Abstract
Den adoptiv överföring av patogenspecifika T-celler kan användas för att förhindra och behandla opportunistiska infektioner, såsom cytomegalovirus (CMV) -infektion inträffar efter allogen hematopoetisk stamcellstransplantation. Viral specifika T-celler från allogena givare, däribland tredje part givare kan förökas ex vivo i enlighet med gällande god tillverkningssed (cGMP), som använder upprepade omgångar av antigendriven stimulans för att selektivt propagera önskade T-celler. Identifiering och isolering av antigenspecifika T-celler kan också genomföras baserat på den cytokin infångningssystemet av T-celler som har aktiverats för att utsöndra y-interferon (IFN-γ). Emellertid har utbredd människa av cytokinen capture-system (CCS) för att hjälpa till att återställa immunitet begränsats eftersom tillverkningsprocessen är tidskrävande och kräver en skicklig operatör. Utvecklingen av en andra generationens enhet cell anrikning som CliniMACS Prodigy nugör det möjligt för utredarna att generera virusspecifika T-celler med hjälp av ett automatiserat, mindre arbetsintensiva systemet. Denna anordning separerar magnetiskt märkta celler från omärkta celler med hjälp av magnetisk aktiverad cellsortering teknik för att generera kliniska kvalitet produkter, är konstruerad som ett slutet system och kan nås och drivs på bänk. Vi visar driften av denna nya automatiserade cell anrikning enhet för tillverkning av CMV pp65 specifika T-celler som erhållits från en steady-state aferes produkt som utvinns ur en CMV seropositiv donator. Dessa isolerade T-celler kan sedan direkt infusion i en patient i institutionell och federal tillsyn. Samtliga biologiskt behandlingssteg innefattande avlägsnande av röda blodkroppar, är stimulering av T-celler, separation av antigen-specifika T-celler, rening och tvättning helt automatiserad. Enheter som denna lyfter möjligheten som kan tillverkas T-celler för människa utanför dedikerad god tillverkningssed (GMP) Anläggningar och i stället framställas i blod banktjänster där personalen kan övervaka automatiserade protokoll för att producera flera produkter.
Introduction
Hematopoetisk stamcellstransplantation (HSCT) en kan kombineras med adoptiv T-cellsterapi för att förbättra transplantat-mot-tumöreffekten och för att ge immunitet mot opportunistiska infektioner 2. Generering av antigenspecifika givar härledda T-celler för infusion har historiskt krävs kompetent personal och användning av specialiserade anläggningar som är GMP-kompatibel. Leveransen av sådana T-celler har resulterat i upplösning av opportunistiska infektioner 3 samt behandla den underliggande malignitet 4. Nyligen har forskare visat att adoptiv överföring av endast några tusen virusspecifika T-celler (~ 1 x 10 fyra - 2,5 x 10 5 celler / kg av mottagarens kroppsvikt) kan framgångsrikt behandla opportunistiska CMV infektioner efter allogen HSCT 5-9. Ett begränsat antal GMP anläggningar med tillhörande skickliga tillverkningskrav och de höga kostnaderna i samband med cellproduktion har dock restricted patienternas tillgång till lovande T-cellterapi 10. Ett tillvägagångssätt för att isolera antigenspecifika T-celler är baserad på CCS-med användning av en bi-specifikt reagens för att känna igen CD45 och IFN-γ. Såsom visas, kan denna metod användas för att generera klinisk kvalitet CMV-specifika T-celler med användning av en automatiserad cellanriknings CCS anordning (Figur 1B).
CMV-specifika T-celler genereras genom inkubering överlappande peptider från CMV-pp65-antigen med leukaferes totala nukleära celler (TNC) från CMV-seropositiva donatorer. Dessa peptider, som visas i samband med HLA-antigen (HLA), aktivera CMV pp65 specifika T-celler inom TNC att utsöndra IFN-γ. Dessa T-celler kan sedan "fångas" och magnetiskt separerade. Driften av den första generationens cellanrikningsanordning (figur 1 A) som krävs personal skickliga i cellodling under GMP förhållanden, och samordning av personal för att genomföra de många sTeps nödvändigt att ta fram en "fångad" produkt.
Det förfarande som krävs typiskt 10 till 12 timmar av kontinuerlig drift, och därför personal sannolikt att behöva arbeta mer än två skift i GMP anläggningen. Dessa begränsningar är nu undvikas genom införandet av ett andra generationens ordningen (visas i figur 1B). Denna anordning åtar magnetisk anrikning, liknande den första generationen enhet, men automatiserar andra aspekter av CCS i en unbreached tillvägagångssätt. Detta minskar avsevärt belastningen på GMP laget som de flesta av stegen kan åstadkommas utan uppsikt av personal. Eftersom vidare anordningen fungerar som ett slutet system, de antigenspecifika T-celler kan fångas upp och bearbetas på bänkskiva utom de steg som ingår i leukaferes isolering och beredning av material innan instrumentet. Detaljer av den fullständiga instrumentering och funktionaliteten i denna andra generationens cell anrikning enhet har pubinrättats 11.
Här beskriver vi åtgärder för att berika CMV pp65 specifika T-celler från en steady-state aferes produkten med hjälp av automatiserad cellanriknings CCS-system. När isolerade, kan dessa CMV-specifika T-celler omedelbart infunderas i en patient.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av material under sterila förhållanden (se Material och utrustning Table)
- Förbered 3 L PBS / EDTA-buffert kompletterad med humant serumalbumin (HSA) till en slutkoncentration av 0,5% (vikt / volym).
- Bered en L påse klinisk kvalitet 0,9% natriumklorid (NaCl) -lösning och 2 L av GMP-kvalitet cellodlingsmediet.
- Förbered 60 nmol av CMV-specifika peptidantigen cocktail vid beredning av en injektionsflaska med CMV pp65 med 8 ml sterilt vatten.
- Överför CMV pp65 peptid cocktail i en 50 ml volym fryspåse med hjälp av en Luer / Spike sammanlänkning och klämma med låsning pincett för att undvika senare fördelning av cocktail i ledningsuppsättningen. Öppna celler anriknings slang set (TS 500) under sterila förhållanden.
- Använd steril slang svetsare, anslut peptid cocktail fryspåse i röranslutning för ventil 2 av ledningsuppsättningen TS 500. Öppna inte peptid cocktail väska klämma vid denna tidpunkt.
- Ta bort 1 x 10 9 TNC från start cellulär produkt och suspendera i PBS / EDTA-buffert innehållande 2,5% HSA till en total volym på 50 ml. Injicera cell produkten i en 150 ml överföringspåse.
2. Upprättande och användning av automatiserade Cell Anrikning System (se Material och utrustning Table)
- Slå på cellanrikningssystem (figur 1B) och välj programmet "CCS_IFN-γ Anrikning". Observera ett användargränssnitt som visar skärmar med instruktioner och bilder som styr operatören genom proceduren.
- Ange parametern "Operator" och "Slangar Set P / N Nej". Därefter installerar ledningsuppsättningen 500 till automatiserad cellanrikningsanordning enligt instruktionerna som visas på den interaktiva skärmen.
- Följ steg för steg-instruktioner som visas på skärmen för att ansluta på medellång och buffertar till enheten. Spela katalognummer och partinummer av reagenser före Anslutag till instrumentet.
- Efter den slutliga kontrollen av ledningsuppsättningen, öppna klämman av peptiden cocktailpåsen. Öppna medellång påsen och initiera automatisk priming av ledningsuppsättningen.
- Efter priming steget är avslutat, komplettera HSA (2,5%) i NaCl-buffert i reservoaren påsen (200 ml) med hjälp av den sterila slangen svetsare. Överför utgångs cellulära produkten i "Application bag" med sterila slang svetsare.
- Anslut CCS (IFNy) reagens i respektive slang via adapter. Ange önskad tid för att samla in en bråkdel av cellmaterial innan anrikningsprocessen. Granska och kontrollera riktigheten av alla data / parametrar in. Starta processen.
- Innan starten av automatiserad cellanrikningsprocess, bort kvalitetskontroll Bag (QCB, original fraktion (ori) innehåller cirka 1,3 ml av 100 ml kammar innehåll utspädd med PBS / EDTA-buffert). Täta QCB, väga och förvara vid 4 ° C.
- Starta enrichment processen. Vid slutet av processen, kommer målceller elueras med en ungefärlig volym av elueringsbuffert från reservoaren påsen.
- Täta icke Target Cell Bag (NTCB negativ fraktion = neg) och Target Cell Bag (TCB, positiv fraktion = pos) och väger varje påse. Vikterna kommer att användas senare för beräkning av cellantalet.
- Omedelbart efter anrikningsförfarandet samlar två alikvoter per fraktion för flödescytometrianalys, och lagra resten av proverna vid 4 ° C. Använd en provalikvot för cellräkning bestämning och den andra provalikvoten för anrikning prestanda analys (tabell 1).
- Ta bort ledningsuppsättningen från cellanriknings instrumentet. Överför loggfilen till en USB-enhet för framtida bruk.
OBS: Alla reagenser bör vara beredd under sterila förhållanden. Användningen av en biosäkerhet typ II huv rekommenderas starkt. Använd steady-state aferes cellulär produkt (icke-mobiliserade) isolerad från en friskCMV-seropositiv donator att berika CMV antigenspecifika T-celler. Endast FDA licensierad HSA ska användas. Bufferten för förberedelse cell bör hållas vid 19 ° C till 25 ° C som lägre eller högre omgivningstemperaturer kommer att resultera i minskad renhet och en minskad avkastning på målcellerna.
3. Cellräkning Bestämning
- Ta alikvoter av QCB, NTCB och triklorbensen för cellräkningar såsom visas i tabell 1. Lägg CD45-VoBlue till varje alikvot (titer 1:11) och inkubera i mörker under 10 min vid 4 ° C.
- Lägg 1,5 ml nyberedd röda blodkroppar lyseringslösning (1 x) till den ursprungliga fraktionen och negativ fraktion, 450 | il nyberedd röda blodkroppar lyslösning till den positiva fraktionen, och inkubera alla fraktioner för 15 min vid RT.
- Strax före analys, till propidiumjodid till en slutlig koncentration av 1 | ig / ml (1: 100 spädning av 100 | ig / ml). Använd automatisk cellräknare för att bestämma cellräkning och viförmåga. Använd celltalsräknare anordning rekommenderad programvara för flödescytometrianalys. Bestäm absoluta antal av leukocyter för original, negativa och positiva fraktioner.
OBS! Kroppar av livskraftiga leukocyter per ml av prover som tagits för cellräkning analys bestäms med hjälp av cell analysator programvara som rekommenderas. - Ställ regionen såsom visas i fig 2 (område 5, levande leukocyter). Använd följande grindstrategi för att bestämma cellräkning. En livskraftig leukocyt i original fraktion visas i figur 2.
- De angivna områdena (Figur 2, 1-6) är hierarkiskt enligt följande:
1: Time gate → 2: Enstaka celler → 3: CD45 + celler → 4: Leukocyter (skräp undantagna) → 5: Livskraftiga leukocyter → 6: Livskraftiga lymfocyter - Upprepa samma steg för att bestämma cellräkningar för negativa och positiva fraktioner. Beräkna celltalet för hela fraktionengenom att betrakta utspädningsfaktorn av provet och den totala volymen av fraktionen (tabell 2).
4. Undersökning av separationsprestanda
- Tvätta portioner av QCB, NTCB och TCB fraktions celler med pre-kyld PBS / EDTA-buffert / 0,5% AB-serum. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C och aspirera supernatanten.
- Resuspendera cellerna i 100 pl antikropps fluorokrom färgningsblandning innehållande: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue och anti-IFNy-PE (titer 1:11) och inkubera i mörker under 10 min vid 4 ° C.
- Tillsätt 1 ml nyberedd röda blodkroppar lyseringslösning (1 x) och inkubera under 15 min vid RT. Centrifugera vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C och aspirera supernatanten. Resuspendera cellerna i en tillräcklig volym av PBS / EDTA buffert / 0,5% AB Serum.
- Lägg propidiumjodid till en slutlig koncentration av 1 | ig / ml strax före analys (1: 100 dilutipå av 100 | ig / ml). Utför flödescytometrianalys för att utvärdera renheten hos provet.
- Använd följande grind strategi för att beräkna CD3 + T-celler i viabla leukocyter gating strategi för bestämning av de CD3 + T-celler visas i positiv fraktion efter CCS anrikningsprocessen. De angivna områdena (Figur 3A och 3B, 1-6) är hierarkiskt länkade enligt följande:
1: Time gate → 2: Enstaka celler → 3: CD45 + celler → 4: Celler (skräp undantagna) → 5: Livskraftiga leukocyter → 6: Levande CD3 + celler befolknings - Bestäm frekvenserna för CD4 ^, CD8 *, CD4 ^ IFN-γ + och CD8 + IFN-γ + T-celler efter CCS anrikningsprocessen (tabell 2).
- Använd grindningsstrategi för att bestämma frekvensen av CD4 ^, CD8 *, CD4 ^ IFN-γ + och CD8 + IFN-γ + -T-celler som visas nedan feller ett original och berikad (fångas) positiva fraktionen efter CCS processen. De angivna områdena är hierarkiskt länkade och namnges enligt följande:
1: Time gate → 2: Enstaka celler → 3: CD45 + celler → 4: Celler (skräp undantagna) → 5: Livskraftiga Leukocyter → 6: Levande CD3 + celler → 7: CD4 + celler → 7a: CD4 + IFN-γ + celler (box) → 8: CD8 + celler → 8a: CD8 + IFN-y + celler (box)
OBS: De första 6 indikerade regioner av hierarki länkarna är samma som fig 3, (1-6) och sista 2-regioner visas i figur 4 (6-8a).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie var en automatiserad cell anrikning CCS system för automatiserad produktion av CMV pp65 specifika T-celler. CMV-specifika T-celler anrikades från tre aferes cellprodukter. Steady-state aferes produkten skördades över 2 timmar från en CMV-seropositiv donator och genererade 10 10 totalt nukleära celler (TNC). 10 9 TNC aktiverades sedan med CMV pp65-härledda peptider (60 nmol) för 4 timmar och IFN-γ-utsöndrande T-celler isolerades med användning av CCS på automatiserad cellanrikningsanordning. En operatör behövdes vid början av experimentet för att ladda alla reagens och slangset. Inställning av systemet från den ursprungliga uppackning att starta enheten tog ungefär 60 till 120 min. Observera att maskinen kan då programmeras att starta efter reagenser och slangset laddas varigenom maskinen ska fungera utan uppsikt (t.ex. över natten). Operatören behövdes igen efter 15 timmar för att utföra karakterisering avslutprodukterna för cell renhet och livskraft. Efter anrikning cellsupernatanten screenades för mykoplasma och endotoxin närvaro. Efter godkännande, kan de bearbetade cellerna infunderas direkt i patienter eller frysförvarade för senare tillämpningar.
Cellräkningar bestämdes efter cellräkning av standardmetoder med användning av de formler som anges i tabell 2. Varje typ av cellantalet upprepades tre gånger, och resultaten uttrycktes som medelvärdet för totalt kroppar med standardavvikelse (SD). Rapporter analyserades sedan med hjälp av cell analysator rekommenderad programvara. Gating för att bestämma levande leukocyter och lymfocyter visas i figur 2. Data för cellantalet presenteras i tabell 3. Grind strategi som används för att bestämma IFN-y + -T-celler visas i Figur 3 och figur 4. Före berikning, det viabilitet av celler var rutinmässigt> 95%. Efter enrichment, var livskraften hos celler <50%. Den absoluta räknevärdet av IFN-γ + T-celler bedömdes före och efter anrikningsprocessen. Det totala antalet IFN-y + -T-celler före berikning var 1,14 x 10 6 ± 0,35 x 10 6 som härlett från 10 9 startar TNC och efter anrikning var 3,09 x 10 5 ± 1.70 x 10 5 IFN-y + -T-celler. Det fanns 0,16 ± 0,18% IFN-γ + CD4 ^ T-celler som förelåg innan behandling och denna ökade till 47,5 ± 34,7% efter berikning. Renheten andelen CD8 + IFN-γ + -T-celler före infångning var 0,47 ± 0,1%, och ökade till 90,3 ± 1,7% efter berikning (tabell 3 och 4). Provutbyte i den tagna (positiv) fraktionen var 32,9 ± 15,7% för CD4 + T-celler och 31,8 ± 13,2% för CD8 + T-celler baseras på mätning av IFN-y + -T-celler i sta rting populationen (Tabell 4). Dessa data indikerar att både CD4 + och CD8 + CMV pp65 specifika T-celler kan skördas automatiskt på ett sätt som lämpar sig för deras människa.
Figur 1. Anrikning av CMV-specifika T-celler med hjälp av CCS-systemet. (A) Flera processteg som ingår i den första generationen cell anrikning enhet hanteras av skickliga yrkesmän. (B) De flesta av de processteg, utom initial slangar installationen är automatiserade i den andra generationen cellanrikningsanordning som sparar 10-12 timmar mässigt bedriva handläggningstid jämfört med den första generationen enheten. De anrikade CMV-virusspecifika T-celler kännetecknas av flödescytometri cell analysator. > Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. gating strategi som används för att bestämma livsdugliga T-celler. Siffrorna 1 till 6 anger motsvarande grind hierarkin domän i figuren. (1) Ställa in tid grind, (2) Ta bort dubblettceller genom att rita FSC-höjd mot FSC-området (3) Identifiering av CD45 + celler, (4) Ta bort cellrester (5) Val av livskraftiga leukocyter och (6) Viabla lymfocyter från ursprungliga befolkningen av propidiumjodidfärgning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
belastning / 52808 / 52808fig3.jpg "/>
Figur 3. gating strategi som används för att bestämma CD3 + -T-celler. Flödescytometri blot-analys av CD3 + T-celler före (3A) och efter (3B) cellanrikning visas här. Det är mycket viktigt att bestämma hur många CMV-specifika peptiden aktiverade T-celler är närvarande i proverna före och efter anrikningsprocessen. I denna figur siffrorna 1 till 6 anger motsvarande cellpopulationen antingen genom storlek eller färgades av en specifik antikropp. (1) Ställa in tids grind, (2) Ta bort dubblettceller, (3) Val av CD45 + celler, (4) Ta bort cellrester (5) Val av livskraftiga leukocyter och (6) bart CD3 + lymfocyter. Propidiumjodidfärgning utfördes för att avlägsna döda celler./52808fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. gating strategi som används för att bestämma renheten av IFN-γ + -T-celler. Aktiverade CMV-specifika T-celler är kritiska för reglering CMV-infektion, så IFN-γ + uttryck på T-celler användes för grindning. IFN-y + T-celler bland CD4 + och CD8 + delmängder (A) före anrikning och (B) efter anrikning. (7/8) Andel av CD4 + T-celler och CD8 + T-celler visas i A och B. (7a ) Procent av CD4 + IFN-y + -T-celler visas i rutan (a) inom grindområdet och på liknande sätt för C D8 + IFN-γ + T-celler i (8a). "T" representerar% av celler i den totala befolkningen och "#" representerar% av celler i gated befolkningen. Propidiumjodidfärgning genomfördes för att gate ut döda celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Volymerna av fraktionerna som används för cellfärgning strategi.
Tabell 2. Formler som används för beräkning av CD4 + IFN-γ + -T-celler efter anrikningsprocessen. Beräkning av CD8 + IFN-γ + T-celler utförs på liknande sätt.
Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Tabell 3. Totalt celltal i T-cellundergrupper före och efter anrikning. Prov nr 1 resultat Här visas.
Tabell 4. Renhet och återvinning av IFN-γ + T-cell före och efter anrikningsprocessen enligt prov nr 1.
Tabell 5. cellsortering strategier som används i isoleringen av klinisk kvalitet CMV-antigenspecifika T-celler. 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adoptiv T-cellterapi har visat sig vara ett hållbart alternativ för att behandla B-cellmaligniteter 4. Dess terapeutiska potentialen är beroende av infusion önskat antal mål antigenspecifika T-celler som saknar replika åldrande 2. Detta kan uppnås genom att sortera ut en ren population av antigenspecifika T-celler från expanderade T-celler i enlighet med gällande god tillverkningssed. Två sorteringsförfaranden används ofta, nämligen fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och magnetiska aktiverad cellsortering (MACS) för att generera CMV antigenspecifika T-celler som vi nyligen 5 har granskats. Fördelen med att använda en strategi över den andra beskrivs i tabell 5. MACS tekniken erbjuder den högsta cellanriknings renhet på ett billigare och snabbare sätt än FACS-teknik. Dessutom användning av engångs kolumner och reagenser för cell anrikning förhindrar helt provet till provkontaminering som gör detlättare att tillämpa i kliniska situationer. Den halvautomatiska cell anrikning enhet är arbetsintensiv och tidskrävande så utveckling av automatiserade cellanriknings enhet var nödvändig för att föda klinisk efterfrågan.
Den automatiserade cellanriknings CCS anordning är ett mångsidigt verktyg för att isolera klinisk kvalitet celler såsom hematopoetiska stamceller, somatiska stamceller, såväl som T-celler för adoptiv överföring. Denna automatiserade enhet integrerar cellbehandling, inklusive fraktionering av utgångsmaterial, cell tvätt, cellseparation, cellodling och slutproduktbildning i en engångsbruk GMP-kompatibel engångsenhet. Det slutna systemet minskar renrumskrav och minimerar operatörs engagemang för att upprätthålla GMP faciliteter. Automation minskar den tid som krävs för en operatör att vara närvarande och därigenom minska kostnaderna i samband med dessa laboratorieförfaranden.
För att validera den automatiserade cellanrikningsanordning, jämförtmed halvautomatisk cellanrikningsanordning, isolerade vi CMV-specifika T-celler efter inkubering av CMV-pp65-härledda peptider med en aferes produkt. GMP grade CMV pp65 peptid cocktail (t.ex. PepTivator) är en peptid pool som består i huvudsak av 15-mer-peptider med 11 aminosyror överlappar, som täcker den fullständiga sekvensen av pp65 proteinet av humant cytomegalovirus. Återhämtning provUtbytet var ~ 0,3 x 10 6 CD3 + IFN-y + T-celler från 10 9 TNC. Kliniska studier har visat att infusion av ett par tusen CMV-specifika T-celler som profylaktisk behandling för patienter (~ 360 till 4000 celler / kg kroppsvikt) som genomgår HSCT gav skydd mot CMV. Till exempel, i syfte att behandla CMV i kliniska prövningar med hjälp av denna teknik, en 70 kg vuxen och en 30 kg barn tydligen kräver endast 0,26 till 3,0 x 10 5 och 1 x 10 4-1,2 x 10 5 celler, respektive, av viral- specifika T-celler 12-15 et al., 13. Ett större antal levande celler skulle också vara acceptabelt, eftersom detta skulle vara förenat med tillräckligt med material för olika infusioner. Men mer levande celler i allmänhet innebär också flera andra än T-celler (B, NK, etc) celler. Våra data visar att CMV-specifika T-celler som genereras på det automatiska systemet cellanrikning gav kliniskt talande antal CMV-specifika T-celler som sedan kan infunderas efter allogen HSCT.
CMV-infektion kan vara ett stort problem efter HSCT resulterat i både ökad sjuklighet och dödlighet. Dessutom är CMV-infektion i samband med ökade kostnader, trots den senaste tidens framsteg i tidig diagnos och behandling med antivirala läkemedel 16. Den nuvarande behandling med ganciklovir och foskarnet kan leda till toxicitet hos medicinskt sköra mottagare av HSCT.Tillägget baksidan av givarhärledda CMV-specifika T-celler har visat sig förebygga och behandla opportunistiska infektioner i mottagare av allogen HSCT 9. Detta sätt att adoptiv immunterapi har även tillämpats för att återställa immunitet mot andra patogener, såsom Epstein-Barr-virus (EBV), adenovirus 8, och Aspergillus 3 genom att inkubera mononukleära celler (MNC) med respektive antigen härledda klinisk kvalitet peptid cocktail reagens ( Material och utrustning bord). Nyligen har forskare säkert infunderas tredjeparts patogenspecifika T-celler som matchas med åtminstone en HLA-allel i recipienten presenter immunodominanta peptiden 17. Den automatiserade cellanriknings CCS systemet kan också användas för att generera tredje part T-celler för off-the-shelf program som kommer att vara användbar när givaren är CMV-seronegativa eller saknas, såsom fallet med givare för allogen navelsträngsblod transplantatividare.
Sammanfattningsvis visar vi nyttan av en automatiserad cellanrikningsanordning för att generera CMV-specifika T-celler baserat på automatisering av CCS. Vi tror att denna enhet har potential att sänka tröskeln för kliniska team för att ingjuta patogen specifika, liksom tumörspecifika T-celler i patienter med nedsatt immunförsvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Både MD Anderson Cancer Center och Dr. Cooper har ett ekonomiskt intresse i ZIOPHARM Oncology, Inc., och Intrexon Corporation. Den 7 maj, 2015 Dr. Cooper utsetts till verkställande direktör på ZIOPHARM Oncology. Dr. Cooper är nu en gästforskare vid MD Anderson. Dr. Cooper grundade och äger InCellerate, Inc. Han har patent med Sangamo BioSciences med artificiella nukleaser. Han rådfrågar med Targazyme, Inc. (tidigare amerikanska Stamceller, Inc.), GE Healthcare, Ferring Pharmaceuticals, Fate Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals, och Bristol-Myers Squibb. Han är på den vetenskapliga rådgivande styrelse Cellectis. Han erhåller arvode från Miltenyi Biotec.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 ml Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/ml) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
- Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
- Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
- Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
- Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), Available from: http://www.cambridgeresearchcentre.co.uk/all-publications/blood-and-marrow-transplantation/ 55-59 (2014).
- Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
- Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
- Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
- Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
- Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
- Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
- Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
- Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
- Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
- Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).
