagd skål med antingen normal PSS eller Ca2 + -fri buffert (beroende på det experimentella protokollet). Pin aortan ned på silikonbeläggningen med adventitia i kontakt med silikon (dvs., endoteliala lumen exponerade till skålen öppningen) genom att använda μ-formade stift. Alternativt kan du använda en skiva Anchorgaller eller lim för att fixera vävnaden.
Obs! För att minska stress och eventuella mekaniska artefakter, överföring och fixa aorta i Ca2 + -fri lösning och vänta 5 - 10 minuter innan försöket. - Anslut en peristaltisk pump eller en spruta till det silikonbelagda plattan för automatisk eller manuell applicering av läkemedel eller för att ändra den extracellulära lösningen.
- Placera skålen under näsan bit av stolpen två-photon mikroskop, och installera och placera en 25 × (NA 1,05 och arbetsavstånd 2 mm) vatten-nedsänkning objektiv ovanför provet. Obs! Om denna specifika lins inte är tillgänglig, använd en objektiv speciellt tillverkad för två foton avbildning, eftersom det kan öka signalupplösning dramatiskt jämfört med en vanlig mål.
- Aktivera två foton laser med hjälp av programvaran (lasern börjar att pumpa och slå på). Trimma laserexcitation till 820 nm.
- Använda epifluorescens, lokalisera aorta och fokusera målet påendotelytan använder grov justering.
- Slå mikroskop i två fotonlaserskanning läge, se till att excitation lasern modlåst, de icke-descanned detektorer är engagerade och emissionsfilter som är lämpliga för den förväntade emissionsspektra är installerade. Obs: Här var det FV10-gränsvärdet / R (495-540 nM) användes.
- Börja leva skanning med hjälp av cirka 5% lasereffekt och fint fokusera mål för att visualisera endotelcellerna.
Obs! Endotelceller kommer att uppvisa en stark fluorescerande signal vid inkubation i normal PSS. Detta kommer att vara märkbart svagare när fartygen inkuberas på kalcium-buffert. Endotelcellerna kommer att vara närvarande på toppen av den öppnade aortan och de glatta muskelcellerna kan ses precis under endotelceller (se figur 2). Eftersom blodkärl är varken jämn eller till och med, kommer det att finnas platser där både glatta muskelceller och endotelceller finns närvarande. </ Li> - När cellerna är i fokus, att programmet mikroskop programvara samla sekventiella bilder i snabb scanningsläge (raster scan, 512 x 512 pixel fönster med en ram samling frekvens på 1,1 s). Parallellt med Fluo-4:00 fluorescens, samla sänds ljusbilder för att upptäcka förändringar i kärl sammandragning och bättre synliggöra försöksbetingelserna.
- Efter uppsamling av baslinjesignalstrukturer bilder, ändra Ca2 + jonkoncentrationen i extern lösning eller långsamt tillämpa farmakologiska stimulansmedel med hjälp av peristaltiska pumpen medan avbildning. Observera fluorescerande signal ökningen inom de laddade cellerna.
Obs: Endotelceller reagera på förändringar i flödet, så det rekommenderas att använda låga laminära applikationer och fordonsprovning före applicering av farmakologiska aktivatorer av Ca2 + eller NO signalering. För att räkna intracellulär kalcium till NM koncentrationsvärden i fartyg lastade med Fluo-4 (dissociationskonstanten för Fluo-4 is 345 nM), kan fluorescensintensitet registreras vid baslinjen och efter tillsats av jonomycin och MnCl2. 4
4. Bildbehandling och beräkningar
- Ladda ner och installera Fiji bildbehandling paket.
- Öppna bildfilen i Fiji. Vid importera filen, dela kanalerna (genomlysning och fluorescerande signal) när det efterfrågas. Använd endast fluorescenssignalen för dataanalysen.
- Inom Fiji programmet, klicka på fliken analysera och rulla ner till alternativet verktyg. Under alternativet verktyg, hitta en flik som heter ROI manager och klicka på den; ett nytt fönster kommer att visas.
- Efter detta, klicka på fasta mätningar under fliken analysera. Välj specifika mätningar av intresse. För kalcium transienta mätningarna använder medelvärdet alternativet gråvärdet.
- Med den cirkulära ritverktyget börja spåra områden av intresse (ROI) och klicka på "add" på ROI manager skärm för varje ROI. När alla celler av intresse har spårats i ROI manager fönstret väljer Multi Measure under "mer" -fliken. Kom ihåg att antingen spara mätningarna direkt eller kopiera och klistra in alla dessa mätningar i ett kalkylblad.
- Öppna * txt-fil eller Excel-ark från Fiji och överföra nummer till en ny Origin kalkylblad. Obs: Du kan också använda alla program som Sigma Plot eller Prism för vidare analys.
- Inom Origin program använder Plot → Linje + Symbol menyn för att observera en översikt över alla övergående svar. Avmarkera de inte svarar celler.
- Räkna spårnummer till tidsskalan (X-axeln), använd Kolumn → Ställ kolumnvärden och multiplicera spårnummer kolumnen till frekvensbildsamling (i vårt fall 1.1s).
- Använd Analys → Statistik över rader för alla valda inspelningar att beräkna Mean (Y-axeln) och Standard Error spår. Rita slutlig Diagram för aktuell grupp av celler Rita → Linje + symbol.
- MEAn kalcium övergående beräkning beskrivs som följs.
- För totalt kalcium frisättning inom Origin-programmet, klicka på Diagram, sedan använda menyn Analys → Analys → Integrera. Totalt integral av området under kurvan visas i Resultat Log.
- För gående kinetik, klicka på Diagram, sedan använda menyn: Analys → Icke-linjär kurva Fit → Välj Data Set (välj X-axeln sträcker sig från maximal till slutet av transientsvar). Starta Montering → Välj funktion → exponentiellt avtagande 1 → Klar.
Obs: Exponentiell montering visas i diagram fönstret och Resultat Log. Erhållna data (värden) representerar totala mängden kalcium frigörs och kinetik hos kanalerna medierad transientsvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att korrekt bedöma bidrag kalcium till kärl fysiologi (kärlutvidgning och kärlsammandragning), ett protokoll som syftar till att ladda kalcium färgämnen i både endotelceller och glatta muskelceller i isolerade intakta aorta. Den allmänna experimentella inrättat avbildas i figur 1, visar den grundläggande strategi för isolering och beredning av kärlet innan avbildning. I korthet, efter isolering av aorta från råtta, bör det rensades från fett och bindväv och slitsas longitudinellt. Den öppnade aortan bör sedan placeras i en folietäckt 500 pl rör innehållande den tidigare framställda lastning cocktail, såsom beskrivs i protokollet och inkuberades vid RT under 1 h med ljus gungning. Efter inkubationen bör aortan tvättas, nålas ner på ett silikontäckt platta med adventitia närmast silikon och lumen uppåt, och överfördes till en upprätt två photon mikroskop för avbildning.
Once aortan har placerats på mikroskopet och fartyget befinner sig i fokus, bör endotelcellerna vara lätt att hitta genom sin starka fluorescensemission (Figur 2A). De endotelceller kommer också att vara det första objektet att komma i fokus eftersom lumen av fartyget, som främst består av endotelceller, bör vara vänd uppåt när fartyget nålas ner. Förutom avbildning endotelceller, kommer det att finnas platser där glatta muskelceller är synliga (figur 2B). Således både endotel och glatta muskelceller kunde identifieras inom samma bildfältet (Figur 2C). Att ha förmågan att bilden både kärlcelltyper inom samma bildfältet kan leda till en bättre förståelse för hur dessa celler tillsammans, men självständigt, svara på olika agonister och stimuli.
För att demonstrera användbarheten av denna metod, mätningar av aortaceller responsiveness tillsatsen av encetylcholine (ACh), en potent vasodilator som specifikt orsakar förändringar inom endotelet, bestämdes. Såsom visas i figur 3A, kan endotelcellerna är lätta att se medan inkuberades i normalt PSS. Efter tillsats av ACh (figur 3B), endotel-cell ökar fluorescensen indikerar att intracellulär kalciumhalt ökar också. Kvantifieringen av den emitterade fluorescensen från ROI, eller de endotelceller, visas i figur 3C. Efter tillsats av ACh, de intracellulära kalciumhalten ökar återvänder snabbt och sedan långsamt tillbaka till utgångsläget. Ökningen av kalcium inom de endotelceller som svar på ACh är i överensstämmelse med tidigare rapporter. 5,6
I likhet med kalcium studier, är detta protokoll som lämpar sig för detektering av endotelceller NO-produktion. För dessa experiment var aortaendotelceller laddad med DAF-FM-diacetat färgämne såsom visas påFigur 4A. Detta tillvägagångssätt har nyligen används för att visa att ingen produktion ökar i en Ca2 + -beroende sätt som svar på ACh stimulering. 6 Viktigt efter behandling med L-NAME, en endotel NO-syntas hämmare, detta svar blockerades (Figur 4B).
Ett annat representativt exempel på hur denna teknik kan tillämpas för att mäta intracellulärt kalcium visas i video 1, där kalciuminnehållande lösningen sattes till ett kärl som inkuberades i kalciumfritt buffert. När aorta initialt inkuberas i kalcium buffert (i början av videon), endotelcellema är svagt fluorescerande indikerar låga nivåer av kalcium i cellerna. Emellertid, efter tillsats av normala PSS, cellerna reagerar omedelbart genom att öka [Ca2 +] i-koncentrationen och avger högintensiv fluorescens. Detta experiment visar att cellerna är levande ochreagerar för yttre stimuli. Detta experiment bekräftar också livskraft denna metod med dess avkastning av högkvalitativa uppgifter.
Figur 1. aorta Isolering och experimentell Ställ in. 1) Efter anesthetizing råttorna, göra ett snitt i buken och isolera aorta från bindväv och vena cava. 2) Efter extraktion av aortan, rengöra kärlet av fett och bindväv och öppna kärlet genom skärning i längdriktningen. 3) Inkubera fartyget i Fluo-04:00 färgämne för 1 timme vid RT med lätt gungning. 4) Efter inkubation, tvätta aorta, fästa den på en silikonbelagd platta, lumen uppåt, och överföra det till det stadium av en upprättstående två-photon mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Imaging glatt muskulatur och endotelceller. Efter tillräcklig belastning av kalcium-färgämnet, är det möjligt att avbilda båda glatta muskelceller och endotelceller. (A) Top, är ett exempel på Fluo 4 fluorescens av endotelceller i en isolerad råttaorta. Botten är en fluorescerande bild samman med genomlysning utsikt (på samma sätt för B och C). (B), är ett exempel på Fluo 4 fluorescens av glatta muskelceller i ett isolerat råttaorta. (C) på grund av den olikformiga tjockleken hos aorta, är det också möjligt att bildregioner där både glatt muskulatur och endotelceller finns närvarande. Skala barer visas. Klicka här för att se en större version avdenna siffra.
Figur 3. Mätning kalcium transienter i endotelceller som svar på ACh. (A) Aorta ursprungligen beredd och odlades i normal PSS buffert för baslinjen inspelningar. (B) Efter tillsats av acetylkolin (ACh), den fluorescerande signalen som emitteras av de endotelceller (ROI) förbättrade indikerar ökande nivåer av kalcium i cellerna. Skala bar visas. (C) Kalcium transienter av endotelcellerna som svar på Ach beräknades med användning av Origin programvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Imaging kväveoxid i endotelceller. (A) Efter att ha laddat aorta med DAF-FM diacetat färgämne och placera den på scenen av en två photon mikroskop, är det möjligt att bilden NO-nivåer inom endotelceller användning emitterad fluorescens. (B) Efter inkubering med endotelial NO-syntas-inhibitor, L-NAME, minskade den totala fluorescens inom ROI, vilket indikerar minskade nivåer av NO i cellerna. Skala bar visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1. Exempel på endotelceller lyhördhet för förändringar i Calcium Concentration. Efter beredning och inkubation i Fluo-04:00 färgämne, var aorta tvättades med kalcium-buffert och placerades på scenen i en två photon mikroskop. När fartyget är placerad i den kalciumfria buffert, de flesta av de endotelceller är svagt fluorescerande. Efter tillsats av normala PSS, endotel-celler svarar genom att öka den intracellulära kalciumkoncentrationen och som avger en stark fluorescenssignal.
Video 2. Exempel på NO-produktion i endotelceller i isoltated råtta aorta. Efter beredning och inkubation i DAF-FM diacetat färgämne, var aortan placeras på scenen av en två photon mikroskop. Efter tillsatsen av Ach i till badlösningen, endotel-celler svarar genom att öka intracellulära NO produktion och avger en stark fluorescenssignal. Klicka här för att se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Experimentell översikt. För att bättre förstå bidrag kalcium och NO till vaskulär fysiologi, var en ny metod som utvecklats för att mäta [Ca2 +] i och NO i glatt muskulatur och endotelceller av isolerade intakta artärer. Tillsammans detta protokoll består av dessa kritiska steg: 1) Mekanisk isolering och beredning (ej enzymatisk nedbrytning) av fartyget. Det är viktigt att hålla vävnaden frisk och intakt så mycket som möjligt för att få optimala fysiologiska inspelningar. 2) Inkubation i kalcium-märkning färg eller NO-märkning färgämne med pluronsyra är kritisk, men för några andra fartyg typer, kan en annan pluronsyra och inkubationstid måste testas. 3) Rätt fixering av aorta till silikonbelagda skålen med nätet och stift kommer att ge en stabil utsikt under avbildning med två photon mikroskop. Eftersom fartyget kommer att tygla och vidgas, är det viktigt att se till att fartyget är properly fäst till skålen för att undvika rörelse artefakter som kan uppstå. 4) Kvantifiering av resultaten. Observera att övergående amplitud inte alltid är den bästa parametern för att jämföra de fysiologiska egenskaper hos cellerna. Integralen av övergående kan visa en bättre skillnad på grund av den totala [Ca2 +] i eller NO-frisättning.
När experimenten utförs korrekt, är det möjligt att övervaka [Ca2 +] i (eller NO-nivåer) förändringar som svar på stimuli som visas i figurerna 3 och 4 och Video 1 & 2. Kombinationen av en ex vivo förberedelse och användningen av två foton avbildning kan ge bättre signalupplösning och exakta mätningar av intracellulära processer i kärlvävnader. Här har dessa tekniker tillämpats i kombination med den klassiska icke-kvotmetriska Ca2 + och NO indikatorer (Fluo-4:00 och DAF-FM-diacetat, respektive), tillmäta kalcium transienter och NO-produktion i enskilda celler i en isolerad hela aorta. Vi tror att denna teknik kommer att bidra till att vidarebefordra vår kunskap om mekanismer som reglerar [Ca2 +] i och NO-nivåer inom de olika kärlcelltyper.
Ändringar och felsökning. De grundläggande principerna för värdering av Ca2 + signalering i enstaka glatta muskelceller med känsliga jonoforer ursprungligen publicerades 1985. 7 De flesta av de senaste metoderna för Imaging Ca 2 + nivåer i enskilda vaskulära celler har anställt en laserskanning konfokalmikroskop och isolerade eller odlade preparat. För dynamiska vävnader såsom blodkärl, är det svårt att mäta kalcium eller NO-nivåer in vivo med användning av mikroskopi baserade tekniker. 2 Den största begränsningen här är att nästan alla blodkärl på artärsidan av cirkulationen, har en inre elastisk lamina som ligger mellan den endothelium och det innersta skiktet av glatta muskelceller. 8 Vidare är de flesta av de extracellulära material mellan den glatta muskulaturen och adventitia skikt kollagen. 8 elastin och kollagen är en viktig källa till auto fluorescens med hög intensitet och ett brett utbud av excitationsvåglängder . Den starka bakgrundsfluorescens i kombination med ökad ljusspridning under konfokala imaging ger låg signal upplösning och därför minskad upptäckt av kalciumsignalering eller NO-produktion. Den begränsande faktorn last fluorescerande prober i vaskulära celler i tillräckliga koncentrationer för att göra meningsfulla mätningar kan lösas genom att använda en ex vivo förberedelse, en två photon mikroskop, och tillämpa en ny klass av jonoforer, såsom Asante Red, som emitterar fluorescens vid långa våglängder, där det finns mindre interferens från auto-fluorescens av bindväv och fibrer. Emellertid är en av de huvudsakliga begränsningarna med denna metod att den är difrare att kombinera två eller flera färgämnen under avbildning. De exciteringsspektra för de flesta av de tillgängliga färgämnen för två foton avbildning har breda, polymodala egenskaper distributions, vilket gör det svårt för mätning av två olika jonoforer samtidigt. Däremot kan låg ljudnivå hybrid detektorer användas för att begränsa de detekterade utsläpps spektra förutsatt att jonoforerna avger ljus vid olika våglängder. Till exempel, det är i denna beskrivna förfarandet inte möjligt att mäta både NO-produktion och Ca 2 + koncentrationsförändringar på grund av att emissionsspektra överlappar varandra.
Vaskulära endotelceller som är i direkt kontakt med blodflödet utsätts för vätska skjuvspänning och reglera vaskulär homeostas. 9 Den nuvarande metoden kan tillämpas också för att övervaka flödes inducerad kalcium transienter och NO-produktion i endotelceller ex vivo. Dessutom kan denna metod med framgång tillämpas på studera Ca2 + koncentions förändringar i glatta muskelceller i små motstånds artärer extraherade från njuren. I detta fall bör de dissekerade små motstånds artärer inkuberas i Ca2 + -fri lösning för att undvika glattmuskelcellskada på grund av Ca2 + överbelastning. Denna modifiering kan också appliceras till aortan för att minska celldöd.
Perspektiv. Fluorescens-baserad avbildning har i stor utsträckning använts för att studera cellulära fysiologi in vitro; dock inte isolerade cellmodeller inte alltid sammanfatta fysiologiska processer som sker när cellerna är i sin ursprungliga miljö. Detta har begränsat tillämpningen av cellinjer till translationell forskning. 10 Såsom beskrivs här, användning av ex vivo preparat har gett oss möjlighet att följa cellulära beteende i nyisolerade vävnad där alla lokala fysiologiska processer och samspel med andra celltyper fortfarande förekommer . Med det ökande antalet genetiska engineering tekniker som finns tillgängliga och utveckling av modeller som rekapitulera mänskliga sjukdomar, ex vivo förberedelser kommer att vara ett användbart verktyg för translationell forskning. För de studier som beskrivs här, var Dahl saltkänsliga (SS / JrHsdMcwi) hypertensiv råtta stam som används. SS råttan är en naturligt förekommande inavlad genetisk modell av saltkänslig hypertension som rekapitulerar många aspekter av progressiv human hypertension. Denna modell används i stor utsträckning och har gett viktiga insikter i de mekanismer som ligger till grund för saltkänslighet och vaskulär dysfunktion. 11-13 Med denna råttmodell, har forskare kunnat testa bidrag viktiga mekanismer för komplexa sjukdomar (som högt blodtryck) använder ZFNs , Talens och crispr / Cas-baserade gen-redigeringstekniker. 6,14-17 Använda den experimentella procedur som beskrivs här tillsammans med dessa gen-redigering resurser, är det nu möjligt att börja testa bidrag av kalcium och andra viktiga faktorer att salt -känsligahypertoni och vaskulär dysfunktion i många olika djurmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Dr William Cashdollar, och Northwestern Mutual Foundation Imaging Center vid Blood Research Institute of Wisconsin för att få hjälp med imaging studier. Vi vill också tacka Dr Daria Ilatovskaya för kritisk läsning av detta manuskript och hjälpsam diskussion. Denna studie stöddes av National Institutes of Health bidrag HL108880 (till AS) och DP2-OD008396 (till AMG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo-4 AM | Life Technologies | F14217 | 500 µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-NAME | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM - a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
