Abstract
העברת המאמצת של תאי T ספציפי לפתוגן יכול לשמש כדי למנוע ולטפל בזיהומים אופורטוניסטים כגון ציטומגלווירוס (CMV) זיהום המתרחשים לאחר השתלת תאי גזע hematopoietic אלוגנאית. תאי T ויראלי הספציפיים מתורמים אלוגנאית, כוללים תורמי צד שלישיים, יכולים להיות מופצים vivo לשעבר בעמידה בפרקטיקת ייצור טובה הנוכחית (cGMP), העסקת סיבובים חוזרים ונשנים של גירוי מונע אנטיגן כדי להפיץ באופן סלקטיבי תאי T רצויים. זיהוי והבידוד של תאי T אנטיגן ספציפי יכולים גם להתבצע על בסיס מערכת לכידת ציטוקינים של תאי T שהופעל להפריש אינטרפרון גאמה (IFN-γ). עם זאת, יישום אנושי נרחב של מערכת לכידת ציטוקינים (CCS) כדי לעזור להחזיר את החסינות הוגבל כתהליך הייצור הוא זמן רב ודורש מפעיל מיומן. הפיתוח של מכשיר להעשרת תאי דור שני כגון CliniMACS Prodigy עכשיומאפשר לחוקרים ליצור תאים נגיפיים ספציפיים T באמצעות מערכת עתירת עבודה אוטומטית, פחות. מכשיר זה מפריד כותרת מגנטית תאים מהתאים ללא תווית באמצעות טכנולוגיית תא מופעלת מגנטית מיון כדי ליצור מוצרים ברמה קלינית, מתוכנן כמערכת סגורה, וניתן לגשת ומופעל על benchtop. אנו מדגימים את הפעולה של מכשיר העשרת תא האוטומטי החדש לייצור תאי T CMV pp65 הספציפי המתקבלים ממוצר apheresis מצב יציב שהתקבל מתורם נגוע מחשבת CMV. תאי T המבודדים אלה לאחר מכן ניתן חדורים ישירות לתוך מטופל תחת פיקוח רגולטורים מוסדי והפדרלי. כל שלבי העיבוד ביו כולל ההסרה של תאי דם אדומים, גירוי של תאי T, תאי הפרדת אנטיגן הספציפי T, הטיהור, והשטיפה אוטומטיים לחלוטין. התקנים כגון זה מעלים את האפשרות שתאי T ליישום אנושי יכולים להיות מיוצרים מחוץ לתרגול ייצור טוב ייעודי (GMP) מתקנים ובמקום להיות מיוצרים במתקני בנקאות דם בו צוות יכול לפקח פרוטוקולים אוטומטיים לייצר מספר רב של מוצרים.
Introduction
השתלת hematopoietic תאי גזע (HSCT) 1 יכולה להיות משולבת עם טיפול T-cell מאמץ כדי לשפר את השפעת השתל נגד גידול ולספק חסינות לזיהומים אופורטוניסטיים 2. דור של תאי T תורם נגזרות אנטיגן ספציפי לעירוי דרש היסטורי אנשים ושימוש במתקנים מיוחדים שGMP תואם מיומנים. המשלוח של תאי T כזה הביא רזולוציה של זיהומים אופורטוניסטים 3, כמו גם טיפול בממאירות בסיס 4. לאחרונה, חוקרים הראו כי העברת המאמצת של כמה אלף רק תאי T וירוס ספציפי (~ 1 x 10 4-2.5 x 10 5 תאים / משקל גוף נמען קילוגרם) יכול לטפל בהצלחה בזיהומים CMV אופורטוניסטיים לאחר אלוגנאית HSCT 5-9. מספר מוגבל של מתקני GMP עם דרישות ייצור מיומנות הקשורים והעלות הגבוהה הקשורים בייצור תאים יש, עם זאת, restrגישה סבלנית icted למבטיח T-cell טיפולים 10. גישה אחת לבידוד תאי T אנטיגן הספציפי מבוססת על CCS באמצעות מגיב דו-ספציפי להכיר CD45 וIFN-γ. כפי שמוצג, מתודולוגיה זו יכולה לשמש כדי ליצור תאי T כיתה קלינית CMV ספציפי העסקת מכשיר CCS העשרת תא אוטומטי (איור 1).
תאי T CMV ספציפי שנוצרו על ידי דוגרים פפטידים חופפים מאנטיגן pp65 CMV עם תאי leukapheresis כולל גרעיניים (TNC) מתורמים CMV-נגועים מחשבה. פפטידים אלה, מוצגים בהקשר של אנטיגן לויקוציטים האנושי (HLA), להפעיל את תאי T pp65 הספציפי CMV בתוך TNC להפריש IFN-γ. תאי T אלה לאחר מכן ניתן "נתפסו" ונפרדו מגנטיים. הפעולה של המכשיר להעשרת תאי הדור הראשון (איור 1 א) נדרשה כוח אדם מיומן בתרבית תאים בתנאי GMP, ותיאום של צוות לבצע את ים מרובהteps צורך ליצור מוצר "נתפס".
ההליך נדרש בדרך כלל 10 עד 12 שעות של פעולה רציפה, ולכן אנשים סביר צריכים לעבוד על שתי משמרות במתקן GMP. אילוצים אלה כעת בטל על ידי היישום של מכשיר דור שני (מוצג באיור 1). מכשיר זה מתחייב העשרה מגנטית, בדומה למכשיר הדור הראשון, אבל לאוטומטי היבטים אחרים של CCS בגישת unbreached. זה מפחית באופן משמעותי את העומס על צוות GMP כמו רוב השלבים יכולים להתבצע ללא השגחה על ידי צוות. יתר על כן, מאז המכשיר פועל כמערכת סגורה, יכולים להיות שנתפסו תאי T אנטיגן ספציפי ומעובד על benchtop מלבד השלבים כרוכים בבידוד leukapheresis והכנה של חומרים לפני שמתחיל את המכשיר. פרטים של המכשור והפונקציונליות של מכשיר העשרת תאי דור שני זה מלא כבר מסבאותlished 11.
כאן, אנו מתארים את הצעדים להעשיר תאי T pp65 הספציפי CMV ממוצר apheresis מצב יציב באמצעות מערכת CCS העשרת תא האוטומטית. ברגע בודד, תאי T CMV ספציפי אלה עשויים להיות חדורים באופן מיידי למטופל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת חומרים בתנאים סטריליים (ראה חומרים וציוד טבלה)
- הכן 3 L של חיץ PBS / EDTA בתוספת אלבומין בסרום אדם (HSA) לריכוז סופי של 0.5% (w / v).
- הכן תיק 1 L של נתרן כלורי פתרון קליני כיתה 0.9% (NaCl) ו -2 ליטר של מדיום תרבית תאי הכיתה GMP.
- הכן 60 ננומול של קוקטייל אנטיגן פפטיד CMV הספציפי על ידי מחדש של בקבוקון אחד של pp65 CMV עם 8 מיליליטר של מים סטריליים.
- העבר את קוקטייל פפטיד pp65 CMV לתוך שקית הקפאת 50 מיליליטר עוצמת קול באמצעות interconnector / ספייק Luer ומהדק עם נעילת מלקחיים כדי למנוע ההפצה הבאה של קוקטייל לסט צינורות. סט תא פתוח צינורות העשרה (TS 500) בתנאים סטריליים.
- באמצעות רתך צינורות סטרילי, להתחבר שקית הקפאת קוקטייל פפטיד לחיבור צינור לשסתום 2 של סט צינורות TS 500. אל תפתח את מהדק תיק קוקטייל פפטיד בשלב זה.
- הסר 1 x 10 9 TNC ממוצר סלולארי מתחיל ולהשעות במאגר / EDTA PBS המכיל 2.5% HSA להיקף כולל של 50 מיליליטר. להזריק את המוצר הסלולרי לתוך שקית העברה 150 מיליליטר.
2. הכנה ומערכת העשרה סלולארי שימוש באוטומטי (ראה חומרים וציוד טבלה)
- הפעל את מערכת העשרת תא (איור 1) ובחר את התכנית "CCS_IFN-γ ההעשרה". שים לב ממשק משתמש המציג מסכי עם הוראות ותמונות המנחות את המפעיל בהליך.
- הזן את "המפעיל" פרמטר ו" Tubing סט P / N לא ". לאחר מכן, להתקין את צינור סט 500 להעשרת תא אוטומטית המכשיר בהתאם להוראות המוצגות על מסך הצג האינטראקטיבי.
- בצע את הוראות צעד אחר צעד המוצגות על המסך כדי לחבר את המדיום ומאגרים למכשיר. מספר קטלוג שיא ומספר הרבה ריאגנטים לפני connecting למכשיר.
- לאחר הבדיקה הסופית של סט צינורות, לפתוח את המהדק של תיק קוקטייל פפטיד. פתח את התיק הבינוני וליזום תחול אוטומטי של מערכת צינורות.
- לאחר השלב תחול הושלם, להשלים HSA (2.5%) לחיץ NaCl בשקית המאגר (200 מיליליטר) עם העזרה של רתך צינורות סטרילית. העבר את המוצר הסלולרי מתחיל ל" תיק הבקשה "באמצעות רתך צינורות סטרילית.
- חבר ריאגנטים CCS (IFNγ) לתוך צינורות המתאימים באמצעות מתאמים. הזן את הזמן מועדף לאסוף חלק של חומר תאי לפני תהליך ההעשרה. סקירה ולוודא את הדיוק של כל הנתונים / פרמטרים נכנסו. התחל את התהליך.
- לפני תחילת תהליך העשרת תא אוטומטי, להסיר את בקרת איכות התיק (QCB, חלק מקורי (אורי) מכיל כ 1.3 מיליליטר מתוך 100 מיליליטר תוכן תא בדילול עם חיץ / EDTA PBS). חותם את QCB, לשקול, וחנות על 4 מעלות צלזיוס.
- התחל enrichmeתהליך NT. בסופו של התהליך, תאי היעד יהיה eluted עם נפח משוער של חיץ elution משקית המאגר.
- לאטום ללא סלולארי תיק היעד (NTCB, חלק שלילי = נג) ותא המטרה התיק (TCB, שבריר = pos החיובי) ולשקול כל שקית. המשקולות תשמש מאוחר יותר לחישוב המספרים הסלולריים.
- מייד לאחר הליך ההעשרה לאסוף שני aliquots לחלק לניתוח cytometry זרימה, ולאחסן את שאר הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש aliquot מדגם אחד לקביעת ספירת התאים וaliquot המדגם האחר לניתוח ביצועי העשרה (טבלת 1).
- הסר את צינורות להגדיר מהמכשיר להעשרת תאים. העבר את קובץ היומן לכונן USB לשימוש עתידי.
הערה: צריכים להיות מוכנים כל ריאגנטים בתנאים סטריליים. השימוש במכסת מנוע הסוג II בטיחות ביולוגית מומלץ מאוד. להשתמש במוצר יציב apheresis סלולארי (לא מגויס) מבודד מבריאCMV-נגוע מחשבת התורם להעשיר תאי T ספציפיים לאנטיגן CMV. רק FDA מורשה יש להשתמש HSA. החיץ להכנת תא צריך להיות כל הזמן ב19 ° C עד +25 מעלות צלזיוס כפי שטמפרטורות סביבה נמוכות יותר או גבוהות יותר יגרמו לטוהר מופחת ותשואה מופחתת של תאי המטרה.
קביעת רוזן 3. סלולארי
- קח את aliquots של QCB, NTCB וTCB לספירת תאים כפי שמוצג בטבלה 1. הוספת CD45-VoBlue לכל aliquot (כייל 01:11) ודגירה בחושך במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- להוסיף 1.5 מיליליטר פתרון תמוגה תא דם אדום מוכן טרי (1x) לחלק המקורי וחלק שלילי, 450 μl פתרון תמוגה תא דם אדום מוכן טרי לחלק החיובי, ודגירה כל השברים במשך 15 דקות ב RT.
- רק לפני הניתוח, להוסיף יודיד propidium לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מיליליטר (1: 100 מיקרוגרם / מיליליטר 100 דילול). להשתמש דלפק תא אוטומטי כדי לקבוע ספירת תאים וצמייכולת. השתמש בתוכנה מומלצת מכשיר דלפק תא לניתוח cytometry זרימה. לקבוע את הספירה האבסולוטית של כדוריות דם לבנות לשברים מקוריים, שליליים וחיוביים.
הערה: ספירת התאים של לויקוציטים קיימא לכל מיליליטר של הדגימות שנלקחו לניתוח ספירת תאים נקבעה באמצעות התוכנה מומלצת מנתח תא. - הגדר את האזור כפי שמוצג באיור 2 (אזור 5, כדוריות דם לבנות קיימא). השתמש באסטרטגית gating הבאה כדי לקבוע ספירת תאים. יקוציט קיימא בחלק מקורי מוצג באיור 2.
- האזורים שצוינו (איור 2, 1-6) הם היררכי כדלקמן:
1: שער זמן → 2: תאים יחיד → 3: CD45 + תאי → 4: Leukocytes (פסולת נכללה) → 5: לויקוציטים קיימא → 6: ימפוציטים קיימא - חזור על אותם השלבים כדי לקבוע ספירת תאים לשברים שליליים וחיוביים. לחשב את ספירת התאים של כל החלקעל ידי בהתחשב בגורם diluent של המדגם והנפח כולל של החלק (טבלה 2).
4. בחינת הפרדת הביצועים
- שטוף את aliquots של QCB, NTCB ותאי חלק TCB עם חיץ-מקורר מראש PBS / EDTA / 0.5% בסרום AB. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולשאוב supernatant.
- תאים גלולים בתערובת כתמי 100 μl נוגדן-fluorochrome מכיל: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue ואנטי-IFNγ-PE (כייל 01:11) ו דגירה בחושך במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- הוסף 1 מיליליטר פתרון תמוגה תא דם אדום מוכן טרי (1x) ו דגירה במשך 15 דקות ב RT. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולשאוב supernatant. Resuspend תאי נפח מספק של PBS / EDTA הצפת / 0.5% סרום AB.
- להוסיף יודיד propidium לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל רק לפני הניתוח (1: 100 dilutiעל 100 מיקרוגרם / מיליליטר). לבצע ניתוח תזרים cytometry להעריך את טוהר של המדגם.
- השתמש באסטרטגית gating הבאה כדי לחשב את תאי CD3 + T באסטרטגית gating יקוציט קיימא לקביעת תאי CD3 + T מוצגת בחלק חיובי לאחר תהליך העשרת CCS. האזורים שצוינו (איור 3 א ו3B, 1-6) הם היררכי קשורים כדלקמן:
1: שער זמן → 2: תאים יחיד → 3: → לויקוציטים קיימא 6: CD45 + תאי → 4: תאים (פסולת נכללה) → 5 CD3 + תאי קיימא אוכלוסייה - לקבוע את התדרים של CD4 +, CD8 +, מסוג CD4 + IFN-γ + CD8 + וIFN-γ + תאי T לאחר תהליך העשרת CCS (טבלה 2).
- השתמש באסטרטגית gating כדי לקבוע את התדרים של CD4 +, CD8 +, מסוג CD4 + IFN-γ + CD8 + וIFN-γ + תאי T שמוצגים להלן ואו חלק מקורי ומועשר (שנתפס) חיובי לאחר תהליך CCS. האזורים שצוינו באופן היררכי צמודים ושם כדלקמן:
1: שער זמן → 2: תאים יחיד → 3: → Leukocytes קיימא 6: CD45 + תאי → 4: תאים (פסולת נכללה) → 5 CD3 + תאי קיימא → 7: תאי CD4 + → 7 א: CD4 + IFN-γ + תאים (תיבה) → 8: CD8 + תאי → 8 א: CD8 + IFN-γ + תאים (תיבה)
הערה: 6 האזורים שצוינו הראשונים של קישורי ההיררכיה זהים איור 3, (1-6) ואחרון 2 אזורים מוצגות באיור 4 (6-8a).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במחקר זה, תא אוטומטי מערכת CCS העשרה שימש לייצור אוטומטי של תאי T pp65 הספציפי CMV. תאי T CMV הספציפי היו מועשרים משלושה מוצרי תא apheresis. מוצר apheresis המצב היציב שנקטף על שעה 2 מתורם CMV-נגוע מחשבה ונוצר 10 10 תאים כולל גרעיניים (TNC). 10 9 TNC אז הופעלו עם פפטידים CMV-נגזר pp65 (60 ננומול) במשך 4 שעות וIFN-γ מפריש תאי T היו מבודדים באמצעות CCS במכשיר העשרת תא האוטומטי. מפעיל נדרש בתחילת הניסוי לטעון את כל חומרים כימיים וערכות צינורות. התקנה של המערכת מהראשונית לפרוק להחל המכשיר לקחה כ 60 עד 120 דקות. שים לב, במכונה ואז ניתן לתכנת כדי להתחיל לאחר ריאגנטים וערכות צינורות נטענים ובכך מאפשרים להתקן לפעול בללא השגחה (כגון לילה). המפעיל נדרש שוב לאחר 15 שעות לביצוע אפיון שלהמוצרים הסופיים לטוהר תא כדאי. לאחר העשרת supernatant התא הוקרן לmycoplasma ונוכחות רעלן פנימי. לאחר אימות, יכולים להיות חדורים תאי מעובד ישירות לחולים או cryopreserved עבור יישומים מאוחר יותר.
ספירת תאים נקבעה התא הבא לספור שיטות סטנדרטי תוך שימוש בנוסחות המובאות בטבלה 2. לכל סוג של ספירת תאים חזר על עצמו שלוש פעמים והתוצאות באו לידי ביטוי בספירת תאים כולל ממוצעת כעם סטיית תקן (SD). דיווחים נותחו באמצעות תוכנה מומלצת מנתח תא. Gating לקבוע לויקוציטים וימפוציטים קיימא מוצג באיור 2. הנתונים לספירת התאים מוצגים בטבלה 3. אסטרטגית gating המשמשת לקביעת תאי IFN-γ + T מוצגת באיור 3 ואיור 4. לפני ההעשרה, כדאיות של תאים באופן שיגרתי הייתה> 95%. לאחר enrichmenלא, את הכדאיות של תאים הייתה <50%. הספירה המוחלטת של IFN-γ + תאי T הוערכה לפני ואחרי תהליך ההעשרה. המספר הכולל של IFN-γ תאים + T לפני ההעשרה היה 1.14 x 10 6 ± 0.35 x 10 6 כפי שנגזר מ- 10 9 החל TNC, ולאחר ההעשרה היה 3.09 x 10 5 ± 1.70 x 10 5 תאים IFN-γ + T. היו 0.16 ± 0.18% IFN-γ + תאי CD4 + T הנוכחיים לפני עיבוד וזה עלה ל -47.5 ± 34.7% לאחר העשרה. אחוז טוהר CD8 + IFN-γ + תאי T לפני הלכידה היה 0.47 ± 0.1%, ועלה ל 90.3 ± 1.7% לאחר ההעשרה (לוח 3 ו -4). התאוששות מדגם בחלק שנתפס (החיובי) הייתה 32.9 ± 15.7% לתאים מסוג CD4 + T ו31.8 ± 13.2% לתאי CD8 + T המבוסס על מדידה של תאי IFN-γ + T בSTA אוכלוסיית rting (לוח 4). נתונים אלה מצביעים על כך שיכולים להיות שנקטפו תאי T pp65 ספציפי שני CD4 + CD8 + וCMV באופן אוטומטי באופן מתאים ליישומם האנושי.
העשרה באיור 1. בתאי T CMV-ספציפיים באמצעות מערכת CCS. () מדרגות עיבוד מרובות מעורבות במכשיר העשרת תאי הדור הראשון מטופלות על ידי אנשי מקצוע מיומנים. (ב) רוב שלבי העיבוד, למעט התקנת צינורות ראשונית, הם אוטומטיים במכשיר העשרת תאי דור השני אשר חוסך 10 - 12 שעות של זמן טיפול מפעיל בהשוואה למכשיר הדור הראשון. תאי T ספציפי לווירוס CMV המועשר מתאפיינים בזרימת cytometry מנתח תא. > אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
2. אסטרטגית gating איור משמשת לקביעת תאי T קיימא. המספרים 1 עד 6 מצביעה תחום היררכית gating המקביל בדמות. (1) הקמת שער זמן, (2) הסרת תאי כפיל ידי התוויית FSC-גובה נגד FSC-שטח (3) זיהוי תאי CD45 +, (4) הסרת פסולת תא (5) בחירת לויקוציטים קיימא ו( 6) לימפוציטים בת קיימא מאוכלוסייה מקורית על ידי צביעת יודיד propidium. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
עומס / 52,808 / 52808fig3.jpg "/>
איור 3. אסטרטגית gating המשמשת לקביעת תאי CD3 + T. Cytometry זרימה למחוק ניתוח תאי CD3 + T לפני (3A) ולאחר העשרת תא (3B) מוצגת כאן. זה חיוני כדי לקבוע כמה תאי T פפטיד מופעל CMV הספציפי נמצאים בדגימות לפני ואחרי תהליך ההעשרה. בנתון זה, מספרים 1 עד 6 מצביעים על אוכלוסיית תאים המקבילה או על ידי גודל או מוכתם על ידי נוגדן ספציפי. (1) הגדרת זמן שער, (2) הסרת תאי כפיל, (3) בחירת CD45 + תאים, (4) הסרת פסולת תא (5) בחירת לויקוציטים קיימא וימפוציטים (6) CD3 קיימא +. צביעת יודיד Propidium בוצעה כדי להסיר תאים מתים."Target =" _ /52808fig3large.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
4. אסטרטגית gating איור משמשת לקביעת טוהר IFN-γ + תאי T. תאי T ספציפי CMV הופעל הם קריטיים לזיהום CMV שליטה, כך IFN-γ + ביטוי בתאי T שימש לgating. IFN-γ + תאי T מסוג CD4 + בקרב וCD8 + תת () לפני ההעשרה ו( ב ') לאחר העשרה. (7/8) אחוז תאי CD4 + T ותאי CD8 + T מוצג בA ו- B. (7 א ) אחוז תאי IFN-γ + CD4 + T מוצג בתיבה מרובעת (א) באזור gating ודומה לC D8 + IFN-γ + תאי T ב( 8 א). "T" מייצג% מתאים באוכלוסייה ו" # "מייצג% מתאים באוכלוסייה מגודרת. צביעת יודיד propidium בוצעה לתאים מתים שער-החוצה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
1. כרכי שולחן של השברים המשמשים לאסטרטגית מכתים תא.
נוסחאות טבלת 2. משמשות לחישוב CD4 + IFN-γ + תאי T לאחר תהליך ההעשרה. חישוב CD8 + IFN-γ + תאי T מתבצעת באופן דומה.
אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.
3. סעיפי שולחן סה"כ תא בתת תא T לפני ואחרי ההעשרה. # לדוגמא 1 תוצאות מוצגות כאן.
שולחן טוהר 4. והתאוששות של IFN-γ תא + T לפני ואחרי תהליך ההעשרה של מדגם מס '1.
תא בטבלה 5. מיון אסטרטגיות בשימוש בבידוד של תאי T הספציפיים CMV-אנטיגן כיתה הקליני. 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טיפול T-cell מאמצת התפתח כאפשרות מעשית לטיפול בגידולים ממאירים B-cell 4. הפוטנציאל הטיפולי שלה תלוי ביציקת המספר הרצוי של תאי T ספציפיים לאנטיגן היעד שחסר replicative הזדקנות 2. זו יכולה להיות מושגת על ידי מיון אוכלוסייה טהורה של תאי T ספציפיים לאנטיגן מתאי T התרחבו בעמידה בנהלי ייצור טובים הנוכחיים. שני הליכי מיון נמצאים בשימוש נרחב, כלומר, תא הקרינה המופעל מיון (FACS) ותא מופעל מגנטי מיון (MACS) כדי ליצור תאי T ספציפיים לאנטיגן CMV כפי שסקרנו לאחרונה 5. היתרון של שימוש באסטרטגיה אחד על פנים השני מתואר בטבלה 5. טכנולוגית MACS מציעה טוהר העשרת תא הגבוה ביותר בדרך זולה ומהירה יותר בהשוואה לטכנולוגית FACS. בשימוש בתוספת של עמודות חד פעמיות וחומרים כימיים להעשרת תאים לחלוטין מונע מדגם לזיהום מדגם שהופך אותוקל יותר ליישם במסגרות קליניות. מכשיר העשרת תא חצי אוטומטי הוא עבודה אינטנסיבית וזמן רב כל כך פיתוח של המכשיר להעשרת תא האוטומטי היו צורך להאכיל ביקוש קליני.
מכשיר CCS העשרת התא האוטומטי הוא כלי רב-תכליתי לבידוד תאי כיתה קליניים כגון תאי גזע hematopoietic, תאי גזע סומטיים, כמו גם תאי T להעברת מאמצת. מכשיר אוטומטי זה משלב עיבוד תא, כולל חלוקה של חומר מוצא, כביסה תא, הפרדת תאים, תרבית תאים, והיווצרות מוצר סופי ביחידה חד פעמית GMP תואם שימוש יחיד. המערכת הסגורה מפחיתה דרישות חדר נקי וממזערת את מעורבות מפעיל לשמירה על מתקני GMP. אוטומציה מפחיתה את הזמן דרוש למפעיל להיות נוכח וכך להקטין את העלויות כרוכות בהליכי מעבדה אלה.
כדי לאמת את המכשיר להעשרת תא האוטומטי, לעומתעם המכשיר להעשרת תאים חצי אוטומטי, שבודדנו תאי T ספציפי CMV לאחר דוגרים פפטידים נגזר pp65 CMV עם מוצר apheresis. CMV הכיתה GMP קוקטייל פפטיד המופק pp65 (למשל PepTivator) הוא בריכת פפטיד שמורכבת בעיקר 15 מר-פפטידים עם 11 חומצות אמינו חפיפה, המכסה את הרצף של חלבון pp65 של ציטומגלווירוס אדם השלם. תשואת התאוששות מדגם הייתה ~ 0.3 10 6 CD3 + IFN-γ תאים + T x 10 9 TNC. מחקרים קליניים הראו כי יציקת כמה אלף תאי T CMV ספציפי כטיפול מניעתי לחולים (~ 360 ל -4,000 תאים / קילוגרם משקל גוף) עוברת HSCT הביאה הגנה נגד CMV. לדוגמא, על מנת לטפל בCMV בניסויים קליניים תוך שימוש בטכנולוגיה זו, מבוגר 70 קילוגרם וילד 30 קילוגרם דורש כנראה רק 0.26-3.0 x 10 5 ו 1 x 10 4-1.2 x 10 5 תאים, בהתאמה, של viral- תאי T ספציפיים 12-15 et al Feuchtinger. 13. מספר גבוה יותר של תאי קיימא יהיה מקובל גם כזה יהיה קשור למספיק חומר לחליטות שונות. עם זאת, תאי קיימא יותר באופן כללי גם אומר יותר תאים אחרים מאשר תאי T (B, NK, וכו '). הנתונים שלנו מראים כי תאי T CMV ספציפיים שנוצרו במערכת העשרת תא האוטומטית הביאו מספרים קליניים-מצודדים של תאי T CMV ספציפי שעשויות אז להיות חדור לאחר HSCT אלוגנאית.
זיהום CMV יכול להיות בעיה גדולה לאחר HSCT וכתוצאה מכך גם תחלואה ותמותה מוגברות. יתר על כן, זיהום CMV קשור עם עלויות מוגברות, למרות ההתקדמות האחרונה באבחון מוקדם וטיפול מוקדם בתרופות אנטי-נגיפיים 16. הטיפול הנוכחי באמצעות ganciclovir וfoscarnet יכול להוביל לרעילות במקבלים רפואית-שבירים של HSCT.התוספת האחורית של תאי T CMV ספציפי תורם נגזרות הודגם למניעה וטיפול בזיהומים אופורטוניסטים במקבלים אלוגנאית HSCT 9. גישה זו לטיפול חיסוני מאמצת גם יושמה כדי לעזור להחזיר את החסינות לפתוגנים אחרים, כגון נגיף אפשטיין-באר (EBV), אדנווירוס 8, ואספרגילוס 3 על ידי דוגרים תאי mononuclear (MNC) עם ריאגנטים קוקטייל פפטיד כיתה קלינית אנטיגן בהתאמה נגזרו ( חומרים והשולחן של הציוד). לאחרונה, חוקרים החדירו בבטחה תאי T של צד השלישי לפתוגן ספציפי שהם מתאימים עם אלל HLA אחד לפחות בנמען מציג פפטיד immunodominant 17. גם מערכת CCS העשרת תא האוטומטית עשויה לשמש כדי ליצור צד שלישי תאי T עבור יישומים מחוץ למדף שיהיו שימושי כאשר התורם הוא CMV-seronegative או לא זמין, כמו במקרה של תורמים לtransplantati דם טבורי אלוגנאיתעל.
לסיכום, אנחנו מדגימים את השירות של מכשיר העשרת תא אוטומטי כדי ליצור תאי T CMV ספציפי המבוססים על אוטומציה של CCS. אנו מאמינים שיש למכשיר זה יש את הפוטנציאל להוריד את הסף לצוותים קליניים להחדיר הפתוגן ספציפי, כמו גם גידול ספציפי, תאי T בחולי מדוכאי חיסון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לשניהם יש מרכז MD Anderson Cancer וד"ר קופר אינטרס כלכלי בZIOPHARM אונקולוגיה, Inc, וחברת Intrexon. ב -7 במאי 2015, ד"ר קופר מונה כמנכ"ל בZIOPHARM אונקולוגיה. ד"ר קופר הוא עכשיו מדען אורח בMD Anderson. ד"ר קופר הקים ומחזיק InCellerate, Inc יש לו פטנטים עם BioSciences Sangamo עם nucleases המלאכותי. הוא מתייעץ עם Targazyme, Inc (תאי גזע בעבר אמריקאים, Inc), GE Healthcare, פרינג תרופות, Therapeutics הגורל, Janssen Pharmaceuticals, ובריסטול-מאיירס סקוויב. הוא במועצה המייעצת המדעית של Cellectis. הוא מקבל שכר טרחה מMiltenyi Biotec.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 ml Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/ml) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
- Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
- Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
- Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
- Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), Available from: http://www.cambridgeresearchcentre.co.uk/all-publications/blood-and-marrow-transplantation/ 55-59 (2014).
- Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
- Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
- Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
- Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
- Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
- Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
- Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
- Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
- Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
- Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).
