Abstract
Patogene-özgü T hücrelerinin adoptif transfer önlenmesi ve allogeneik kök hücre transplantasyonundan sonra ortaya çıkan gibi enfeksiyon (CMV), sitomegalovirüs gibi fırsatçı enfeksiyonları tedavi etmek için de kullanılabilir. Üçüncü şahıs bağışçı olmak üzere allojenik vericilerden, viral-spesifik T hücreleri, seçici istenen T hücrelerini yaymak için antijen-odaklı uyarım tekrarlanan mermi kullanan mevcut iyi üretim uygulamaları (cGMP) uygun olarak ex vivo olarak yayılan olabilir. Antijen-spesifik T hücrelerinin tanımlanması ve izolasyonu da gama-interferon (IFN-γ) salgılamaya aktive edilmiş T hücrelerinin sitokin yakalama sistemine dayalı yapılabilir. Üretim süreci zaman alıcı ve yetenekli bir operatör gerektirir Ancak, bağışıklık geri yardımcı olmak için sitokin yakalama sistemi (CCS) yaygın insan uygulaması sınırlı kalmıştır. Şimdi bu CliniMACS Prodigy gibi ikinci nesil hücresi zenginleştirme cihazının geliştirilmesiotomatik bir, daha az emek yoğun bir sistem kullanılarak viral özgü T hücrelerinin üretilmesi için araştırmacılar sağlar. Bu cihaz, manyetik klinik sınıf ürünler üretmek için bir manyetik etkinleştirilmiş hücre tasnif teknolojisi kullanılarak etiketlenmemiş hücrelerden hücreler etiketli ayırır, kapalı bir sistem olarak tasarlanmıştır ve masa üstü erişilebilen ve çalıştırılabilir. Bu yeni otomatik hücresi zenginleştirme Cihazın çalışması, bir CMV seropozitif vericiden elde edilen bir kalıcı-hal aferez ürününden elde edilen CMV pp65-spesifik T hücreleri üretmek için göstermektedir. Bu izole edilmiş T hücreleri, daha sonra doğrudan, kurumsal ve federal düzenleme denetimi altında bir hastaya infüze edilebilir. Kırmızı kan hücrelerinin ortadan kaldırılması dahil olmak üzere tüm biyo-işlem aşamaları, T hücreleri, antijen-spesifik T hücrelerin, saflaştırma ve yıkama ayrılmasının uyarılması tam olarak otomatikleştirilmiştir. Bu gibi cihazlar, insan uygulaması için T hücreleri GMP (özel iyi üretim uygulamaları dışında imal edilebilmesi olasılığı ortaya) Yerine tesisleri ve personel birden ürünler üretmek için otomatik protokolleri denetleyebilir kan bankacılığı tesislerinde üretilecek.
Introduction
Hematopoietik kök hücre nakli (HSCT) 1, graft-versus-tümör etkisini arttırmak ve fırsatçı enfeksiyonlara 2 bağışıklığı sağlamak için adoptif T-hücre terapisi ile kombine edilebilir. Infüzyon için antijene spesifik donör kaynaklı T hücrelerinin üretilmesi tarihsel kalifiye personel ve GMP uyumlu olan uzman tesislerin kullanılmasını gerektirmiştir. Bu T hücrelerinin dağıtım fırsatçı enfeksiyon 3 çözünürlüğü hem de altta uzanan malignite 4 tedavi ile sonuçlanmıştır. Yakın geçmişte, araştırmacılar göstermiştir ki bin az sayıda virüs spesifik T hücrelerinin adoptif transfer (~ 1 x 10 4-2,5 x 10 5 hücre / kg alıcı vücut ağırlığı) başarılı bir şekilde HKHN 5-9 sonra fırsatçı CMV enfeksiyonları tedavi olabilir. Ilişkili vasıflı imalat şartlarına GMP tesislerinin sınırlı sayıda ve hücre üretimi ile ilişkili yüksek maliyetli, ancak, restr vardırT-hücre tedavileri 10 vaat için icted hasta erişim. Antijen-spesifik T hücrelerinin izole edilmesi için bir yaklaşım, CD45 ve IFN-y tanımak için bir çift spesifik bir reaktif kullanılarak CCS dayanmaktadır. Gösterildiği gibi, bu yöntem, bir otomatik hücre ilave CCS cihazı (Şekil 1B) kullanılarak klinik düzeyde CMV-spesifik T hücreleri üretmek için kullanılabilir.
CMV-spesifik T hücreleri, CMV-seropozitif donörlerden lökaferez, toplam nükleer hücreler (TNC) CMV pp65 antijeninden örtüşen peptidlerin inkübe edilerek oluşturulur. İnsan lökosit antijen (HLA) bağlamında gösterildi Bu peptidler, IFN-y salgılaması için TNC olan CMV pp65-spesifik T hücrelerini aktive etmektedir. Bu T hücreleri daha sonra "esir" olmak ve manyetik ayrılmış olabilir. Birinci nesil cep zenginleştirme cihazının çalışması (Şekil 1A) birden s üstlenmek GMP koşulları altında hücre kültüründe yetişmiş personel gerekli ve personelin koordinasyonuBir "esir" ürünü üretmek için gerekli Teps.
Prosedür genellikle sürekli çalışma 12 saat için 10 gerekli ve bu nedenle personelin büyük olasılıkla GMP tesisi iki vardiya üzerinden çalışmak gerekiyor. Bu kısıtlamalar, artık (Şekil 1B de gösterilen), bir ikinci kuşak cihazının uygulanması ile ortadan kaldırılır. Bu cihaz, ilk nesil cihaza benzer manyetik zenginleştirme, taahhüt, ancak bir unbreached bir yaklaşımla CCS'nin diğer yönlerini otomatik hale getirir. Bu önemli ölçüde adımların en personeli tarafından sahipsiz yapılabilir olarak GMP ekibi üzerindeki yükü azaltır. Cihaz, bir kapalı bir sistem olarak işlev Dahası, antijen-spesifik T hücrelerinin yakalanır ve cihazı başlamadan önce lökaferez izolasyonu ve materyallerin hazırlanmasında yer alan adımları dışında masa üstü işlenebilir. Tam enstrümantasyon ve bu ikinci nesil cep zenginleştirme cihazın işlevselliği Detayları pub edilmiştir11 yayımlanır.
Burada, biz otomatik hücre zenginleştirme CCS sistemini kullanarak bir kararlı durum aferez üründen CMV pp65-spesifik T hücrelerini zenginleştirmek için gereken adımları açıklar. Bir kez izole edildiğinde, bu, CMV-spesifik T hücreleri, hemen bir hastaya infüzyon yoluyla olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Steril Koşullarında Malzemelerin hazırlanması 1. (Malzemeleri ve Ekipmanları Tablo bakınız)
- % 0.5 bir son konsantrasyona kadar insan serum albümini (HSA) ile desteklenmiş PBS / EDTA tampon maddesi 3 L hazırlanması (a / h).
- Klinik sınıf% 0.9 sodyum klorid (NaCl) çözeltisi 1 L'lik bir çanta GMP sınıfı hücre kültür ortamının 2 L hazırlayın.
- Steril su, 8 ml CMV pp65 bir vial sulandırılması CMV-spesifik peptid antijeni kokteyli 60 nmol hazırlayın.
- Bir Luer / Spike interconnector kullanılarak 50 ml hacim dondurucu torbaya CMV pp65 peptid kokteyl aktarın ve boru setinin içine kokteyl sonraki dağılımını önlemek için forseps kilitleme kelepçe. Steril koşullar altında Açık hücreli zenginleştirme boru seti (TS 500).
- Steril boru kaynakçı kullanarak, şu anda peptit kokteyl çantası kelepçesini açmayın boru setinin vananın 2 TS 500 için tüp bağlantısı içine peptid kokteyl donma çanta bağlayın.
- Kaldır 1 x 10 9 TBaşlangıç hücre üründen NC ve 50 ml 'lik bir toplam hacme% 2.5 HSA ihtiva eden PBS / EDTA tampon maddesi içinde askıya. 150 ml'lik bir aktarma torbaya hücresel ürünü enjekte edilir.
2. Hazırlık ve Kullanım otomasyon Hücre Zenginleştirme Sistemi (Malzemeleri ve Ekipmanları Tablo bakınız)
- Hücre zenginleştirme sistemi (Şekil 1B) açın ve programı "CCS_IFN-γ Zenginleştirme" seçeneğini seçin. Prosedür yoluyla operatöre rehberlik talimatlar ve resimlerle ekranları gösteren bir kullanıcı arayüzü gözlemleyin.
- Parametresi "Operatör" ve "Boru Seti P / N Hayır" girin. Sonraki interaktif monitör ekranında görüntülenen talimatlara göre Boru Seti 500 otomatik hücre zenginleştirme cihazı takın.
- Cihaza orta ve tamponlar bağlamak için ekranda görüntülenen yönergeleri adım adım izleyin. Kayıt katalog numarası ve connectin önce reaktiflerin lot numarasıCihaza örn.
- Boru setinin son kontrolünden sonra, peptid kokteyl çanta kelepçeyi açın. Orta çantayı açın ve boru setinin otomatik hazırlanmasını başlatmak.
- Priming adımı tamamlandıktan sonra, steril boru kaynakçı yardımıyla rezervuar torba (200 mi) içinde NaCI tampon içine HSA (% 2.5) tamamlar. Steril boru kaynak makinası kullanarak "Uygulama bag" içine başlayan hücresel ürünü aktarın.
- Adaptörleri aracılığı ile ilgili boru içine CCS (IFNy) reaktifler bağlayın. Zenginleştirme işlemi öncesinde selüler malzemenin bir kısmını toplamak için tercih edilen bir zaman girin. İnceleme ve tüm verilerin doğruluğunu / parametreler girilir. Işlemini başlatın.
- Otomatik hücre zenginleştirme işlemi başlamadan önce, kalite kontrol yastığı (QCB orijinal fraksiyon (ori) PBS / EDTA tampon maddesi ile seyreltildi, 100 mi odacık içeriği üzerinden yaklaşık 1.3 ml içeren) çıkarın. , QCB Seal tartmak ve 4 ° C'de saklayın.
- Enrichme başlatnt süreci. İşlemin sonunda, hedef hücreler, rezervuar torba gelen seçme tampon çözeltisi yaklaşık bir hacmi ile elüt edilecektir.
- Olmayan Hedef Hücre Bag (NTCB, negatif fraksiyon = negatif) ve Hedef Hücre Çanta (TCB, pozitif kesir = pos) Mühür ve her torbayı tartın. Ağırlıklar daha sonra hücre sayıları hesaplanması için kullanılacaktır.
- Hemen zenginleştirme işleminden sonra akış sitometresi analizi için fraksiyondan başına iki alikotları toplamak ve 4 ° C'de numunelerin kalan saklayın. Hücre sayısı tayin zenginleştirme performans analizi (Tablo 1) Diğer numune kısım için bir numune kısım kullanın.
- Hücresi zenginleştirme aletten boru setinin çıkarın. Ileride kullanmak üzere bir USB sürücüsüne günlük dosyasını aktarın.
Not: Tüm reaktifler, steril koşullar altında hazırlanmalıdır. Biyogüvenlik tip II kaput kullanılması tavsiye edilir. Sağlıklı izole kararlı durum aferezi hücresel ürün (non-mobilize) kullanarakCMV seropozitif verici CMV antijen spesifik T hücrelerini zenginleştirmek. Sadece FDA HSA kullanılmalıdır lisanslı. Hücre hazırlama tamponu indirgenmiş saflık ve bir hedef hücre, indirgenmiş verimle sonuçlanır düşük veya daha yüksek çevre sıcaklıklarında olarak 25 ° C'ye kadar 19 ° C 'de tutulması gerekmektedir.
3. Hücre Sayısı Tayini
- Tablo 1 'de gösterildiği gibi. Hücre sayımları için QCB, NTCB ve TCB hacimde al, 4 ° C'de 10 dakika süreyle karanlıkta her kısım (titre 01:11) CD45-VoBlue ekleyin ve inkübe edilir.
- Orijinal fraksiyonu ve negatif fraksiyon pozitif fraksiyona 450 ul taze hazırlanmış kırmızı kan hücre parçalama çözeltisi 1,5 ml taze hazırlanmış kırmızı kan hücresi lizis çözeltisi (1x) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika seyahati kesirler inkübe edin.
- (100 ug / ml, 100 seyreltme 1) hemen önce analiz için 1 ug / ml nihai konsantrasyona kadar propidyum iyodür ilave edin. Hücre sayımı ve vi belirlemek için otomatik hücre sayacı kullanınyeteneği. Flow sitometri analizi için hücre karşı cihaz tavsiye yazılımını kullanın. Orijinal negatif ve pozitif fraksiyonları lökositlerin mutlak sayılarını belirlemek.
Not: Hücre sayısı analizi için alınan örnekler ml'si başına canlı hücre sayısı lökositlerin hücre analizörü tarafından önerilen yazılım kullanılarak belirlenir. - Şekil 2 (bölge 5, uygun bir lökositler) 'de gösterildiği gibi bölge ayarlayın. Hücre sayısını belirlemek için aşağıdaki yolluk strateji kullanın. Orijinal fraksiyonunda bir canlı lökosit Şekil 2 'de gösterilmiştir.
- Aşağıda belirtilen bölgeler (Şekil 2, 1-6) hiyerarşik olarak şunlardır:
1: Zaman kapısı → 2: Tek hücre → 3: CD45 + hücreler → 4: lökositler (enkaz hariç) 5 →: geçerli lökositlerin → 6: geçerli lenfositler - Negatif ve pozitif kesirler hücre sayılarını belirlemek için aynı adımları tekrarlayın. Bütün fraksiyonun hücre sayısını hesaplayınörnek ve fraksiyon (Tablo 2) toplam hacmine seyreltici faktörü dikkate alınarak.
Ayırma Performansının 4. Ara Sınavı
- Önceden soğutulmuş PBS / EDTA tampon /% 0.5 AB serumu ile QCB, NTCB ve TCB fraksiyon hücrelerin alikotları yıkayın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ve hücreler süpernatan aspire.
- Içeren 100 ul antikor florokrom boyama karışımı içinde süspanse edin hücreleri: CD3-FITC CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue ve anti-IFNy-PE (titresi 01:11) ve 4 ° C'de 10 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir.
- 1 ml taze hazırlanmış kırmızı kan hücresi lizis çözeltisi (1x) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edilir. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ve süpernatan aspire. PBS / EDTA tampon /% 0.5 AB serumu yeterli bir hacimde tekrar süspansiyon hücreleri.
- 100 diluti: 1 ug / ml hemen önce analiz (1 bir son konsantrasyona propidiyum iyot ekleme) 100 ug / ml üzerine. Numunenin saflığı değerlendirmek için flow sitometri analizi gerçekleştirir.
- CCS zenginleştirme işleminden sonra pozitif fraksiyonun gösterilmiştir CD3 + T hücreleri belirlemek için uygun bir lökosit Yolluk stratejisinde CD3 + T hücreleri hesaplamak için aşağıdaki yolluk strateji kullanın. Aşağıda belirtilen bölgeler (Şekil 3A ve 3B, 1-6) hiyerarşik olarak bağlıdır:
1: Zaman kapısı → 2: Tek hücre → 3: CD45 + hücreler → 4: Hücreler (enkaz hariç) 5 →: geçerli lökositler → 6: geçerli CD3 + hücre popülasyonu - CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-y + ve CD8 + IFN-y + CCS zenginleştirme işleminden sonra, T hücreleri (Tablo 2) frekanslarını belirlemek.
- F aşağıda CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-y + ve CD8 + IFN-y + T hücrelerinin frekansları belirlemek için yolluk strateji kullanarakveya CCS sürecinden sonra orijinal ve zenginleştirilmiş (esir) pozitif kesir. Aşağıdaki gibi gösterilen bölgeler hiyerarşik bağlantılı ve adlandırılır:
1: Zaman kapısı → 2: Tek hücre → 3: CD45 + hücreler → 4: Hücreler (enkaz hariç) 5 →: geçerli Lökosit → 6: geçerli CD3 + hücreleri → 7: CD4 + hücreleri → 7a: CD4 + IFN-γ + Hücreler (kutu) → 8: CD8 + hücreleri → 8a: CD8 + IFN-γ + hücreleri (kutu)
NOT: hiyerarşi birinci bağlantı 6 belirtilen bölgeler, (1-6), burada Şekil 3 ile aynıdır ve 2 bölgeler geçen Şekil 4 (6-8a) 'de gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, bir otomatik hücre ilave CCS Sistemi CMV pp65-spesifik T hücrelerinin otomatik üretimi için kullanılmıştır. CMV-spesifik T hücreleri, üç aferez hücre ürünlerinden zenginleştirildi. Kararlı durum aferez ürünü 10 10 toplam nükleer hücreler (TNC) CMV seropozitif donörden 2 saat boyunca hasat ve üretilmiştir. 10 9 TNC CMV pp65 türetilmiş peptidler (60 nmol), 4 saat ve T hücreleri, otomatik hücre zenginleştirme cihazda CCS kullanılarak izole edildi salgılayan IFN-y için aktive edildi. Bir operatör, tüm reaktifler ve boru setleri yüklemek için deney başında ihtiyaç vardı. Cihazı başlanmadan açma başlangıçtaki sistemin Kur 120 dk yaklaşık 60 sürdü. Makine daha sonra reaktifler ve boru setleri (örneğin gecede gibi) gözetimsiz çalışan makinenin sağlayan ve böylece yüklendikten sonra başlamak için programlanmış olabilir, unutmayın. Operatör karakterizasyonu gerçekleştirmek için 15 saat sonra tekrar gerekliHücre saflık ve canlılık için son ürünleri. Zenginleştirme sonra hücre üst fazı, Mycoplasma ve endotoksin varlığı için taranmıştır. Doğrulama sonrasında işlenen hücreler hastalara doğrudan infüze edilebilir veya daha sonra uygulamalar için donduruldu.
Hücre sayımları Tablo 2'de verilen formüller kullanarak standart uygulamalar sayma aşağıdaki hücreyi tespit edilmiştir. Hücre sayısının her tür üç kez tekrarlandı ve sonuçlar standart sapma (SD) gibi ortalama toplam hücre sayıları ifade edildi. Raporlar daha sonra hücre analiz önerilen yazılımı kullanılarak analiz edildi. Uygun bir lökosit ve lenfositler belirlemek için Yolluk Şekil 2 'de gösterilmiştir. Hücre sayımları için veriler Tablo 3'te sunulmaktadır. Şekil 3 ve Şekil 4' de gösterilmiştir, IFN-γ + T hücreleri belirlemek için kullanılan Ayırıcı stratejisi. Zenginleştirme önce, hücrelerin canlılığı>% 95 rutin olmuştur. Enrichmen sonrat, hücrelerin hayatta kalabilirliği% 50 <idi. IFN-y + T hücrelerinin mutlak sayısı önce ve zenginleştirme işleminden sonra değerlendirildi. Zenginleştirme önce IFN-γ + T hücrelerinin sayısı TNC başlayarak, 10 9 türetilmiş olarak 1.14 x 10 6 ± 0.35 x 10 6 idi ve zenginleştirmeden sonra 3,09 x 10 5 ± 1.70 x 10 5 IFN-γ + T hücreleri olmuştur. Orada 0.16 ± 0.18% IFN-γ + işlemden önce mevcut CD4 + T hücreleri ve bu zenginleştirme sonrası 47.5 ± 34.7% yükseldi. CD8 + IFN-y + yakalama önce T hücrelerinin saflığı oranı 0,47 ±% 0.1, ve zenginleştirmeden sonra 90,3 ± 1,7% yükselmiştir (Tablo 3 ve 4). Yakalanan (pozitif) bir parça halinde Örnek iyileştirme sta IFN-γ + T hücrelerinin ölçümüne dayanan, CD4 + T hücreleri için 32,9 ± 15,7 ve% CD8 + T hücreleri için 31,8 ± 13,2% idi rting nüfusun (Tablo 4). Bu veriler, CD4 + ve CD8 + hem de CMV pp65-spesifik T hücreleri insan uygulaması için uygun olan bir şekilde, otomatik olarak hasat edilebilir olduğunu göstermektedir.
CCS sistemi kullanılarak CMV-spesifik T hücrelerinin Şekil 1. zenginleştirilmesi (A). Tecrübeli uzmanları tarafından işlenir birinci nesil hücresi zenginleştirme cihazında yer alan birden fazla işlem aşamaları. (B) işlem adımları çoğu ilk boru kurulum hariç otomatiktir İlk nesil cihazı ile karşılaştırıldığında operatör taşıma süresi 12 saat - 10 kaydeder ikinci nesil cep zenginleştirme cihazda. Zenginleştirilmiş CMV-virüs spesifik T hücreleri, hücre analizörü akış sitometrisi ile karakterize edilir. > Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Ayırıcı stratejisi 1 ile 6 sayı. Yaşayabilir T hücrelerini belirlemek için kullanılan şekilde gelen yolluk hiyerarşi etki gösterir. (1) (2) FSC alana karşı FSC-height çizerek çifti hücreleri çıkarılması, zaman kapısı kurulması (3) (4) (5) canlı lökositlerin Seçme ve (6) propidium iyodür boyama ile orijinal nüfus geçerli lenfositleri. hücre artıkları çıkarılması, CD45 + hücrelerin belirlenmesi, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
yük / 52808 / 52808fig3.jpg "/>
Şekil CD3 + T hücreleri belirlemek için kullanılır 3. Yolluk stratejisi. Analizi leke akış sitometrisi (3A) önce ve (3B) hücre ilave Burada gösterilen sonra CD3 + T hücreleri. Daha önce zenginleştirme işleminden sonra örneklerde mevcut kaç CMV-spesifik peptid Aktive edilmiş T hücreleri belirlemek için son derece önemlidir. Bu şekilde, sayı 1 den 6 ya karşılık gelen hücre popülasyonu her iki boyuttaki veya belirli bir antikor ile boyanmış göstermektedir. (1), (3) CD45 + hücreleri seçme, (2) çift hücreleri çıkarılması, zaman kapı ayarlama (4) (5) canlı lökositlerin Seçme ve (6) geçerli CD3 + lenfositlerin hücre artıkları çıkarılması. Propidium iyodür boyaması ölü hücreleri çıkarmak için yapılmıştır./52808fig3large.jpg "Target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Ayırıcı stratejisi IFN-y + T hücrelerinin saflığını belirlemek için kullanılır. Aktif CMV-spesifik T hücreleri, kontrol CMV enfeksiyonu için kritik olan IFN-y + yüzden T hücreleri üzerinde ifade perdeleme kullanılmıştır. Zenginleştirmeden sonra zenginleştirme ve (B) daha önce CD4 + ve CD8 + alt-(A) arasında yer IFN-γ + T hücreleri. (08/07), CD4 + T hücreleri ve CD8 + T hücrelerinin yüzdesi A ve B 'de gösterilmiştir. (7a ) CD4 + IFN-γ + T hücrelerinin yüzdesi C Benzer yolluk alanı içinde kare kutu (a) 'da gösterilen ve D8 + IFN-γ + T hücrelerinin (8a). "T" geçitli popülasyonda hücrelerin% temsil toplam nüfusu ve "#" hücrelerin% temsil eder. Propidium iyodür boyama kapı dışarı ölü hücreleri uygulandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Hücre boyama stratejisi için kullanılan fraksiyonların Tablo 1. Ciltler.
CD8 + IFN-y + T hücreleri zenginleştirme işlemi. Hesaplama sonra CD4 + IFN-y + T hücrelerinin hesaplanmasında kullanılan Tablo 2. Formüller benzer gerçekleştirilir.
Bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Öncesi ve sonrası zenginleştirme. 1 sonuç burada gösterilen örnek # T-hücre alt Tablo 3. Toplam hücre sayımı.
Tablo 4. Saflık öncesi ve örnek içerisinde 1. zenginleştirme işleminden sonra IFN-γ + T hücre kurtarma.
Klinik sınıf CMV-antijene spesifik T hücrelerinin izolasyonu kullanılan strateji sıralama Tablo 5. Celi. 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evlatlık T-hücre tedavisi B-hücresi maligniteler 4 tedavisinde uygulanabilir bir seçenek olarak ortaya çıkmıştır. Bu tedavi edici potansiyeli replikatif yaşlanmayla 2 barındırmayan hedef antijene özel T hücreleri istenen sayıda beslerken bağlıdır. Bu halen geçerli gıda işleme uygulamalarıyla uyumlu genişletilmiş T hücrelerinden antijen belirli T hücrelerinin saf bir nüfus ayrıştırılması ile elde edilebilir. İki ayırma işlemleri yaygın olarak, yani, floresans ile aktive edilen hücre çeşitleme (FACS) kullanılır ve son 5 inceledik manyetik etkinleştirilmiş hücre tasnif (MACS) CMV antijene spesifik T hücreleri üretmek için. Diğerleri arasından bir strateji kullanarak avantajı Tablo 5'de özetlenmiştir. MACS teknolojisi FACS teknolojisine kıyasla daha ucuz ve daha hızlı bir şekilde üst hücresi zenginleştirme saflığı bulunmaktadır. Hücre zenginleştirme için tek kullanımlık sütun ve reaktiflerin eklenmesi kullanımında tamamen yapım örnek kontaminasyon numunenin önlerkolay klinik ortamlarda uygulamak. Yarı otomatik hücre zenginleştirme cihazı emek yoğun ve zaman klinik talebi beslemek için gerekli olan otomatik hücre zenginleştirme cihazının yani gelişimini alıcıdır.
Otomatik hücre zenginleştirme CCS cihazı, adoptif transfer için hematopoietik kök hücrelerin, somatik kök hücrelerin yanı sıra T hücreleri gibi klinik sınıf hücrelerin izole edilmesi için bir çok yönlü bir alettir. Bu otomatik bir cihaz, tek kullanımlık bir GMP-uyumlu tek birim başlangıç malzemesi hücre yıkama, hücre ayırma, hücre kültürü, ve son ürün oluşumunun fraksiyonasyon da dahil olmak üzere, hücre işlemine entegre eder. Kapalı sistem temiz oda gereksinimlerini azaltır ve GMP sağlayarak operatör katılımı en aza indirir. Otomasyon böylece bu laboratuar işlemleri ile ilgili maliyeti düşürmek mevcut olması bir operatör için gereken süreyi azaltır.
Kıyasla, otomatik hücre koyulaştırma aygıtı doğrulamak içinYarı otomatik hücresi zenginleştirme aygıtı ile, biz aferez ürün ile CMV pp65-türevi peptidler inkübe edildikten sonra CMV-spesifik T hücrelerinin izole edilmiştir. GMP dereceli CMV pp65 türevli peptit kokteyli (örneğin PepTivator), insan sitomegalovirüsün pp65 proteinin tam dizisini kapsayan esas olarak örtüşen 11 amino asitli 15 mer-peptidlerin oluşan bir peptid havuzu. Örnek kurtarma verimi 10 9 TNC den ~ 0.3 x 10 6 CD3 + IFN-γ + T hücreleri oldu. Klinik çalışmalar HHN (~ 360 4000 hücre / kg vücut ağırlığı) hastalar için profilaktik bir tedavi olarak, bir kaç bin CMV-spesifik T hücrelerinin beslerken CMV ye karşı koruma ile sonuçlandığını ortaya koymuştur. 3,0 x 10 5 ve 1 x 10 - 4 - 1,2 x 10 5 hücre sırasıyla vira- Örnek olarak, bu teknoloji, 70 kg ağırlığındaki bir yetişkin ve 30 kg çocuk kullanılarak klinik çalışmalarda CMV tedavi etmek için görünüşe göre sadece 0.26 gerektirir Belirli T hücreleri 12-15 ve ark., 13 ile gösterildiği gibi, genel olarak, ölü / canlı hücre sayısı, yarı otomatik hücresi zenginleştirme cihazı ile karşılaştırılabilir. Bu, farklı infüzyon için yeterli malzeme ile ilişkili gibi canlı hücreler daha yüksek bir sayısı da kabul edilebilir olacaktır. Bununla birlikte, genel olarak daha uygun hücreler de T-hücreleri (B, NK, vs) dışında daha fazla hücre anlamına gelir. Verilerimiz otomatik hücre zenginleştirme sistem üzerinde üretilen CMV-spesifik T hücreleri daha sonra allojenik HKHT'den sonra infüzyon yoluyla CMV-spesifik T hücrelerinin klinik çekici numaraları ile sonuçlandığını göstermektedir.
HKHT yüksek morbidite ve mortalite hem sonuçlanan sonra CMV enfeksiyonu önemli bir sorun olabilir. Ayrıca, CMV enfeksiyonu anti-viral ilaçlar 16 ile erken tanı ve erken tedavi son ilerlemelere rağmen, artan maliyetler ile ilişkilidir. Gansiklovir ve foskarnet ile mevcut tedavi HSCT tıbbi kırılgan alıcılarında toksisiteye neden olabilir.Vericiden elde edilen CMV-spesifik T hücrelerinin ilave-bilmek ve allojenik HKHT'den 9 alıcılarında fırsatçı enfeksiyonları tedavi etmek için ortaya konmuştur. Adoptif immünoterapi olarak bu yaklaşım, aynı zamanda (ilgili antijenin türetildiği klinik sınıf peptit kokteyli reaktifleri ile tek çekirdekli hücreler (MNC) inkübe edilerek Epstein-Barr virüsü (EBV), adenovirüs, 8 ve Aspergillus 3 gibi diğer patojenler, bağışıklık geri yardımcı uygulanmıştır Malzeme ve ekipmanın tablo). Yakın geçmişte, araştırmacılar güvenli immünodominant peptid 17 sunulması alıcıda, en az bir HLA aleli ile eşleştirilir, üçüncü taraf patojen-spesifik T hücrelerinin akışı sağladı. Otomatik hücre zenginleştirme CCS sistemi de donör gibi allojenik kordon kanı transplantati için donörler ile durum olarak CMV seronegatif veya kullanılamıyor olduğunda yararlı olacaktır off-the-raf uygulamaları için üçüncü taraf T hücrelerini oluşturmak için kullanılan olabilirüzerinde.
Özetle, CCS otomasyona dayalı CMV-spesifik T hücreleri elde etmek için bir otomatik hücre zenginleştirme cihazının kullanımını göstermektedir. Bu cihaz klinik ekipleri immün sistemi baskılanmış hastalarda tümör spesifik T hücreleri yanı sıra, patojen-spesifik demlenmeye eşiğini düşürmek için potansiyeli olduğuna inanıyorum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MD Anderson Kanser Merkezi ve Cooper Hem ZIOPHARM Onkoloji, Inc., ve Intrexon Corporation mali ilgi var. 7 Mayıs 2015 tarihinde, Dr. Cooper ZIOPHARM Onkoloji Baş Müdür olarak atandı. Doktor Cooper şimdi, MD Anderson bir Misafir Araştırmacı olduğunu. Doktor Cooper kurulan ve o yapay nükleazlarla ile Sangamo BioSciences ile patente sahiptir InCellerate, Inc. sahibi. O Targazyme, Inc. (eski Amerikan Kök hücreler, Inc.), GE Healthcare, Ferring İlaç, Kader Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals ve Bristol-Myers Squibb danışır. O Cellectis Bilimsel Danışma Kurulu üzerindedir. O, Miltenyi Biotec honoraria alır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 ml Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/ml) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
- Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
- Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
- Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
- Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), Available from: http://www.cambridgeresearchcentre.co.uk/all-publications/blood-and-marrow-transplantation/ 55-59 (2014).
- Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
- Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
- Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
- Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
- Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
- Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
- Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
- Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
- Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
- Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).
