Abstract
نقل بالتبني من الخلايا T الممرض محددة يمكن استخدامها لمنع وعلاج الأمراض الانتهازية مثل الفيروس المضخم للخلايا (CMV) العدوى التي تحدث بعد خيفي المكونة للدم زرع الخلايا الجذعية. خلايا T الفيروسية محددة من الجهات المانحة خيفي، بما في ذلك الجهات المانحة طرف ثالث، يمكن نشر السابقين الجسم الحي في الامتثال مع الممارسة الحالية التصنيع الجيدة (المركب)، وتوظيف الجولات المتكررة من التحفيز يحركها مستضد لنشر انتقائي خلايا T المطلوب. ويمكن أيضا أن تضطلع تحديد وعزل الخلايا T مستضد معين بناء على نظام التقاط خلوى الخلايا T التي تم تفعيلها لإفراز الإنترفيرون جاما (IFN-γ). ومع ذلك، التطبيق البشري على نطاق واسع للنظام التقاط خلوى (CCS) للمساعدة في استعادة الحصانة كانت محدودة لأن عملية إنتاج تستغرق وقتا طويلا وتتطلب مشغل المهرة. تطوير جهاز لتخصيب الخلية الجيل الثاني مثل CliniMACS معجزة الآنتمكن المحققون على توليد خلايا T الفيروسية محددة باستخدام، أقل النظام كثيفة العمالة الآلي. هذا الجهاز يفصل صفت مغناطيسيا الخلايا من الخلايا غير المسماة باستخدام المغناطيسية تنشيط الخلايا التكنولوجيا الفرز لتوليد المنتجات السريرية الصف، كما تم تصميم نظام مغلق ويمكن الوصول إليها وتعمل على الفوق. ونحن لشرح تشغيل هذا الجهاز الجديد لتخصيب الخلية الآلي لتصنيع خلايا T pp65 محددة CMV تم الحصول عليها من المنتج فصادة الحالة المستقرة التي تم الحصول عليها من متبرع مصاب بالفيروس المضخم للخلايا. ويمكن بعد ذلك هذه الخلايا T معزولة أن غرست مباشرة إلى المريض تحت الإشراف التنظيمي المؤسسي والاتحادي. كل الخطوات لمعالجة الحيوية بما في ذلك إزالة خلايا الدم الحمراء، ومؤتمتة بالكامل تحفيز خلايا T، وفصل الخلايا مستضد معين T، وتنقية، والغسيل. الأجهزة مثل هذه تثير احتمال أن خلايا T للتطبيق البشري يمكن تصنيعها خارج مخصصة الممارسات التصنيعية الجيدة (GMP) أن تنتج المرافق وبدلا من ذلك في التسهيلات المصرفية الدم حيث يمكن للموظفين الإشراف بروتوكولات الآلي لإنتاج منتجات متعددة.
Introduction
للدم زرع الخلايا الجذعية (HSCT) 1 يمكن الجمع بين العلاج T-خلية بالتبني لتحسين الطعم ضد الورم تأثير وتوفير الحصانة للعدوى الانتهازية 2. جيل من الخلايا T-المستمدة المانحة مستضد معين للتسريب قد تطلبت من الناحية التاريخية الموظفين المهرة واستخدام المرافق المتخصصة التي GMP المتوافقة. وقد نتج عن تسليم مثل هذه الخلايا T في القرار من العدوى الانتهازية 3 وكذلك علاج الورم الخبيث الكامن 4. في الآونة الأخيرة، وقد أثبتت المحققين أن نقل بالتبني من بضعة آلاف فقط خلايا T الفيروس محددة (~ 1 × 10 4-2،5 × 10 5 خلايا / كغم من وزن الجسم المتلقي) يمكن علاج الالتهابات الانتهازية CMV بعد خيفي HSCT 5-9 بنجاح. وهناك عدد محدود من مرافق GMP بما يرتبط بها من متطلبات التصنيع الماهرة والتكلفة العالية المرتبطة بإنتاج الخلايا ومع ذلك، فقد restricted وصول المريض إلى اعدا العلاجات T-10 خلية. ويستند نهج واحد لعزل خلايا T مستضد معين على CCS باستخدام كاشف ثنائية محددة للاعتراف CD45 وIFN-γ. كما هو مبين، هذه المنهجية يمكن استخدامها لتوليد السريرية الصف CMV محددة خلايا T توظيف مؤتمت الجهاز CCS تخصيب الخلية (الشكل 1B).
يتم إنشاء خلايا T CMV الخاصة التي يحتضنها الببتيدات متداخلة من CMV pp65 المستضد مع مجموع الخلايا فصادة الكريات البيض النووية (TNC) من المانحين CMV-مصليا. هذه الببتيدات، المعروضة في سياق الكريات البيض مستضد البشرية (HLA)، وتفعيل خلايا T CMV pp65 محددة داخل المجلس الوطني الانتقالي لإفراز الإنترفيرون γ. هذه الخلايا T ويمكن بعد ذلك أن "القبض" وفصل مغناطيسيا. تشغيل الجهاز من الجيل الأول لتخصيب الخلية (الشكل 1A) المطلوبة الموظفين المهرة في زراعة الخلايا في ظل ظروف GMP، والتنسيق من الموظفين للقيام ليالي متعددةteps اللازمة لتوليد منتج "القبض".
الإجراء المطلوب عادة 10-12 ساعة من العمل المتواصل، وبالتالي من المرجح الموظفين بحاجة إلى العمل على فترتين في منشأة GMP. ويتجنب هذه القيود الآن من تنفيذ جهاز الجيل الثاني (هو مبين في الشكل 1B). يتعهد هذا الجهاز تخصيب المغناطيسي، مماثل لجهاز الجيل الأول، ولكن بأتمتة جوانب أخرى من قانون الأحوال المدنية في نهج unbreached. هذا يخفف كثيرا من عبء على الفريق GMP لأن معظم الخطوات التي يمكن أن يتحقق دون مراقبة من قبل الموظفين. وعلاوة على ذلك، لأن الجهاز يعمل كنظام مغلق، وخلايا T مستضد معين يمكن الحصول عليها ومعالجتها على الفوق باستثناء الخطوات المتبعة في عزلة فصادة الكريات البيض وإعداد المواد قبل البدء في الصك. وقد حانة تفاصيل الأجهزة كاملة وظيفة هذا الجهاز تخصيب الخلية الجيل الثانيأسسنا 11.
هنا، نحن تصف الخطوات لإثراء CMV خلايا T pp65 محددة من منتج فصادة الحالة المستقرة باستخدام نظام CCS تخصيب الخلية الآلي. معزولة مرة واحدة، وهذه الخلايا T-CMV محدد قد غرست مباشرة إلى المريض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد المواد تحت العقيمة شروط (انظر المواد والمعدات الجدول)
- إعداد 3 L من PBS / EDTA العازلة تستكمل مع ألبومين المصل البشري (HSA) إلى تركيز النهائي من 0.5٪ (ث / ت).
- إعداد 1 L كيس من السريري الصف 0.9٪ كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) حل و2 L من GMP الصف خلية ثقافة المتوسط.
- إعداد 60 نانومول من CMV محددة الببتيد مستضد كوكتيل خلال إعادة تأسيس قنينة واحدة من CMV pp65 مع 8 مل من الماء المعقم.
- نقل CMV pp65 الببتيد الكوكتيل الى تجميد كيس 50 حجم مل باستخدام لور / سبايك interconnector والمشبك مع قفل ملقط لتجنب التوزيع لاحق من الكوكتيل في مجموعة الأنابيب. خلية مفتوحة مجموعة أنابيب التخصيب (TS 500) تحت ظروف معقمة.
- استخدام معقم أنابيب لحام، وربط الببتيد كوكتيل كيس تجميد في اتصال أنبوب صمام 2 من مجموعة أنابيب TS 500. لا تفتح الحقيبة الببتيد كوكتيل المشبك في هذا الوقت.
- إزالة 1 × 10 9 TNC بدءا من المنتجات الخلوية وتعليق في برنامج تلفزيوني / EDTA العازلة التي تحتوي على 2.5٪ HSA إلى إجمالي حجم 50 مل. حقن المنتج الخلوي في كيس نقل 150 مل.
استخدام الآلي نظام خلية إثراء 2. إعداد و(انظر المواد والمعدات الجدول)
- تشغيل نظام تخصيب الخلية (الشكل 1B) وحدد البرنامج "CCS_IFN-γ التخصيب". مراقبة واجهة المستخدم تظهر الشاشات مع التعليمات والصور الإرشادية المشغل من خلال هذا الإجراء.
- أدخل المعلمة "المشغل" و "أنابيب مجموعة P / N لا". المقبل، تثبيت الجهاز الأنابيب مجموعة 500 لتخصيب الخلية الآلي حسب التعليمات التي تظهر على الشاشة التفاعلية.
- اتبع التعليمات خطوة بخطوة المعروضة على الشاشة لربط المتوسطة ومخازن للجهاز. سجل رقم الكتالوج والكثير عدد من الكواشف التي تربط قبلز في الصك.
- بعد الاختيار النهائي للمجموعة الأنابيب، وفتح المشبك من كيس الببتيد كوكتيل. فتح الحقيبة المتوسطة والشروع فتيلة التلقائي للمجموعة الأنابيب.
- بعد الانتهاء من الخطوة فتيلة، تكملة HSA (2.5٪) إلى كلوريد الصوديوم عازلة في حقيبة الخزان (200 مل) مع مساعدة من أنابيب لحام العقيمة. نقل المنتج الخلوي بدءا في "حقيبة تطبيق" باستخدام أنابيب لحام العقيمة.
- ربط CCS (IFNγ) الكواشف في أنابيب منها عن طريق المحولات. دخول الوقت المفضل لجمع جزء من المواد الخلوية قبل عملية التخصيب. مراجعة والتحقق من صحة جميع البيانات / دخلت المعلمات. بدء العملية.
- قبل بدء عملية تخصيب الخلية الآلي، وإزالة كيس مراقبة الجودة (مصرف قطر المركزي، جزء الأصلي (أوري) يحتوي على حوالي 1.3 مل من أصل 100 المحتوى مل غرفة المخفف مع PBS عازلة / EDTA). ختم مصرف قطر المركزي، وزن، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- بدء enrichmeعملية الإقليم الشمالي. في نهاية هذه العملية، سيتم مزال الخلايا المستهدفة مع حجم تقريبي من شطف العازلة من الكيس الخزان.
- ختم غير المستهدفة خلية حقيبة (NTCB، جزء سلبي = NEG) وحقيبة الخلية المستهدفة (ادارة التعاون الفني، سواء كان إيجابيا جزء = نقاط البيع) وتزن كل كيس. سيتم استخدام الأوزان في وقت لاحق لحساب أعداد الخلايا.
- مباشرة بعد إجراء تخصيب جمع اثنين قسامات في جزء لتحليل التدفق الخلوي، وتخزين بقية العينات عند 4 درجات مئوية. استخدام أحد قسامة عينة لتحديد عدد الخلايا وغيرها من قسامة عينة لتحليل أداء تخصيب (الجدول 1).
- إزالة أنابيب مجموعة من الصك تخصيب الخلية. نقل ملف السجل إلى محرك أقراص USB لاستخدامها في المستقبل.
ملاحظة: يجب أن تكون على استعداد جميع الكواشف تحت ظروف معقمة. ينصح بشدة استخدام السلامة الأحيائية نوع II غطاء محرك السيارة. استخدام الحالة المستقرة فصادة المنتجات الخلوية (غير المعبأة) معزولة عن صحيةCMV-مصليا المانحة لإثراء خلايا T معينة CMV المستضد. فقط مرخص FDA HSA ينبغي استخدامها. يجب أن تبقى المخزن المؤقت لإعداد الخلية في +19 درجة مئوية إلى +25 درجة مئوية عن انخفاض أو ارتفاع درجات الحرارة المحيطة سيؤدي إلى خفض النقاء والعائد المخفض للخلايا المستهدفة.
3. خلية عدد تقرير
- اتخاذ aliquots من مصرف قطر المركزي، NTCB وادارة التعاون الفني لعدد الخلايا كما هو مبين في الجدول 1. إضافة CD45-VoBlue لكل قسامة (عيار 01:11)، واحتضان في الظلام لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إضافة 1.5 مل الطازجة حل الخلية تحلل الدم الحمراء (1X) إلى جزء الأصلي وجزء سلبي، 450 ميكرولتر الطازجة الدم الحمراء حل تحلل الخلية إلى جزء إيجابي، واحتضان جميع الكسور لمدة 15 دقيقة في RT.
- فقط قبل التحليل، إضافة يوديد propidium إلى تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل (1: 100 التخفيف من 100 ميكروغرام / مل). استخدام العداد الخلية التلقائي لتحديد عدد الخلايا والسادسالقدرة. استخدام خلية جهاز مكافحة البرامج الموصى بها لتحليل التدفق الخلوي. تحديد التهم المطلقة من الكريات البيض لكسور الأصلية، السلبية والإيجابية.
ملاحظة: يتم تحديد عدد خلايا الكريات البيض قادرة على البقاء في مل من العينات المأخوذة للتحليل عدد خلايا باستخدام محلل خلية البرامج الموصى بها. - تعيين المنطقة كما هو مبين في الشكل 2 (المنطقة 5، الكريات البيض قادرة على البقاء). استخدام استراتيجية النابضة التالية لتحديد عدد الخلايا. ويرد الكريات البيض قادرة على البقاء في جزء الأصلي في الشكل 2.
- المناطق المشار إليها (الشكل 2، 1-6) هي هرميا على النحو التالي:
1: دوام بوابة → 2: خلايا مفردة → 3: CD45 + الخلايا → 4: الكريات البيضاء (الحطام مستبعد) → 5: الكريات البيضاء قابلة للحياة → 6: الخلايا الليمفاوية قابلة للحياة - تكرار نفس الخطوات لتحديد عدد الخلايا لكسور السلبية والإيجابية. حساب عدد خلايا الكسر كلهمن خلال النظر في عامل مخفف من العينة والحجم الكلي للجزء (الجدول 2).
4. فحص الأداء الفصل
- غسل aliquots من مصرف قطر المركزي، NTCB وخلايا جزء ادارة التعاون الفني مع برود قبل PBS / EDTA العازلة / 0.5٪ AB المصل. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونضح طاف.
- Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر الضد تألقي خليط تلطيخ تحتوي CD3-FITC، CD4-APC، CD8-APC-Vio770، CD14-PerCP، CD20-PerCP، CD45-VioBlue ومكافحة IFNγ-PE (عيار 01:11) و احتضان في الظلام لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- إضافة 1 مل الطازجة حل الخلية تحلل الدم الحمراء (1X)، واحتضان لمدة 15 دقيقة في RT. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونضح طاف. resuspend الخلايا في حجم كاف من PBS / EDTA العازلة / 0.5٪ AB المصل.
- إضافة يوديد propidium إلى تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل فقط قبل التحليل (1: 100 dilutiعلى 100 ميكروغرام / مل). أداء التدفق الخلوي تحليل لتقييم نقاء العينة.
- استخدام استراتيجية النابضة التالية لحساب الخلايا CD3 + T في استراتيجية قابلة للحياة المحاصرة الكريات البيض لتحديد الخلايا CD3 + T يظهر في جزء إيجابية بعد عملية تخصيب CCS. المناطق المشار إليها (الشكل 3A و 3B، 1-6) ترتبط بشكل هرمي على النحو التالي:
1: دوام بوابة → 2: خلايا مفردة → 3: CD45 + الخلايا → 4: خلايا (الحطام مستبعد) → 5: الكريات البيضاء قابلة للحياة → 6: قابلة للحياة CD3 + الخلايا السكان - تحديد ترددات CD4 +، CD8 +، CD4 + IFN-γ + CD8 + وIFN-γ + خلايا T بعد عملية تخصيب CCS (الجدول 2).
- استخدام استراتيجية النابضة لتحديد ترددات CD4 +، CD8 +، CD4 + IFN-γ + CD8 + وIFN-γ + خلايا T و هو مبين أدناهأو (القبض) جزء إيجابي الأصلي والمخصب بعد عملية CCS. ترتبط هيكليا المناطق المشار إليها واسمه على النحو التالي:
1: دوام بوابة → 2: خلايا مفردة → 3: CD45 + الخلايا → 4: خلايا (الحطام مستبعد) → 5: الكريات البيضاء قابلة للحياة → 6: قابلة للحياة CD3 + الخلايا → 7: CD4 + الخلايا → 7A: CD4 + IFN-γ + الخلايا (مربع) → 8: CD8 + خلايا → 8A: CD8 + IFN-γ + الخلايا (مربع)
وتظهر أول 6 المناطق المشار إليها من الروابط التسلسل الهرمي هي نفس الشكل (3)، (1-6) وأخيرا 2 المناطق في الشكل 4 (6-8a): ملاحظة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه الدراسة، تم استخدام خلية الآلي التخصيب نظام CCS لإنتاج الآلي من CMV خلايا T pp65 محددة. تم تخصيب خلايا T CMV محددة من ثلاثة منتجات خلية فصل مكونات الدم. كان حصادها المنتج فصادة الحالة المستقرة أكثر من 2 ساعة من المانحين CMV مصليا ولدت 10 10 مجموع الخلايا النووية (TNC). 10 9 TNC ثم تم تفعيلها مع CMV الببتيدات المستمدة من pp65 (60 نانومول) لمدة 4 ساعة وIFN-γ إفراز تم عزل خلايا T باستخدام CCS على الجهاز تخصيب الخلية الآلي. هناك حاجة إلى المشغل في بداية التجربة لتحميل جميع الكواشف ومجموعات الأنابيب. استغرق الإعداد للنظام من الأولي تفريغ لتشغيل الجهاز حوالي 60 إلى 120 دقيقة. ملاحظة، ويمكن بعد ذلك آلة برمجتها ليبدأ بعدها يتم تحميل الكواشف ومجموعات الأنابيب وبالتالي تمكين الجهاز لتشغيل غير المراقب (مثل بين عشية وضحاها). كانت هناك حاجة للمشغل مرة أخرى بعد 15 ساعة لإجراء توصيفالمنتجات النهائية للنقاء الخلايا وقدرتها على البقاء. بعد تخصيب تم عرض طاف خلية لالميكوبلازما وجود الذيفان الداخلي. بعد التحقق من صحة، والخلايا المصنعة يمكن غرست مباشرة إلى المرضى أو cryopreserved للتطبيقات في وقت لاحق.
تم تحديد عدد الخلايا الخلية التالية عد الممارسات القياسية باستخدام الصيغ الواردة في الجدول 2. وتكررت كل نوع من خلايا ثلاث مرات، وأعرب عن نتائج المتوسط حيث بلغ إجمالي عدد خلايا بانحراف معياري (SD). ثم تم تحليل التقارير باستخدام محلل خلية البرامج الموصى بها. ويرد النابضة لتحديد الكريات البيض قادرة على البقاء والخلايا الليمفاوية في الشكل 2. وتعرض البيانات لعدد الخلايا في الجدول 3. استراتيجية النابضة المستخدمة لتحديد IFN-γ + T الخلايا هو مبين في الشكل (3) والشكل (4). وقبل التخصيب، و وكانت قابلية الخلايا بشكل روتيني> 95٪. بعد enrichmenكانت ر بقاء الخلايا <50٪. تم تقييم عدد المطلق للIFN-γ + خلايا T قبل وبعد عملية تخصيب اليورانيوم. وكان العدد الإجمالي للIFN-γ + T الخلايا قبل تخصيب 1.14 × 10 6 ± 0.35 × 10 6 على النحو المستمد من 10 9 ابتداء من المجلس الوطني الانتقالي، وبعد التخصيب كان 3.09 × 10 5 ± 1.70 × 10 5 IFN-γ + T الخلايا. كان هناك 0.16 ± 0.18٪ IFN-γ + خلايا CD4 + T الحالية قبل تجهيزها وارتفع هذا الرقم إلى 47.5 ± 34.7٪ بعد التخصيب. كانت نسبة نقاء CD8 + IFN-γ + خلايا T قبل القبض 0.47 ± 0.1٪، وارتفعت إلى 90.3 ± 1.7٪ بعد التخصيب (الجدول 3 و 4). كان الانتعاش العينة في القبض على (إيجابية) جزء 32.9 ± 15.7٪ لخلايا CD4 + T و31.8 ± 13.2٪ للخلايا CD8 + T على أساس قياس IFN-γ + T الخلايا في ستا rting السكان (جدول 4). وتشير هذه البيانات إلى أن كلا CD4 + CD8 + وCMV خلايا T pp65 محددة يمكن حصاده آليا بطريقة مناسبة للتطبيق البشري.
الشكل 1. إثراء خلايا T CMV محددة باستخدام نظام CCS. (A) خطوات المعالجة متعددة تشارك في الجهاز تخصيب خلايا الجيل الأول يتم معالجتها من قبل المهنيين المهرة. (B) أكثر من خطوات المعالجة، إلا الإعداد أنابيب الأولي، هي الآلية في الجهاز تخصيب الخلية الجيل الثاني مما يوفر 10-12 ساعة من الوقت لمعالجة المشغل في مقارنة مع جهاز الجيل الأول. وتتميز الخلايا T CMV من الفيروسات محددة أثرى والتدفق الخلوي محلل الخلية. > الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. المحاصرة الاستراتيجية المستخدمة لتحديد خلايا T قابلة للحياة. والأرقام من 1 إلى 6 وتشير المقابل المجال التسلسل الهرمي النابضة في الشكل (1) إعداد بوابة الزمن، (2) إزالة الخلايا صدرة من قبل بالتآمر FSC الطول ضد FSC منطقة (3) تحديد خلايا CD45 +، (4) إزالة الحطام الخلية (5) اختيار الكريات البيض قادرة على البقاء و(6) الليمفاوية قابلة للحياة من السكان الأصلي يوديد propidium تلطيخ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تحميل / 52808 / 52808fig3.jpg "/>
الشكل 3. استراتيجية المحاصرة المستخدمة لتحديد الخلايا CD3 + T. التدفق الخلوي تحجب تحليل خلايا CD3 + T قبل (3A) وبعد أظهرت تخصيب (3B) خلية هنا. ومن الأهمية بمكان لتحديد عدد الببتيد تنشيط خلايا T CMV محددة موجودة في العينات قبل وبعد عملية تخصيب اليورانيوم. في هذا الشكل، وأرقام من 1 إلى 6 تشير إلى سكان الخلية المقابلة إما عن طريق حجم أو الملون من الأجسام المضادة المحددة. (1) إعداد الوقت بوابة، (2) إزالة الخلايا صدرة، (3) اختيار CD45 + الخلايا، (4) إزالة الحطام الخلية (5) اختيار الكريات البيض قادرة على البقاء و(6) CD3 + قابلة للحياة الخلايا الليمفاوية. تم تنفيذ يوديد propidium تلطيخ لإزالة الخلايا الميتة./52808fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. المحاصرة الاستراتيجية المستخدمة لتحديد نقاء IFN-γ + خلايا T. خلايا T CMV محددة المنشط حاسمة للسيطرة على العدوى CMV، لذلك IFN-γ + واستخدمت التعبير على خلايا T للالنابضة. IFN-γ + خلايا T بين CD4 + CD8 + ومجموعات فرعية (A) قبل التخصيب و(B) بعد التخصيب. (08/07) ويرد النسبة المئوية للخلايا CD4 + T والخلايا CD8 + T في A و B. (7A ) يظهر نسبة CD4 + IFN-γ + T الخلايا في مربع مربع (أ) داخل المنطقة المعزولة وبالمثل C D8 + IFN-γ + خلايا T في (8A). "T" يمثل٪ من الخلايا في عدد السكان و"#" يمثل٪ من الخلايا في السكان بوابات. تم إجراء يوديد propidium تلطيخ للخلايا الميتة بوابة الخروج. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1. أحجام التداول من الكسور تستخدم لاستراتيجية تلطيخ الخلية.
يتم تنفيذ الجدول 2. الصيغ المستخدمة لحساب CD4 + IFN-γ + خلايا T بعد عملية التخصيب. CD8 + حساب IFN-γ + خلايا T بالمثل.
الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الجدول.
الجدول 3. مجموع عدد الخلايا في مجموعات فرعية T-الخلية قبل وبعد التخصيب. نموذج # يتم عرض النتائج 1 هنا.
الجدول 4. الطهارة واسترداد IFN-γ + T الخلية قبل وبعد عملية التخصيب في عينة # 1.
الجدول 5. خلية الفرز الاستراتيجيات المستخدمة في عزل خلايا T معينة السريرية الصف CMV مستضد. 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد برز العلاج T-خلية بالتبني كخيار قابل للتطبيق لعلاج الأورام الخبيثة B-الخلية 4. إمكانات علاجية تعتمد على غرس العدد المطلوب من الخلايا T محددة المستضد الهدف التي تفتقر تنسخي الشيخوخة 2. ويمكن تحقيق ذلك من خلال الفصل بين السكان نقية من خلايا T معينة مستضد من خلايا T الموسعة في الامتثال لممارسات التصنيع الجيدة الحالية. وتستخدم إجراءين الفرز على نطاق واسع، وهي الخلية مضان تنشيط الفرز (FACS) والمغناطيسية خلية تنشيط الفرز (MACS) لتوليد خلايا T معينة CMV المستضد كما استعرضنا في الآونة الأخيرة 5. ويرد وميزة استخدام استراتيجية واحدة على الآخر في الجدول 5، وتقدم التكنولوجيا MACS أعلى نقاء تخصيب خلية في طريقة أرخص وأسرع مقارنة مع التكنولوجيا FACS. في الاستخدام بالإضافة إلى الأعمدة والكواشف المتاح لتخصيب الخلية يمنع تماما عينة لتلوث العينة مما يجعلهاأسهل للتطبيق في المرافق الصحية. الجهاز تخصيب خلايا الآلي شبه غير كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا حتى تطوير الجهاز تخصيب الخلية الآلي هو ضروري لتلبية الطلب السريري.
الجهاز خلية CCS تخصيب الآلي هو أداة مرنة لعزل خلايا الصف السريرية مثل الخلايا المكونة للدم الجذعية، الخلايا الجذعية الجسدية، وكذلك خلايا T لنقل بالتبني. هذا الجهاز الآلي يدمج معالجة الخلايا، بما في ذلك تجزئة للمواد الاساسية، غسل الخلية، وفصل الخلايا، زراعة الخلايا، وتشكيل المنتج النهائي في استخدام واحد-GMP المتوافقة مع وحدة التخلص منها. نظام مغلق يقلل من متطلبات غرفة نظيفة ويقلل من تورط المشغل للحفاظ على مرافق GMP. أتمتة يقلل من الوقت اللازم للعامل أن يكون حاضرا مما يقلل من التكاليف المرتبطة بهذه الإجراءات المختبرية.
للتحقق من صحة الجهاز تخصيب الخلية الآلي، مقارنةمع الجهاز تخصيب خلايا الآلي نصف، ونحن عزل خلايا T CMV محددة بعد احتضان الببتيدات المستمدة pp65-CMV مع منتج فصل مكونات الدم. GMP الصف CMV المستمدة من pp65 الببتيد كوكتيل (على سبيل المثال PepTivator) هو تجمع الببتيد التي تتكون أساسا من 15 مير-الببتيدات مع 11 الأحماض الأمينية التداخل، الذي يغطي التسلسل الكامل للبروتين pp65 من الفيروس المضخم للخلايا الإنسان. كان عينة استرداد العائد ~ 0.3 × 10 6 CD3 + IFN-γ + T خلايا من 10 9 TNC. وقد أثبتت الدراسات السريرية أن غرس بضعة آلاف من CMV محددة خلايا T كعلاج وقائي للمرضى (~ 360 إلى 4000 خلية / كجم من وزن الجسم) تمر HSCT أدى إلى حماية ضد CMV. على سبيل المثال، من أجل علاج CMV في التجارب السريرية باستخدام هذه التكنولوجيا، 70 كجم الكبار و30 كجم الطفل على ما يبدو لا تتطلب سوى ،26-3،0 × 10 5 و 1 × 10 4-1،2 × 10 5 خلايا، على التوالي، من viral- خلايا معينة T 12-15 وآخرون. 13. ومن شأن ارتفاع عدد خلايا قابلة للحياة أيضا أن تكون مقبولة وهذا من شأنه أن تترافق مع ما يكفي من المواد للدفعات مختلفة. ومع ذلك، المزيد من الخلايا قابلة للحياة بشكل عام يعني أيضا المزيد من الخلايا الأخرى من خلايا T (B، NK، الخ). بياناتنا تظهر أن خلايا T CMV محددة إنشاؤها على نظام تخصيب الخلية الآلي أسفرت عن أعداد سريريا جاذبية من خلايا T CMV الخاصة التي يمكن بعد ذلك غرست بعد خيفي HSCT.
عدوى الفيروس المضخم للخلايا يمكن أن يكون مشكلة كبيرة بعد مما أدى HSCT في كل من زيادة معدلات الاعتلال والوفيات. وعلاوة على ذلك، يرتبط العدوى CMV مع زيادة التكاليف، على الرغم من التقدم الذي أحرز مؤخرا في التشخيص المبكر والعلاج المبكر بالأدوية المضادة للفيروسات 16. العلاج الحالية باستخدام ganciclovir وfoscarnet يمكن أن يؤدي إلى تسمم في المتلقين طبيا هشا من HSCT.وقد أظهرت الظهير إضافة خلايا T CMV الخاصة المستمدة من المانحين لمنع وعلاج العدوى الانتهازية في المستفيدين من خيفي HSCT 9. كما تم تطبيق هذا النهج في العلاج المناعي بالتبني للمساعدة في استعادة الحصانة لمسببات الأمراض الأخرى، مثل فيروس ابشتاين بار (EBV)، اتش 8، والرشاشيات 3 التي يحتضنها الخلايا وحيدة النواة (MNC) مع مستضد منها المستمدة الصف السريرية الكواشف الببتيد كوكتيل ( المواد والمعدات في الجدول). وفي الآونة الأخيرة، محققين غرست بأمان طرف ثالث خلايا T الممرض الخاصة التي تتناسب مع واحد على الأقل أليل HLA في المتلقي تقديم الببتيد سائد مناعيا 17. ويمكن أيضا أن نظام CCS تخصيب الخلية الآلي استخدامها لتوليد طرف ثالث خلايا T للتطبيقات الجاهزة التي من شأنها أن تكون مفيدة عند المانح هو CMV-سلبيين أو غير متوفرة، مثل الحال مع الجهات المانحة لخيفي الحبل السري transplantati الدمعلى.
باختصار، نحن لشرح فائدة عبوة تخصيب الخلية الآلي لتوليد خلايا T CMV محددة بناء على أتمتة CCS. ونعتقد أن هذا الجهاز لديه القدرة على خفض عتبة لفرق السريرية للبث الممرض محددة، وكذلك ورم محددة، وخلايا T في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
كل من مركز أندرسون للسرطان، والدكتور كوبر لديهم مصلحة مالية في ZIOPHARM الأورام، وشركة، وشركة Intrexon. في 7 مايو 2015، تم تعيين الدكتور كوبر في منصب الرئيس التنفيذي في ZIOPHARM الأورام. الدكتور كوبر وهو الآن عالم زائر في MD أندرسون. الدكتور كوبر أسس وتمتلك InCellerate، وشركة لديه براءات الاختراع مع Sangamo العلوم البيولوجية مع nucleases الاصطناعية. وقال انه يتشاور مع Targazyme، وشركة (الخلايا الجذعية الأمريكية سابقا، وشركة)، جنرال إلكتريك للرعاية الصحية، فيرينغ Ferring الصيدلة، مصير التداوي، يانسن الصيدلة، وبريستول مايرز سكويب. وهو عضو في المجلس الاستشاري العلمي لCellectis. وقال انه يتلقى الأتعاب من ميلتيني بيوتيك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 ml Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/ml) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
- Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
- Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
- Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
- Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), Available from: http://www.cambridgeresearchcentre.co.uk/all-publications/blood-and-marrow-transplantation/ 55-59 (2014).
- Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
- Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
- Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
- Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
- Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
- Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
- Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
- Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
- Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
- Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).
