Abstract
De adoptieve overdracht van pathogeen-specifieke T-cellen kunnen worden gebruikt ter voorkoming en behandeling van opportunistische infecties zoals cytomegalovirus (CMV) infecties optreden na allogene hematopoietische stamceltransplantatie. Viraal-specifieke T-cellen van allogene donoren, met inbegrip van derden donoren, kan worden vermeerderd ex vivo in overeenstemming met de huidige goede fabricagepraktijken (cGMP), het gebruik van herhaalde rondes van antigeen-gedreven stimulatie om de gewenste T-cellen selectief te propageren. De identificatie en isolatie van antigeen-specifieke T-cellen kunnen ook worden uitgevoerd op basis van de cytokine beeldverwerkingssysteem van T-cellen die zijn geactiveerd met gamma-interferon (IFN-γ) afscheiden. Echter verbreide toepassing van het cytokine beeldverwerkingssysteem (CCS) voor het herstel van immuniteit beperkt als het productieproces is tijdrovend en vereist een ervaren operator. De ontwikkeling van een tweede generatie cel verrijking apparaat zoals CliniMACS Prodigy nustelt onderzoekers virus-specifieke T-cellen met behulp van een geautomatiseerde, minder arbeidsintensief systeem genereren. Dit apparaat scheidt magnetisch gemerkte cellen van niet-gemerkte cellen met behulp van magnetische geactiveerd celsortering technologie van klinische kwaliteit producten genereren, is ontworpen als een gesloten systeem en kan worden benaderd en uitgevoerd op de benchtop. We tonen de werking van dit nieuwe geautomatiseerde celverrijking apparaat CMV verkregen van een steady-state aferese verkregen uit een CMV seropositieve donor pp65-specifieke T-cellen produceren. Deze geïsoleerde T-cellen kunnen vervolgens direct worden toegediend in een patiënt onder institutionele en federale regelgeving toezicht. Alle stappen bioprocessen inbegrip van verwijdering van rode bloedcellen, wordt stimulatie van T-cellen, afscheiding van antigen-specifieke T-cellen, zuivering en wassen volledig geautomatiseerd. Apparaten zoals deze verhogen de mogelijkheid dat T-cellen voor toepassing op de mens buiten gewijd goede fabricagemethoden (GMP kan worden vervaardigd) Faciliteiten en in plaats daarvan worden geproduceerd in het bloed bancaire faciliteiten waar het personeel geautomatiseerde protocollen kunnen begeleiden om meerdere producten te produceren.
Introduction
Hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT) 1 te combineren met adoptieve T-celtherapie verbeteren graft-versus-tumor effect en immuniteit voor opportunistische infecties 2. Genereren van antigenspecifieke donor afgeleide T-cellen voor infusie verleden vereiste geschoold personeel en het gebruik van gespecialiseerde faciliteiten die GMP-compliant zijn. De levering van de T-cellen heeft geleid tot een resolutie van opportunistische infecties 3, alsmede de behandeling van de onderliggende maligniteit 4. Onlangs hebben onderzoekers aangetoond dat de adoptieve overdracht van slechts enkele duizenden virus-specifieke T-cellen (1 x 10 ~ 4 - 2,5 x 10 5 cellen / kg lichaamsgewicht van de ontvanger) kan met succes opportunistische CMV infecties na allogene HSCT 5-9 behandelen. Een beperkt aantal GMP faciliteiten met bijbehorende geschoolde productievereisten en de hoge kosten in verband met celproductie is echter restricted patiënt toegang tot veelbelovende T-cel therapieën 10. Een benadering voor het isoleren van antigeen-specifieke T-cellen is gebaseerd op de CCS met een bi- specifiek reagens voor CD45 en IFN-γ herkennen. Zoals wordt getoond, kan deze methode worden gebruikt om de klinische kwaliteit CMV-specifieke T-cellen toepassing van een geautomatiseerde celverrijking CCS inrichting (figuur 1B) te genereren.
CMV-specifieke T-cellen worden gegenereerd door het incuberen van overlappende peptiden van CMV pp65 antigen met leukaferese totale nucleaire cellen (TNC) van CMV seropositieve donoren. Deze peptiden, weergegeven in de context van humane leukocyt antigeen (HLA), activeert de CMV pp65-specifieke T-cellen in de TNC IFN-γ scheiden. Deze T-cellen kunnen vervolgens worden "gevangen" en magnetisch gescheiden. De werking van de eerste generatie cel verrijking inrichting (figuur 1A) vereiste personeel bekwaam in celkweek onder GMP condities en coördinatie van personeel voor de meervoudige s ondernemenTEPS noodzakelijk een "gevangen" product te genereren.
De procedure vereist gewoonlijk 10 tot 12 uur van continue werking, en daarom waarschijnlijk personeel moet werken dan twee verschuivingen in de GMP faciliteit. Deze beperkingen zijn nu ondervangen door de invoering van een tweede-generatie-inrichting (figuur 1B). Dit apparaat verbindt magnetische verrijking, vergelijkbaar met de eerste generatie apparaat, maar automatiseert andere aspecten van de CCS een unbreached benadering. Dit vermindert de belasting van de GMP-team als de meeste van de stappen kan zonder toezicht door het personeel worden uitgevoerd. Aangezien de inrichting werkt als een gesloten systeem, de antigen-specifieke T-cellen kan worden opgevangen en verwerkt op stationaire behalve de stappen van leukaferese isolatie en bereiding van materialen voordat het instrument. Details van de volledige instrumentatie en functionaliteit van deze tweede generatie cel verrijking apparaat zijn pubsteld 11.
Hier beschrijven we de stappen CMV pp65-specifieke T-cellen te verrijken door een steady-state aferese product de geautomatiseerde celverrijking CCS systeem. Eenmaal geïsoleerd kunnen deze CMV-specifieke T-cellen direct worden toegediend in een patiënt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van de materialen onder steriele omstandigheden (zie materialen en apparatuur Table)
- Bereid 3 L PBS / EDTA-buffer, aangevuld met humaan serumalbumine (HSA) tot een eindconcentratie van 0,5% (w / v).
- Bereid 1 L zakje klinische kwaliteit 0,9% natriumchloride (NaCl) oplossing en 2 L van GMP gehalte celkweekmedium.
- Bereid 60 nmol van CMV-specifieke peptide antigen cocktail door reconstitutie van een flesje van CMV pp65 met 8 ml steriel water.
- Transfer CMV pp65 peptide cocktail in een 50 ml volume bevriezen zak met behulp van een Luer / Spike interconnector en klem met vergrendeling tang om verdere verspreiding van de cocktail in de slang set vermijden. Open cel verrijking slangen set (TS 500) onder steriele omstandigheden.
- Met behulp van steriele slangen lasser, sluit peptide cocktail bevriezing zak in de buis aansluiting voor klep 2 buis set TS 500. Laat de peptide cocktail zakklem niet open op dit moment.
- Verwijder 1 x 10 9 TNC starten cellulaire product en op te schorten in PBS / EDTA-buffer met 2,5% HSA tot een totaal volume van 50 ml. Injecteer de cellulaire product in een 150 ml overdracht zak.
2. Voorbereiding en gebruik van geautomatiseerde Cell Enrichment System (zie materialen en apparatuur Table)
- Schakel de cel verrijking systeem (Figuur 1B) en kies het programma "CCS_IFN-γ verrijking". Observeren een gebruikersinterface toont schermen met instructies en foto's van de operator begeleiden door de procedure.
- Voer de parameter "Operator" en "Tubing Set P / N Nee". Vervolgens installeert u de Tubing Set 500 geautomatiseerde cel verrijking apparaat volgens de instructies weergegeven op het interactieve beeldscherm.
- Volg de stap voor stap instructies op het scherm om het medium en buffers om het apparaat aan te sluiten. Record catalogusnummer en het lotnummer van de reagentia voor connecting om het instrument.
- Na de laatste controle van de buis set, opent de klem van het peptide cocktail tas. Open het medium zak en start automatisch priming van de buis set.
- Na de priming stap is voltooid, aanvulling HSA (2,5%) NaCl in buffer in het reservoir (200 ml) met behulp van de steriele buis lasser. Breng de start cellulaire product in de "Application zak" met behulp van de steriele slangen lasser.
- Sluit CCS (IFNy) reagentia in respectievelijke slang via adapters. Voer gewenste tijd tot een fractie van celmateriaal verzamelen voordat verrijkingsproces. Review en de juistheid van de gegevens / parameters ingevoerd. Start het proces.
- Voor de start van de geautomatiseerde cel verrijkingsproces, verwijder de Quality Control Bag (QCB, origineel fractie (ori) bevat ongeveer 1,3 ml van 100 ml kamer inhoud verdund met PBS / EDTA buffer). Verzegeling van de QCB, wegen, en bewaar bij 4 ° C.
- Start de enrichment proces. Aan het eind van het proces zullen doelcellen worden geëlueerd met een geschatte volume elutiebuffer het reservoir.
- Verzegeling van de Non Target Cell Bag (NTCB, negatieve fractie = neg) en Target Cell Bag (TCB, positieve fractie = pos) en weegt elke zak. De gewichten worden later gebruikt voor de berekening van het aantal cellen.
- Onmiddellijk na de verrijkingsprocedure verzamelen twee aliquots per fractie voor flowcytometrie-analyse, en opslaan van de rest van de monsters bij 4 ° C. Gebruik een monster portie voor celgetal vastberadenheid en het andere monster monster voor de verrijking prestatie-analyse (tabel 1).
- Verwijder het instellen van de cel verrijking instrument tubing. Transfer het logbestand op een USB-schijf voor toekomstig gebruik.
LET OP: Alle reagentia moeten bereid onder steriele omstandigheden. Het gebruik van een bioveiligheid type II kap wordt sterk aanbevolen. Gebruik steady-state aferese cellulaire product (niet-gemobiliseerd) geïsoleerd van een gezondeCMV seropositieve donor CMV antigeen-specifieke T-cellen te verrijken. Slechts FDA licentie HSA worden gebruikt. De buffer voor mobiele preparaat zijn bij 19 ° C worden bewaard tot 25 ° C lagere of hogere omgevingstemperaturen resulteert in verminderde zuiverheid en een verminderde opbrengst van de doelcellen.
3. celgetal Bepaling
- Neem monsters van QCB, NTCB en TCB voor celtellingen zoals getoond in tabel 1. Voeg CD45-VoBlue elk aliquot (titer 01:11) en incubeer in het donker gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Voeg 1,5 ml vers bereide rode bloedcellen lysis oplossing (1x) naar de oorspronkelijke fractie en negatieve fractie, 450 ul vers bereide rode bloedcellen lysisoplossing de positieve fractie en alle fracties incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Net voor analyse toe propidiumjodide tot een uiteindelijke concentratie van 1 ug / ml (1: 100 verdunning van 100 ug / ml). Gebruik automatische celgetalmeter te tellen en vi cel bepalenbekwaamheid. Gebruik celgetalmeter apparaat aanbevolen software voor flowcytometrieanalyse. Bepaal de absolute tellingen van leukocyten voor originele, negatieve en positieve fracties.
Opmerking: De telling van levensvatbare cellen leukocyten per ml genomen celgetal analysemonsters wordt bepaald met de cel analyzer aanbevolen software. - Stel de regio zoals getoond in figuur 2 (regio 5, levensvatbare leukocyten). Gebruik de volgende gating strategie om celgetal te bepalen. Een levensvatbare leukocyten in originele fractie wordt getoond in figuur 2.
- De aangegeven gebieden (figuur 2, 1-6) zijn hiërarchisch als volgt:
1: Tijd poort → 2: Single cellen → 3: CD45 + cellen → 4: Leukocyten (puin uitgesloten) → 5: Levensvatbare leukocyten → 6: Levensvatbare lymfocyten - Herhaal dezelfde stappen naar cel telt voor negatieve en positieve fracties te bepalen. Bereken het aantal cellen van de gehele fractiedoor te overwegen het verdunningsmiddel factor van het monster en de totale omvang van de fractie (tabel 2).
4. Onderzoek van de Scheiding Prestatie
- Was de fracties van QCB, NTCB en TCB fractie cellen met pre-gekoelde PBS / EDTA buffer / 0,5% AB serum. Centrifugeer de cellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C en zuig de supernatant.
- Resuspendeer cellen in 100 pi antilichaam fluorochroom kleuring mengsel dat: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue en anti-IFNy-PE (titer 01:11) en incubeer in het donker gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
- Voeg 1 ml vers bereide rode bloedcellen lysis oplossing (1x) en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en zuig de supernatant. Resuspendeer de cellen in een geschikt volume PBS / EDTA buffer / 0,5% AB serum.
- Voeg propidiumjodide tot een uiteindelijke concentratie van 1 ug / ml juist voor analyse (1: 100 dilutiop van 100 ug / ml). Voer flowcytometrie analyse om de zuiverheid van het monster te evalueren.
- Gebruik de volgende gating strategie om de CD3 + T-cellen in levensvatbare leukocyten Gating strategie berekenen voor het bepalen van de CD3 + T-cellen wordt getoond in positieve fractie na CCS verrijkingsproces. De aangegeven gebieden (figuur 3A en 3B, 1-6) zijn hiërarchisch als volgt verbonden:
1: Tijd poort → 2: Single cellen → 3: CD45 + cellen → 4: Cellen (puin uitgesloten) → 5: Levensvatbare leukocyten → 6: Levensvatbare CD3 + cellen bevolking - Bepaal de frequentie van CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + en CD8 + IFN-γ + T-cellen na CCS verrijkingsproces (tabel 2).
- Gebruik de gating strategie om de frequentie van CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + en CD8 + IFN-γ + T cellen onder f weergegeven bepalenof een origineel en verrijkt (captured) positieve fractie na het CCS-proces. De aangegeven gebieden zijn hiërarchisch verbonden en benoemd als volgt:
1: Tijd poort → 2: Single cellen → 3: CD45 + cellen → 4: Cellen (puin uitgesloten) → 5: Levensvatbare Leukocyten → 6: Levensvatbare CD3 + cellen → 7: CD4 + cellen → 7a: CD4 + IFN-γ + cellen (box) → 8: CD8 + cellen → 8a: CD8 + IFN-γ + cellen (box)
Opmerking: De eerste 6 aangegeven gebieden van de hiërarchie verbindingen zijn hetzelfde als figuur 3, (1-6) en de laatste 2 gebieden worden getoond in Figuur 4 (6-8a).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie, een geautomatiseerde celverrijking CCS System werd gebruikt voor de geautomatiseerde productie van CMV pp65-specifieke T-cellen. CMV-specifieke T-cellen werden verrijkt uit drie aferese celproducten. De steady-state aferese product werd geoogst meer dan 2 uur van een CMV-seropositieve donor en genereerde 10 10 totale nucleaire cellen (TNC). 10 9 TNC werden vervolgens geactiveerd met CMV-pp65 afgeleide peptiden (60 nmol) gedurende 4 uur en de IFN-γ-uitscheidende T-cellen werden geïsoleerd met de CCS de geautomatiseerde celverrijking apparaat. Een operator is nodig aan het begin van het experiment om alle reagentia en slangensets laden. Configuratie van het systeem van de initiële uitpakken het starten van de inrichting duurde ongeveer 60 tot 120 min. Merk op, het apparaat kan vervolgens worden geprogrammeerd starten nadat de reagentia en slangensets daardoor geladen waardoor de machine zonder toezicht (bijvoorbeeld een nacht). De operator is weer nodig na 15 uur tot de karakterisering van de uit te voereneindproducten voor mobiele zuiverheid en levensvatbaarheid. Na verrijking van de celsupernatant werd gescreend op mycoplasma en de aanwezigheid van endotoxine. Na validatie van de bewerkte cellen kunnen direct in patiënten geïnfuseerd of gecryopreserveerd voor latere toepassingen.
Celtellingen werden vastgesteld na cel standaardpraktijken met de formules in Tabel 2 tellen. Elk type celtelling werd driemaal herhaald en de resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde totale celtellingen met standaard deviatie (SD). Rapporten werden vervolgens geanalyseerd met behulp van mobiele analyzer aanbevolen software. Gating levensvatbare leukocyten en lymfocyten vast is weergegeven in figuur 2. De gegevens voor de cel tellingen worden weergegeven in Tabel 3. De gating strategie gebruikt om IFN-γ + T cellen te bepalen wordt getoond in figuur 3 en figuur 4. Voor verrijking, het levensvatbaarheid van cellen werd routinematig> 95%. Na enrichment, de levensvatbaarheid van de cellen was <50%. Het absolute aantal van IFN-γ + T-cellen werd beoordeeld voor en na het verrijkingsproces. Het totale aantal IFN-γ + T-cellen voor verrijking was 1,14 x 10 6 ± 0,35 x 10 6 afgeleid uit 10 9 start TNC en na verrijking was 3,09 x 10 5 ± 1,70 x 10 5 IFN-γ + T-cellen. Er waren 0,16 ± 0,18% IFN-γ + CD4 + T cellen aanwezig voorafgaand aan de verwerking en deze gestegen tot 47,5 ± 34,7% na verrijking. De zuiverheid percentage CD8 + IFN-γ + T-cellen voorafgaand aan vangst was 0,47 ± 0,1%, en steeg tot 90,3 ± 1,7% na verrijking (Tabel 3 en 4). Monsterrecovery Het vastgelegde (positieve) fractie was 32,9 ± 15,7% voor CD4 + T-cellen en 31,8 ± 13,2% voor CD8 + T-cellen op basis van meting van IFN-γ + T cellen in de sta rting populatie (Tabel 4). Deze gegevens geven aan dat zowel CD4 + en CD8 + CMV pp65-specifieke T-cellen automatisch op een wijze die geschikt is voor hun menselijke toepassing kan worden geoogst.
Figuur 1. Verrijking van CMV-specifieke T-cellen CCS systeem. (A) Multiple verwerkingsstappen betrokken bij de eerste generatie cel verrijking apparaat worden door vakmensen. (B) De meeste processtappen, behalve initiële buizen setup, geautomatiseerd in de tweede generatie celverrijking inrichting die 10 slaat - 12 h operator verwerkingstijd vergeleken met de eerste generatie apparaat. De verrijkte CMV-virus-specifieke T-cellen worden gekenmerkt door de flowcytometrie cell analyzer. > Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Gating strategie gebruikt om levensvatbare T-cellen te bepalen. De nummers 1 tot en met 6 geven de overeenkomstige venstertijd hiërarchie domein in de figuur. (1) Het opzetten van tijd poort, (2) verwijderen doublet cellen door het plotten van FSC-hoogte tegen FSC-gebied (3) Het identificeren van CD45 + cellen, (4) verwijderen celdebris (5) selecteren van levensvatbare leukocyten en (6) Levensvatbare lymfocyten van oorspronkelijke bevolking door propidiumjodide kleuring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
belasting / 52.808 / 52808fig3.jpg "/>
Figuur 3. Gating strategie gebruikt voor CD3 + T-cellen te bepalen. Flowcytometrie blot analyse CD3 + T-cellen vóór (3A) en na (3B) cel verrijking zijn. Het is cruciaal om te bepalen hoeveel CMV-peptide specifieke geactiveerde T-cellen aanwezig in de monsters vóór en na het verrijkingsproces. In deze figuur nummers 1 tot 6 geven de overeenkomstige celpopulatie grootte of gekleurd door een specifiek antilichaam. (1) instellen tijd-poort (2) Verwijderen doublet cellen, (3) selecteren CD45 + cellen, (4) Het verwijderen van celresten (5) selecteren van levensvatbare leukocyten en (6) Levensvatbare CD3 + lymfocyten. Propidiumjodide kleuring werd uitgevoerd om de dode cellen te verwijderen./52808fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Gating strategie gebruikt om de zuiverheid van IFN-γ + T cellen te bepalen. Geactiveerde CMV-specifieke T-cellen zijn cruciaal voor het regelen van CMV-infectie, zodat IFN-γ + expressie op T-cellen werden gebruikt voor gating. IFN-γ + T-cellen tussen CD4 + en CD8 + subsets (A) voor verrijking en (B) na verrijking. (7/8) Percentage CD4 + T-cellen en CD8 + T-cellen wordt getoond in A en B. (7a ) Percentage CD4 + IFN-γ + T-cellen wordt weergegeven in het vierkant (a) binnen het gating stippellijn eveneens voor C D8 + IFN-γ + T cellen (8a). "T" staat% van de cellen in de totale populatie en "#" geeft% van de cellen in een gesloten populatie. Propidiumjodide kleuring werd uitgevoerd om gate-out dode cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1. De volumes van de fracties voor celkleuring strategie.
Tabel 2. Formules voor de berekening van CD4 + IFN-γ + T-cellen na verrijkingsproces. Berekening van CD8 + IFN-γ + T-cellen wordt eveneens uitgevoerd.
Klik hier om een grotere versie van deze tabel bekijken.
Tabel 3. Totaal cel tellingen in T-cel subsets voor en na verrijking. Sample # 1 resultaten worden hier getoond.
Tabel 4. zuiverheid en terugwinning van IFN-γ + T-cellen voor en na verrijkingsproces monster # 1.
Tabel 5. Celsorting strategieën gebruikt bij de isolatie van klinische kwaliteit CMV-antigeen-specifieke T-cellen. 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adoptieve T-celtherapie heeft ontpopt als een haalbare optie voor B-cel maligniteiten 4 behandelen. Het therapeutisch potentieel is afhankelijk infuseren het gewenste aantal doelwitantigeen specifieke T-cellen die replicatieve senescentie 2 ontberen. Dit kan worden bereikt door het uitzoeken van een zuivere populatie van antigeen-specifieke T-cellen van geëxpandeerde T-cellen in overeenstemming met de huidige good manufacturing practices. Twee sorteren procedures worden veel gebruikt, namelijk, fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) CMV antigen specifieke T-cellen genereren we onlangs 5 hebben beoordeeld. Het voordeel van een strategie voor de ander is weergegeven in tabel 5. MACS technologie biedt de hoogste celverrijking zuiverheid in een goedkopere en snellere manier vergeleken met FACS technologie. Daarnaast is het gebruik van het beschikbare kolommen en reagentia voor mobiele verrijking geheel voorkomt monster om besmetting monster waardoor hetgemakkelijker toe te passen in een klinische context. De semi-automatische celverrijking inrichting arbeidsintensief en tijdrovend, zodat de ontwikkeling van het geautomatiseerde celverrijking inrichting nodig was om klinische vraag voeden.
De geautomatiseerde celverrijking CCS apparaat is een veelzijdig instrument voor het isoleren van klinische kwaliteit cellen zoals hematopoëtische stamcellen, somatische stamcellen, evenals T-cellen voor adoptieve overdracht. Deze geautomatiseerde inrichting integreert celverwerking, zoals fractionering van uitgangsmateriaal cel wassen, scheiden, celkweek, en de vorming eindproduct eenmalig gebruik GMP-compliant wegwerpeenheid. Het gesloten systeem vermindert de cleanroom eisen en minimaliseert betrokkenheid operator voor het behoud van de GMP-faciliteiten. Automatisering vermindert de tijd die nodig is voor een operator aanwezig zijn waardoor de kosten verbonden aan deze laboratoriumprocedures afneemt.
Om het automatische celverrijking inrichting te valideren, vergelekende semi-automatische celverrijking inrichting, die we CMV-specifieke T-cellen na incubatie van CMV pp65-afgeleide peptiden met aferese product. GMP kwaliteit CMV-pp65 afgeleide peptide cocktail (bijv PepTivator) is een peptide pool die voornamelijk bestaat uit 15-mer peptiden met 11 aminozuren overlappen, die de volledige sequentie van de pp65-eiwit van humaan cytomegalovirus. Monsterrecovery opbrengst was 0,3 x 10 ~ 6 CD3 + IFN-γ + T-cellen uit 10 9 TNC. Klinische studies hebben aangetoond dat infusie enkele duizenden CMV-specifieke T-cellen als profylactische behandeling van patiënten (~ 360 tot 4000 cellen / kg lichaamsgewicht) HSCT resulteerde in bescherming tegen CMV. Bijvoorbeeld, om de CMV in klinische proeven te behandelen met behulp van deze techniek, een 70 kg volwassene en een kind 30 kg blijkbaar vereisen slechts 0,26 - 3,0 x 10 5 en 1 x 10 4 - 1,2 x 10 5 cellen, respectievelijk viral- specifieke T-cellen 12-15 et al. 13. Een groter aantal levende cellen zouden ook aanvaardbaar omdat dit gepaard zou gaan met genoeg materiaal voor verschillende infusies. Echter, meer levensvatbare cellen in het algemeen houdt ook anders dan T-cellen (B, NK, etc) cellen. Onze gegevens tonen aan dat CMV-specifieke T-cellen gegenereerd op geautomatiseerde celverrijking systeem geleid klinisch aansprekende aantal CMV-specifieke T-cellen die vervolgens kunnen worden toegediend na allogene HSCT.
CMV infectie kan een belangrijk probleem na HSCT resulteert in zowel verhoogde morbiditeit en mortaliteit. Verder wordt CMV infectie geassocieerd met hogere kosten, ondanks de recente vooruitgang in vroege diagnose en behandeling met antivirale middelen 16. De huidige behandeling met ganciclovir en foscarnet kan leiden tot toxiciteit bij medisch-kwetsbare ontvangers van HSCT.De add-back van donor afgeleide CMV-specifieke T-cellen is aangetoond voor de preventie en behandeling van opportunistische infecties bij ontvangers van allogene HSCT 9. Deze benadering van adoptieve immunotherapie is ook toegepast om immuniteit tegen andere pathogenen, zoals Epstein-Barr virus (EBV), adenovirus 8 en Aspergillus 3 herstellen door incuberen mononucleaire cellen (MNC) van respectievelijke antigen verkregen klinische kwaliteit peptide cocktail reagentia ( Materialen en tafel apparatuur's). Onlangs hebben onderzoekers veilig toegediend pathogeen-specifieke derden T-cellen die zijn gekoppeld met ten minste een HLA-allel in de ontvanger presenteren van immunodominante peptide 17. De geautomatiseerde celverrijking CCS systeem kan ook worden gebruikt voor derden T cellen voor off-the-shelf toepassingen die nuttig zijn als de donor CMV-seronegatieve of niet beschikbaar is, zoals het geval is met donoren allogene navelstrengbloed Transplantatie genererenop.
Samengevat, tonen we het nut van een geautomatiseerde cel verrijking apparaat CMV-specifieke T-cellen op basis van automatisering van CCS genereren. Wij geloven dat dit apparaat heeft het potentieel om de drempel te verlagen voor verplegend pathogeen-specifieke aftrekken, en tumor-specifieke T-cellen immuniteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Beide MD Anderson Cancer Center en Dr Cooper een financieel belang in ZIOPHARM Oncology, Inc., en Intrexon Corporation. Op 7 mei 2015, Dr. Cooper werd benoemd tot Chief Executive Officer bij ZIOPHARM Oncology. Dr. Cooper is nu een Visiting Scientist bij MD Anderson. Dr. Cooper opgericht en bezit InCellerate, Inc. Hij heeft patenten met Sangamo BioSciences met kunstmatige nucleasen. Hij overlegt met Targazyme, Inc. (voorheen American Stamcellen, Inc.), GE Healthcare, Ferring Pharmaceuticals, Fate Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals en Bristol-Myers Squibb. Hij is op de Wetenschappelijke Adviesraad van Cellectis. Hij ontvangt honoraria van Miltenyi Biotec.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 ml Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/ml) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
- Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
- Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
- Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
- Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), Available from: http://www.cambridgeresearchcentre.co.uk/all-publications/blood-and-marrow-transplantation/ 55-59 (2014).
- Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
- Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
- Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
- Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
- Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
- Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
- Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
- Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
- Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
- Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).
