Abstract
Der adoptive Transfer von Pathogen-spezifische T-Zellen können verwendet werden zur Vorbeugung und Behandlung opportunistischer Infektionen, wie Cytomegalievirus (CMV) nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation auftritt. Viral-spezifischen T-Zellen von allogenen Spendern, einschließlich Dritter Spender kann ex vivo vermehrt werden in Übereinstimmung mit den geltenden Guten Herstellungspraxis (cGMP) und beschäftigt wiederholte Runden von Antigen-angetriebenen Stimulation, um die gewünschten T-Zellen selektiv zu verbreiten. Die Identifizierung und Isolierung von Antigen-spezifischen T-Zellen kann auch auf der Grundlage der Zytokin-Capture-System der T-Zellen, die aktiviert wurden, um gamma-Interferon (IFN-γ) sekretieren vorgenommen werden. Doch weit verbreiteten Menschen Anwendung der Zytokin-Capture-System (CCS) zur Wiederherstellung der Immunität wurde begrenzt, wie der Produktionsprozess ist zeitaufwendig und erfordert einen erfahrenen Bediener. Die Entwicklung einer zweiten Generation Zellanreicherung Vorrichtung wie CliniMACS Prodigy jetztermöglicht Ermittler viral-spezifischen T-Zellen unter Verwendung eines automatisierten, weniger arbeitsintensiv System zu erzeugen. Diese Vorrichtung trennt magnetisch von unmarkierten Zellen durch magnetische Zellsortierung Technologie klinischem Produkte erzeugen markierten Zellen wird als ein geschlossenes System konstruiert und zugegriffen werden kann und gegen die Arbeitsfläche betrieben werden. Wir demonstrieren die Funktionsweise dieser neuen automatisierten Zellanreicherungsvorrichtung zur CMV pp65-spezifischen T-Zellen, die aus einer stationären Apherese Produkt von einem CMV-seropositiven Spender erhalten erhalten herzustellen. Diese isolierten T-Zellen können dann direkt in einen Patienten unter institutionellen und bundesstaatlichen Regulierungsaufsicht infundiert werden. Alle Bio-Verarbeitungsschritten einschließlich der Entfernung der roten Blutkörperchen, die Stimulation von T-Zellen, die Trennung von Antigen-spezifischen T-Zellen, Reinigung und Waschen sind voll automatisiert. Geräte wie dies die Möglichkeit, dass T-Zellen für die Anwendung beim Menschen kann außerhalb gewidmet guten Herstellungspraxis (GMP hergestellt werden) Einrichtungen und stattdessen in Blutbanken Einrichtungen, in denen Mitarbeiter können automatisierte Protokolle überwachen, um mehrere zu produzieren werden.
Introduction
Hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) 1 kann mit Adoptiv-T-Zell-Therapie kombiniert werden, um Graft-versus-Tumor-Wirkung zu verbessern und Immunität gegen opportunistische Infektionen 2 bereitzustellen. Erzeugung von Antigen-spezifischen Spender abgeleiteten T-Zellen für die Infusion hat historisch erforderlichen Fachkräfte und die Verwendung von spezialisierten Einrichtungen, die GMP-konform sind. Die Lieferung solcher T-Zellen wurde in der Entschließung des opportunistischen Infektionen 3 sowie Behandlung der zugrunde liegenden malignen 4 geführt. Vor kurzem haben Forscher gezeigt, dass der adoptive Transfer von nur wenigen tausend Virus-spezifischen T-Zellen (~ 1 x 10 4 bis 2,5 x 10 5 Zellen / kg Körpergewicht des Empfängers) opportunistische CMV Infektionen nach alloHSZT 5-9 erfolgreich zu behandeln. Eine begrenzte Anzahl von GMP-Anlagen mit zugehörigen Fachfertigungsanforderungen und der hohen Kosten, die mit der Zellproduktion assoziiert hat jedoch restricted Patienten den Zugang zu vielversprechenden T-Zelltherapien 10. Ein Ansatz zum Isolieren von antigenspezifischen T-Zellen basiert auf den CCS Verwendung eines bispezifischen Reagenzes an CD45 und IFN-γ erkennt beruht. Wie gezeigt ist, kann diese Methode verwendet werden, um klinische Studien zu CMV-spezifische T-Zellen unter Verwendung eines automatisierten Zellanreicherung CCS Einrichtung (1B) zu erzeugen.
CMV-spezifische T-Zellen werden durch Inkubation von überlappenden Peptiden von CMV pp65 Antigens mit Leukapherese Gesamtkernzellen (TNC) von CMV-seropositiven Spendern erzeugt. Diese Peptide im Kontext von Human-Leukozyten-Antigen (HLA) angezeigt wird, aktivieren die CMV pp65-spezifischen T-Zellen innerhalb der TNC zu IFN-γ sezernieren. Diese T-Zellen können dann "eingefangen" werden und magnetisch getrennt. Der Betrieb der ersten Generation Zellanreicherungseinrichtung (1A) unter GMP-Bedingungen erforderliche Personal Mann Zellkultur, und die Koordination der Mitarbeiter, um die Mehrfach s verpflichtenTEPs notwendig, eine "eingefangen" Produkt zu erzeugen.
Das Verfahren in der Regel erforderlich, 10 bis 12 h Dauerbetrieb, und damit Personal wahrscheinlich benötigen, um mehr als zwei Schichten in der GMP-Anlage zu arbeiten. Diese Beschränkungen werden nun durch die Durchführung einer zweiten Erzeugungsvorrichtung (in 1B gezeigt) vermieden. Diese Vorrichtung übernimmt magnetische Anreicherung, ähnlich zu der ersten Erzeugungseinrichtung, aber automatisiert andere Aspekte der CCS in einem unbreached Ansatzes. Dies reduziert die Belastung für die GMP-Team als die meisten Schritte können unbeaufsichtigt von Mitarbeitern durchgeführt werden. Da ferner die Vorrichtung arbeitet als geschlossenes System, können die Antigen-spezifischen T-Zellen, aufgenommen und gegen die Arbeitsfläche mit Ausnahme der Schritte in Leukapherese Isolierung und Herstellung von Materialien vor dem Starten des Instruments eingebundenen verarbeitet werden. Details des kompletten Instrumentierung und Funktionalität dieser zweiten Generation Zellanreicherungsvorrichtung wurden published 11.
Hier beschreiben wir die Schritte zum CMV pp65-spezifischen T-Zellen aus einer stationären Aphereseprodukt Verwendung des automatischen Zellanreicherung CCS-System anzureichern. Nachdem sie isoliert wurde, kann diese CMV-spezifische T-Zellen sofort in einen Patienten infundiert werden.
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Protocol
1. Herstellung des Materials unter sterilen Bedingungen (siehe Materialien und Geräte Tabelle)
- Vorbereitung 3 l PBS / EDTA-Puffer mit humanem Serumalbumin (HSA) ergänzt, um eine Endkonzentration von 0,5% (w / v).
- Bereiten Sie 1 L Tasche von klinischen Grade 0,9% Natriumchlorid (NaCl) -Lösung und 2 l GMP Grade-Zellkulturmedium.
- Bereiten Sie 60 nmol von CMV-spezifischen Peptid-Antigen-Cocktail durch Rekonstitution eines Fläschchens CMV pp65 mit 8 ml sterilem Wasser.
- Bringen CMV pp65-Peptid-Cocktail in ein 50 ml Volumen Gefrierbeutel mit einem Luer / Spike Verbindungsleitung und klemmen mit Sicherungszange an nachfolgende Verteilung der Cocktail in das Schlauchsystem zu vermeiden. Offene Zellanreicherung Schlauchsatz (TS 500) unter sterilen Bedingungen.
- Mit einer sterilen Schlauchschweißgerät, schließen Peptidcocktail Gefrierbeutel in Rohranschluss für Ventil 2 der Schlauchsatz TS 500, die das Peptid-Cocktail Beutelklemme zu diesem Zeitpunkt nicht öffnen.
- 1 Entfernen x 10 9 TNC aus Ausgangszellprodukt und setzt in PBS / EDTA-Puffer, enthaltend 2,5% HSA mit einem Gesamtvolumen von 50 ml. Spritzen Sie das Zellprodukt in einen 150 ml Transferbeutel.
2. Herstellung und Einsatz von automatisierten Zellanreicherung System (siehe Materialien und Geräte Tabelle)
- Schalten Sie den Zellanreicherungssystem (1B), und wählen Sie das Programm "CCS_IFN-γ Enrichment". Beobachten eine Benutzerschnittstelle, die Siebe mit Anweisungen und Abbildungen Führung der Bedienungsperson durch das Verfahren.
- Geben Sie den Parameter "Operator" und "Tubing Set P / N Nein". Als nächstes installieren Sie das Tubing Set 500 um automatisierten Zellanreicherung Gerät gemäß den Anweisungen auf dem interaktiven Bildschirm angezeigt.
- Befolgen Sie die Anweisungen Schritt für Schritt auf dem Bildschirm angezeigt, um das Medium und Puffer an das Gerät anschließen. Nehmen Sie Katalognummer und Chargennummer der Reagenzien vor connecting an das Instrument.
- Nach der letzten Überprüfung der Schlauchsatz, öffnen Sie die Klemme des Peptids Cocktail Tasche. Öffnen Sie das Medium Tasche und initiieren automatischer Entlüftung des Schlauchsets.
- Nach dem Entlüftungsschritt abgeschlossen ist, ergänzen HSA (2,5%) in NaCl-Puffer in der Reservoirbeutel (200 ml) mit Hilfe der sterilen Schlauchschweißgerät. Übertragen Sie die Ausgangszellprodukt in die Verwendung der sterilen Schlauchschweißgerät "Application-Tasche".
- Schließen CCS (IFNy) Reagenzien in entsprechende Rohr über Adapter. Geben Sie bevorzugte Zeit, um eine Fraktion von Zellmaterial vor dem Anreicherungsprozess zu sammeln. Bewertung und Überprüfung der Richtigkeit aller Daten / eingegebenen Parameter. Starten Sie den Prozess.
- Vor dem Start der automatisierten Zellanreicherungsprozess, entfernen Sie die Qualitätskontrolle Bag (QCB, original Fraktion (ori) enthält etwa 1,3 ml von 100 ml Inhalt Kammer mit PBS / EDTA-Puffer verdünnt). Dichten Sie das QCB, wiegen, und bei 4 ° C.
- Starten Sie den enrichment-Prozess. Am Ende des Prozesses werden die Zielzellen mit einem ungefähren Volumen Elutionspuffer aus dem Reservoirbeutel eluiert werden.
- Dichten Sie das Nichtzielzelle Bag (NTCB, negative Fraktion = neg) und Zielzelle Bag (TCB, positive Fraktion = pos) und wiegen jede Tasche. Die Gewichte werden später für die Berechnung der Zellzahl verwendet werden.
- Unmittelbar nach dem Anreicherungsverfahren sammeln zwei Aliquots pro Fraktion für die Durchflußzytometrie-Analyse, und der Rest der Proben bei 4 ° C. Verwenden Sie eine Probenaliquot zur Zellzahlbestimmung und die andere Probenaliquot zur Anreicherung Performance-Analyse (Tabelle 1).
- Entfernen Sie den Schlauch von der Zellanreicherung Instrument festgelegt. Übertragen Sie die Protokolldatei auf einem USB-Laufwerk für die zukünftige Verwendung.
HINWEIS: Alle Reagenzien werden unter sterilen Bedingungen hergestellt werden. Die Verwendung eines Biosafety Typ-II-Haube ist sehr zu empfehlen. Verwenden stationären Apherese Zellprodukt (nicht mobilisiert) von einem gesunden isoliertCMV-seropositiven Spender zum CMV-Antigen-spezifischen T-Zellen anzureichern. Nur FDA lizenziert HSA verwendet werden. Der Puffer für Zellpräparation sollte +19 ° C bis +25 ° C, niedrigere oder höhere Umgebungstemperaturen führt zu verminderter Reinheit und einer reduzierten Ausbeute der Zielzellen führen, gehalten werden.
3. Zellzahlbestimmung
- Nehmen die Portionen von QCB, NTCB und TCB für Zellzahlen, wie in Tabelle 1 gezeigt. In CD45-VoBlue zu jedem Aliquot (Titer 1,11) und Inkubieren im Dunkeln für 10 min bei 4 ° C.
- 1,5 ml frisch hergestelltem Lyse der roten Blutkörperchen-Lösung (1x) auf die ursprüngliche Fraktion und negativen Fraktion, 450 & mgr; l frisch hergestellte Lyse roter Blutkörperchen Lösung der positiven Fraktion und Inkubieren aller Fraktionen für 15 min bei RT.
- Gerade vor der Analyse hinzuzufügen Propidiumiodid in einer Endkonzentration von 1 ug / ml (1: 100 Verdünnung von 100 ug / ml). Verwenden Sie die automatische Zellzähler auf Zellzahl und vi zu bestimmenFähigkeit. Verwenden Sie Zellzähler Gerät empfohlene Software für die Durchflusszytometrie-Analyse. Bestimmen Sie die absolute Zählungen von Leukozyten für original, negative und positive Fraktionen.
HINWEIS: Die Zellzahl der lebensfähigen Leukozyten pro ml der Proben zur Analyse entnommen Zellzahl wird unter Verwendung des Zellanalyse empfohlene Software bestimmt. - Stellen Sie den Bereich, wie in Abbildung 2 (Bereich 5, lebensfähigen Leukozyten) gezeigt. Verwenden Sie die folgenden Gating-Strategie zur Zellzahl zu bestimmen. Ein lebensfähiger Leukozyten in Original Fraktion wird in Abbildung 2 dargestellt.
- Die genannten Bereiche (2, 1-6) sind hierarchisch, wie folgt:
1: Zeit Gate → 2: Einzelzellen → 3: CD45 + Zellen → 4: Leukozyten (Ablagerungen ausgeschlossen) → 5: Lebensfähige Leukozyten → 6: Lebensfähige Lymphozyten - Wiederholen Sie die gleichen Schritte, um Zellzahlen für negative und positive Fraktionen zu bestimmen. Berechnung der Zellzahl von der gesamten Fraktionunter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors der Probe, und das Gesamtvolumen der Fraktion (Tabelle 2).
4. Prüfung der Trennleistung
- Mit vorgekühlten PBS / EDTA-Puffer / 0,5% AB-Serum Waschen Sie die Teilmengen von QCB, NTCB und TCB Bruchzellen. Zentrifugieren der Zellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C und saugt den Überstand.
- Die Zellen in 100 & mgr; l Antikörper-Fluorochrom-Färbung Mischung enthaltend: CD3-FITC, CD4-APC CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue und anti-IFN-PE (Titer 1,11) und Inkubieren im Dunkeln für 10 min bei 4 ° C.
- 1 ml frisch hergestelltes Lyse der roten Blutkörperchen-Lösung (1x) und Inkubation für 15 min bei RT. Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C und saugt den Überstand. Resuspendieren der Zellen in einem geeigneten Volumen von PBS / EDTA-Puffer / 0,5% AB-Serum.
- Hinzufügen Propidiumiodid in einer Endkonzentration von 1 ug / ml unmittelbar vor der Analyse (1: 100 dilutiauf 100 & mgr; g / ml). Zuführen Durchflusszytometrie, um die Reinheit der Probe zu bewerten.
- Verwenden Sie die folgenden Gating-Strategie, um die CD3 + T-Zellen in lebensfähiger Leukozyten-Gating-Strategie zur Bestimmung der CD3 + T-Zellen in positiven Fraktion nach CCS Anreicherungsprozess gezeigt, zu berechnen. Die angegebenen Bereiche (3A und 3B, 1-6) sind hierarchisch wie folgt verbunden:
1: Zeit Gate → 2: Einzelzellen → 3: CD45 + Zellen → 4: Zellen (Ablagerungen ausgeschlossen) → 5: Lebensfähige Leukozyten → 6: Lebensfähige CD3 + Zellen Bevölkerung - Bestimmen die Frequenz von CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + und CD8 + IFN-γ + T-Zellen nach CCS Anreicherungsverfahren (Tabelle 2).
- Verwenden die Gating-Strategie, die Frequenzen der CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + und CD8 + IFN-γ + T-Zellen unter f dargestellten bestimmenoder ein Original und angereicherten (gefangenen) positive Fraktion nach CCS-Verfahren. Die angegebenen Bereiche sind hierarchisch verknüpft und wie folgt benannt:
1: Zeit Gate → 2: Einzelzellen → 3: CD45 + Zellen → 4: Zellen (Ablagerungen ausgeschlossen) → 5: Lebensfähige Leukozyten → 6: Lebensfähige CD3 + Zellen → 7: CD4 + -Zellen → 7a: CD4 + IFN-γ + Zellen (box) → 8: CD8 + -Zellen → 8a: CD8 + IFN-γ + Zellen (Kasten)
HINWEIS: Die ersten 6 angegebenen Regionen der Hierarchieverbindungen sind die gleichen wie in Figur 3, (1-6) und zuletzt 2-Regionen sind in Abbildung 4 (6-8a) gezeigt.
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Representative Results
In dieser Studie wurde eine automatisierte Zellanreicherung CCS System zur automatisierten Erzeugung von CMV pp65-spezifischen T-Zellen verwendet. CMV-spezifische T-Zellen wurden aus drei Apherese Zellprodukten angereichert. Die Steady-State-Apherese-Produkt wurde über 2 Stunden von einem CMV-seropositiven Spender 10 10 Gesamtkernzellen (TNC) geerntet und erzeugt. 10 9 TNC wurden dann mit CMV pp65 abgeleitete Peptide (60 nmol) für 4 Stunden und die IFN-γ sezernierenden T-Zellen wurden mit Hilfe der CCS auf der automatisierten Zellanreicherungsvorrichtung getrennt aktiviert. Ein Operator wurde zu Beginn des Versuchs benötigt, um alle Reagenzien und Schlauchsätze laden. Aufbau des Systems von der Anfangs Auspacken bis zum Starten der Vorrichtung dauerte etwa 60 bis 120 min. Beachten Sie, die Maschine kann dann so programmiert, dass nach so werden die Reagenzien und Schlauchsets geladen ermöglicht die Maschine unbeaufsichtigt (zB über Nacht) zu starten. Der Betreiber wurde erneut nach 15 Stunden benötigt, um Charakterisierung durchführendie Endprodukte für die Zell Reinheit und Lebensfähigkeit. Nach Anreicherung wurde der Zellüberstand auf Mykoplasmen und Endotoxin Präsenz gescreent. Nach der Validierung werden die verarbeiteten Zellen können direkt in Patienten oder kryokonserviert für spätere Anwendungen infundiert werden.
Zellzählungen wurden nach Zellzählung Standardverfahren unter Verwendung der Formeln in Tabelle 2 bestimmt. Jede Art von Zellzahl wurde dreimal wiederholt, und die Ergebnisse wurden als mittlere Gesamtzellzählungen mit Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Berichte wurden dann unter Verwendung von Zellanalysegerät empfohlen Software analysiert. Gating lebensfähige Leukozyten und Lymphozyten zu bestimmen, ist in 2 gezeigt. Die Daten für die Zellzahlen sind in Tabelle 3 dargestellt. Die Gating-Strategie verwendet werden, um IFN-γ + T-Zellen zu bestimmen, ist in 3 und 4 gezeigt. Bevor die Anreicherung, die Lebensfähigkeit der Zellen wurde routinemäßig> 95%. Nach enrichment, die Lebensfähigkeit der Zellen betrug <50%. Die absolute Zählung von IFN-γ + T-Zellen wurde vor und nach dem Anreicherungsverfahren beurteilt. Die Gesamtzahl der IFN-γ + T-Zellen vor der Anreicherung betrug 1,14 x 10 & sup6; ± 0,35 × 10 6, wie aus 10 9 ab TNC abgeleitet und nach Anreicherung 3,09 x 10 5 ± 1,70 × 10 5 IFN-γ + T-Zellen. Es wurden 0,16 ± 0,18% IFN-γ + CD4 + T vorhanden vor der Verarbeitung Zellen und dies erhöhte sich auf 47,5 ± 34,7% nach der Anreicherung. Die Reinheit Prozentsatz der CD8 + IFN-γ + T-Zellen vor der Abscheidung betrug 0,47 ± 0,1% und erhöhte sich auf 90,3 ± 1,7% nach der Anreicherung (Tabelle 3 und 4). Probenrückgewinnung in dem erfassten (positiv) Fraktion betrug 32,9 ± 15,7% für CD4 + T-Zellen und 31,8 ± 13,2% für CD8 + T-Zellen, basierend auf der Messung des IFN-γ + T-Zellen in der sta rting Bevölkerung (Tabelle 4). Diese Daten zeigen, dass sowohl CD4 + und CD8 + CMV pp65-spezifischen T-Zellen kann automatisch in einer für ihre Anwendung beim Menschen Weise geerntet werden.
Abbildung 1. Anreicherung von CMV-spezifischen T-Zellen unter Verwendung von CCS-System. (A) mehrere Bearbeitungsschritte in der ersten Generation Zellanreicherungseinrichtung handelt, die von Fachkräften behandelt werden. (B) Die meisten der Verarbeitungsschritte, außer anfänglichen Schlauchaufbau, sind automatisiert in der zweiten Generation Zellanreicherung Gerät, das spart 10 - 12 h Betreiber Bearbeitungszeit im Vergleich zu der ersten Generation-Gerät. Die angereicherten CMV-Virus-spezifischen T-Zellen werden durch die Durchflusszytometrie Zellanalysator gekennzeichnet. > Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Gating-Strategie verwendet, um lebensfähige T-Zellen zu bestimmen. Die Nummern 1 bis 6 zeigen die entsprechenden Gating Hierarchie-Domaine in der Abbildung. (1) Einrichten Zeittor, (2) Entfernen Wams Zellen durch Auftragen von FSC-Höhe gegen FSC-Bereich (3) Identifizierung von CD45 + Zellen (4) Entfernen von Zelltrümmern (5) Auswählen tragfähige Leukozyten und (6) Lebensfähige Lymphozyten aus ursprünglichen Bevölkerung von Propidiumiodid-Färbung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 3. Gating-Strategie verwendet, um CD3 + T-Zellen zu bestimmen. Durchflusszytometrie-Analyse von CD3 + T-Zellen vor (3A) und nach (3B) Anreicherung von Zellen wird hier gezeigt. Es ist wichtig, festzustellen, wieviele CMV-spezifischen Peptid-aktivierten T-Zellen vor und nach der Anreicherungsprozess vorhanden sind in den Proben. In dieser Figur ist die Nummern 1 bis 6 zeigen die entsprechenden Zellpopulation entweder durch Größe oder durch einen spezifischen Antikörper gefärbt. (1) Einrichten zeit Tor, (2) Entfernen Wams-Zellen, (3) Auswahl CD45 + Zellen, (4) Entfernen von Zelltrümmern abzentrifugiert (5) Auswahl von lebensfähigen Leukozyten und (6) Lebensfähige CD3 + -Lymphozyten. Propidiumiodid-Färbung wurde durchgeführt, um tote Zellen zu entfernen./52808fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Gating-Strategie verwendet, um die Reinheit des IFN-γ + T-Zellen zu bestimmen. Aktiviert CMV-spezifische T-Zellen sind wichtig für die Steuerung einer CMV-Infektion, so IFN-γ + Expression auf T-Zellen wurden für Gating verwendet. IFN-γ + -T-Zellen unter den CD4 + und CD8 + Teilmengen (A) vor der Anreicherung und (B) nach der Anreicherung. (7/8) Prozentsatz der CD4 + T-Zellen und CD8 + T-Zellen ist in A und B gezeigt. (7a ) Prozentsatz der CD4 + IFN-γ + T-Zellen in der viereckigen Kasten (a) innerhalb des Anschnittbereich für C gezeigt, und in ähnlicher Weise D8 + IFN-γ + T-Zellen in (8a). "T" steht für% der Zellen in der Gesamtbevölkerung und "#" steht für% der Zellen in gated Bevölkerung. Propidiumiodid-Färbung wurde auf Gate-out toten Zellen durchgeführt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1 Volumes der zur Zellfärbung Strategie verwendet Fraktionen.
Tabelle 2 Formel zur Berechnung der CD4 + IFN-γ + T-Zellen nach der Anreicherungsprozess. Berechnung der CD8 + IFN-γ + -T-Zellen verwendet wird, auf ähnliche Weise durchgeführt.
Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
Tabelle 3. Gesamtzellzahl in T-Zell-Untergruppen vor und nach der Anreicherung. Probe # 1 Ergebnisse sind hier dargestellt.
Tabelle 4 Reinheit und Rückgewinnung von IFN-γ-T-Zell vor und nach Anreicherungsverfahren der Probe # 1.
Tabelle 5. Zellsortierung Strategien zur Isolierung von klinischer Qualität CMV-Antigen-spezifischen T-Zellen verwendet. 5
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Discussion
Adoptive T-Zell-Therapie hat sich als praktikable Option, um B-Zell-Malignitäten 4 Behandlung entstanden. Sein therapeutisches Potential ist abhängig von der Infusion der gewünschten Anzahl von Ziel-Antigen spezifischen T-Zellen, die replikative Seneszenz 2 fehlt. Dies kann durch Aussortieren eine reine Population von Antigen-spezifischen T-Zellen aus expandierten T-Zellen in Übereinstimmung mit den geltenden guten Herstellungspraxis erreicht werden kann. Zwei Sortierverfahren sind weit verbreitet, nämlich Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) und magnetische Zellsortierung (MACS) gegen CMV-Antigen spezifischen T-Zellen zu erzeugen, wie wir kürzlich 5 überprüft. Der Vorteil der Verwendung einer Strategie über die andere ist in Tabelle 5 dargestellt. MACS-Technologie bietet die höchste Zellanreicherung Reinheit in günstiger und schneller Art und Weise, verglichen mit FACS-Technologie. Zusätzlich Nutzung von Einweg-Säulen und Reagenzien für die Zellanreicherung völlig verhindert Probe zu Probe Kontamination ist damiteinfacher, in der klinischen Einstellungen zu übernehmen. Das halbautomatisierte Zellanreicherungseinrichtung ist arbeitsintensiv und zeitaufwendig, so Entwicklung der automatisierten Zellanreicherungsvorrichtung erforderlich war, um klinische Bedarf zuzuführen.
Die automatisierte Zellanreicherung CCS Vorrichtung ein vielseitiges Instrument zur Isolierung von klinischer Qualität Zellen, wie hämatopoetische Stammzellen, somatische Stammzellen, sowie T-Zellen für die adoptive Transfer. Dieses automatisierte Vorrichtung integriert Zellverarbeitung, einschließlich der Fraktionierung des Ausgangsmaterials, Waschen der Zellen, Zellabtrennung, Zellkultur, und dem fertigen Produkt-Bildung in einem Einweg-GMP-konforme Wegwerfeinheit. Das geschlossene System reduziert die Reinraumanforderungen und minimiert Bediene für die Aufrechterhaltung der GMP-Anlagen. Automation reduziert die Zeit für einen Bediener erforderlich anwesend zu sein, wodurch die Kosten mit diesen Laborverfahren assoziiert abnimmt.
Um den automatisierten Zellanreicherungseinrichtung zu überprüfen, verglichenmit dem halbautomatischen Zellanreicherungsvorrichtung isolierten wir CMV-spezifische T-Zellen nach Inkubation CMV pp65 abgeleitete Peptide mit einer Apherese-Produkts. GMP Grade CMV pp65-Peptid-Cocktail (zB PepTivator) ist ein Peptid-Pool, der hauptsächlich aus 15-mer-Peptide mit 11 Aminosäuren überlappen, besteht, der die gesamte Sequenz des pp65-Protein von humanem Cytomegalovirus. Probenrückgewinnungsausbeute betrug ~ 0,3 x 10 6 CD3 + IFN-γ + T-Zellen von 10 9 TNC. Klinische Studien haben gezeigt, dass die Infusion ein paar tausend CMV-spezifische T-Zellen als eine prophylaktische Behandlung von Patienten (~ 360 bis 4000 Zellen / kg Körpergewicht) unterzogen HSCT ergab Schutz gegen CMV. Zum Beispiel, um CMV in klinischen Studien zu behandeln, die diese Technologie, einen 70 kg schweren Erwachsenen und einem Kind 30 kg offensichtlich erfordern lediglich 0,26 bis 3,0 x 10 5 und 1 x 10 4 bis 1,2 x 10 5 Zellen jeweils von viral- T-Zellen 12-15 spezifischen et al. 13 gezeigt. Eine höhere Anzahl von lebensfähigen Zellen wäre auch akzeptabel sein, da dies mit ausreichend Material für verschiedene Infusionen zugeordnet werden. Das bedeutet aber, mehr lebensfähigen Zellen in der Regel auch andere als T-Zellen (B, NK, etc.) Zellen. Unsere Daten zeigen, dass die CMV-spezifische T-Zellen auf der automatisierten Zellanreicherungssystem erzeugt zu klinisch ansprechende Zahl von CMV-spezifischen T-Zellen, die dann nach alloHSZT infundiert werden kann.
CMV Infektion kann ein Hauptproblem sein, nachdem HSCT was sowohl zu einer erhöhten Morbidität und Mortalität. Weiterhin wird eine CMV-Infektion mit erhöhten Kosten verbunden, trotz der jüngsten Fortschritte in der Frühdiagnose und frühe Behandlung mit antiviralen Medikamenten 16. Die derzeitige Behandlung mit Ganciclovir und Foscarnet kann, um die Toxizität in medizinisch fragile Empfänger von HSCT führen.Die Hinzurechnung von dem Spender abgeleiteten CMV-spezifische T-Zellen wurde gezeigt, zur Vorbeugung und Behandlung opportunistischer Infektionen bei Empfängern von alloHSZT 9. Dieser Ansatz für die adoptive Immuntherapie wurde auch angewendet, um zur Wiederherstellung der Immunität gegenüber anderen Erregern, wie dem Epstein-Barr-Virus (EBV), Adenovirus 8 und Aspergillus 3 durch Inkubation mononukleären Zellen (MNC) mit entsprechenden Antigen abgeleitet von klinischer Qualität Peptidcocktail Reagenzien ( Materialien und Ausrüstung der Tabelle). Vor kurzem haben Forscher sicher infundiert Fremd Pathogen-spezifische T-Zellen, die mit mindestens einem HLA-Allel in dem Empfänger präsentiert immunodominante Peptid 17 abgestimmt sind. Die automatisierte Zellanreicherung CCS-System kann auch verwendet werden, um Drittanbieter-T-Zellen für die off-the-shelf-Anwendungen, die nützlich sein wird, wenn der Spender CMV-seronegative oder nicht verfügbar sind, wie zum Beispiel der Fall bei Spendern für allogene Nabelschnurblut transplantati generierenam.
Zusammenfassend zeigen wir die Nützlichkeit eines automatisierten Zellanreicherungseinrichtung zu CMV-spezifische T-Zellen auf die Automatisierung der CCS erzeugen. Wir glauben, dass diese Vorrichtung hat das Potenzial, die Schwelle bei klinischen Teams erregerspezifischen infundieren sowie tumorspezifische T-Zellen in Patienten mit geschwächtem Immunsystem.
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Disclosures
Sowohl MD Anderson Cancer Center und Dr. Cooper haben ein finanzielles Interesse an ZIOPHARM Oncology, Inc., und Intrexon Corporation. Am 7. Mai 2015 wurde Dr. Cooper als Chief Executive Officer bei ZIOPHARM Onkologie ernannt. Dr. Cooper heute ist er Gastwissenschaftler am MD Anderson. Dr. Cooper gegründet und besitzt InCellerate, Inc. Er hat Patente mit Sangamo BioSciences mit künstlichen Nukleasen. Er berät sich mit Targazyme, Inc. (ehemals amerikanischen Stammzellen, Inc.), GE Healthcare, Ferring Pharmaceuticals, Fate Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals und Bristol-Myers Squibb. Er ist auf dem wissenschaftlichen Beirat von Cellectis. Er erhält Honorare von Miltenyi Biotec.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 ml Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/ml) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
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