Abstract
病原体特异性T细胞的过继转移可用于预防和治疗机会性感染如巨细胞病毒(CMV)感染异基因造血干细胞移植后发生。从供者,包括第三方捐助者病毒特异性T细胞,可以传播体外 ,符合现行良好生产规范(cGMP),采用多轮抗原驱动的刺激有选择性地繁殖所需的T细胞。抗原特异性T细胞的鉴定和分离,也可基于T细胞的细胞因子的捕获系统,该系统已经被激活以分泌γ-干扰素(IFN-γ)进行。然而,广泛的人类应用的细胞因子捕获系统(CCS),以帮助恢复免疫的已受到了限制生产过程是耗时,并且需要熟练的操作人员。第二代细胞富集设备,如CliniMACS神童发展到现在使研究者以产生使用自动化,更少劳动密集的系统的病毒特异性T细胞。该装置中分离磁使用磁激活细胞分选技术,产生临床级产品未标记细胞标记的细胞,被设计为封闭系统,并且可以进行访问和操作上的台式。我们证明这个新的自动化细胞富集装置的操作来制造从CMV启动血清阳性供体获得一个稳态单采产物获得的CMV pp65抗原特异性T细胞。这些分离的T细胞可以被直接注入机构和联邦监管监督下的患者。所有的生物处理步骤包括去除红血细胞,T细胞,抗原特异性T细胞,纯化和洗涤分离的刺激完全自动化。设备,如这提高的可能性,T细胞对人类应用能奉献良好生产规范GMP外(制造)设施,而是在血库设施的工作人员可以监控自动化协议,以生产多种产品的生产。
Introduction
造血干细胞移植(HSCT)1可以与过继性T细胞治疗相结合,以提高移植物抗肿瘤效果,并提供免疫机会感染2。产生抗原特异性供体来源的T细胞输注历来所需的技能型人才和使用专门的设施,是按照GMP标准。这种T细胞的递送导致的机会性感染3的分辨率以及治疗潜在恶性肿瘤4。最近,研究人员已经证明,只有几千病毒特异性T细胞的过继转移(〜1×10 4 - 2.5×10 5细胞/千克接受者体重)可以成功地治疗同种异体HSCT后5-9机会性巨细胞病毒感染。数量有限的GMP设施,相关精湛的制造要求和电池生产相关的成本高了,但是,restricted患者获得希望的T细胞疗法10。的一种方法分离抗原特异性T细胞是基于使用一个双特异性试剂来识别CD45和IFN-γ在CCS。如图所示,这种方法可以用于产生临床级的CMV特异性T细胞采用一种自动化细胞富集的CCS装置( 图1B)。
通过将重叠肽从CMV病毒pp65抗原用感染CMV血清阳性供体白细胞分离总有核细胞(TNC)产生CMV特异性T细胞。这些肽在人类白细胞抗原(HLA)的环境中显示的,激活该TNC内CMV启动病毒pp65特异性T细胞分泌的IFN-γ。这些T细胞可以被“捕获”和磁性分离。第一代细胞富集装置(图1A)的操作所需的在细胞培养人员熟练GMP条件下,和协调工作人员承担的多个STEPS必须产生一个“俘获”的产品。
该过程通常需要10至12小时的连续运行,因此,人员可能需要工作在两班在GMP的设施。这些约束现在由第二代装置( 图 1B所示)的执行避免。该装置进行磁性富集,与第一代设备,但在自动化的漂白的方法的CCS的其他方面。这显著降低作为大多数步骤可以完成无人参与由工作人员在GMP的球队的负担。另外,由于装置作为一个封闭系统中,抗原特异性T细胞可以被捕获并在除参与白细胞分离的分离和制备的材料启动仪器之前的步骤台式处理。完整的仪器和第二代细胞富集设备的功能性的细节已经酒馆lished 11。
这里,我们描述的步骤,从使用自动细胞富集的CCS系统稳态单采产品丰富的CMV pp65抗原特异性T细胞。一旦分离,这些CMV特异性T细胞可以被立即注入到病人体内。
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Protocol
1.准备在无菌条件下材料(见材料和设备表)
- 准备3升的PBS / EDTA缓冲液补充有人血清白蛋白(HSA),以0.5%的终浓度(重量/体积)。
- 制备1升的临床级0.9%氯化钠(NaCl)中溶液袋和2升GMP级细胞培养基。
- 由重构CMV pp65抗原的一小瓶用8ml无菌水中制备60纳摩尔的CMV特异性抗原肽的鸡尾酒。
- 转移CMV病毒pp65肽混合物成使用鲁尔/穗互连50毫升的容量冷冻袋,并用钳钳锁,以避免后续的分配鸡尾酒到管道组。打开细胞富集管道组(TS 500)在无菌条件下。
- 使用无菌管道焊接,连接肽混合物冷冻袋成管路的阀门2 TS 500,不要在这个时候打开肽混合物袋夹管连接。
- 删除1×10 9吨数控从开始细胞产物和暂停在含有2.5%HSA至50毫升的总体积的PBS / EDTA缓冲液。细胞产品注入150ml的输液袋。
2.准备和使用自动化的细胞富集系统(见材料和设备表)
- 切换细胞富集系统 (图1B),选择节目“CCS_IFN-γ富集 ”。观察显示具有说明书和图片通过程序引导操作员屏幕的用户界面。
- 输入参数“ 操作员 ”和“ 管路P / N号 ”。接下来,安装管500设置到自动细胞富集设备按交互式监视器屏幕上显示的指令。
- 遵循由显示在屏幕上以连接介质和缓冲液至设备步骤的指令的步骤。记录产品编号和connectin前试剂的批号克至仪器。
- 管道组的最后检查后,打开肽混合物袋的夹子。打开介质包和发起管路装置的自动启动。
- 后引发步骤完成后,补充的HSA(2.5%)为NaCl缓冲液中贮存袋(200毫升)与无菌管道焊机的帮助。起始细胞产品转移到“应用程序包”使用无菌管道焊工。
- 通过适配器连接CCS(IFNγ)试剂进入各自的管道。输入首选时间浓缩过程之前收集细胞物质的一小部分。审查和核实所有数据的准确度/参数输入。开始处理。
- 自动细胞富集过程开始之前,除去质量控制袋(QCB,原始分数(ORI)约含1.3毫升出用PBS / EDTA缓冲液稀释百毫升室的内容)。密封的QCB,称重,并在4℃下保存。
- 启动enrichmeNT进程。在该过程结束时,靶细胞将被洗脱的洗脱缓冲液从贮存袋中的近似体积。
- 密封的非目标单元格袋(NTCB,负分数=负)和靶细胞袋(TCB,阳性率= POS)和权衡每个袋子。的权重将被用于以后的细胞数的计算。
- 立即富集过程后收集每级分两等份用于流式细胞分析,样品的其余部分存储在4℃。用细胞计数测定和富集性能分析(表1),另取试样一个样本等份。
- 拆下油管从细胞富集仪器设置。日志文件传送到USB驱动器以备将来使用。
注:所有的试剂应该在无菌条件下制备。使用生物安全II型吸油烟机的强烈建议。使用稳态单采蜂窝产品(非动员),从健康的隔离巨细胞病毒阳性捐助,充实巨细胞病毒抗原特异性T细胞。唯一获得FDA许可的HSA应该被使用。缓冲对细胞制剂应保持在19℃至25℃的较低或较高的环境温度会导致降低纯度和靶细胞的产率降低。
3.细胞计数的测定
- 取QCB,NTCB和TCB的用于细胞计数的等分试样如表 1所示。加入CD45-VoBlue至每个等分试样(效价1点11分)和孵化在黑暗中进行10分钟,在4℃。
- 加1.5毫升新制备的红细胞溶解溶液(1倍)的原始分数和阴性部分,450微升新鲜制备的红细胞溶解溶液的阳性分数,孵化的所有级分进行15分钟,在室温。
- 只是在分析之前,碘化丙锭添加于1μg/ ml的终浓度(1:100稀释的100微克/毫升)。使用自动细胞计数,以确定细胞计数和vi能力。用细胞计数设备推荐的软件进行流式细胞分析。确定白细胞绝对计数的原创,消极和积极的部分。
注:每毫升采取细胞计数分析样品的可行的白细胞的细胞数,使用的细胞分析软件建议确定的。 - 设置区域,如图2(区域5,可行的白细胞)。使用以下的门控策略,以确定细胞计数。在原级分A可行白细胞见图2。
- 所指示的区域(图2,1-6)是分层如下:
1:时间门→2:单细胞→3:CD45 +细胞 →4:白细胞(碎片除外)→5:活白细胞→6:活的淋巴细胞 - 重复相同的步骤,以确定细胞计数的消极和积极的部分。计算整个部分的细胞计数通过考虑在样品和分数(表2)的总体积的稀释剂因子。
4.考试的分离性能
- 预冷的PBS / EDTA缓冲液/ 0.5%AB血清洗QCB,NTCB和TCB级分的细胞的等分试样。离心细胞,在300×g离心5分钟,在4℃,吸出上清液。
- 悬浮细胞在含有100微升抗体 - 荧光染料染色混合物:CD3-FITC,CD4-APC,CD8-APC-Vio770,CD14-PerCP,CD20-PerCP,CD45-VioBlue和抗IFNγ-PE(滴度一时11)和孵育在黑暗中在4℃下10分钟。
- 加入1毫升新鲜制备的红细胞溶解溶液(1x)和孵育15分钟,在室温。离心机在300×g离心5分钟,在4℃,吸出上清液。重悬在PBS / EDTA缓冲/ 0.5%AB血清的货量充足的细胞。
- 加入碘化丙啶至1微克/毫升之前,为了分析(1最终浓度:100 diluti上的100微克/毫升)。进行流式细胞分析来评价样品的纯度。
- 使用以下的门控策略来计算的CD3 + T细胞在活白细胞门控策略用于确定CD3 + T细胞示出在CCS浓缩过程后阳性分数。所指示的区域( 图3A和3B,1-6)分层联如下:
1:时间门→2:单细胞→3:CD45 +细胞 →4:电池(碎片除外)→5:活白细胞→6:活CD3 +细胞群 - 确定CD4 +,CD8 +,CD4 + IFN-γ+和CD8 + IFN-γ+的CCS富集处理后的T细胞(表2)的频率。
- 使用门控策略来确定CD4 +,CD8 +,CD4 + IFN-γ+和CD8 + IFN-γ+ T细胞示出所有低于f的频率还是原始和丰富(捕获)阳性CCS处理后部分。所指示的区域被分层链接并命名如下:
1:时间门→2:单细胞→3:CD45 +细胞 →4:电池(碎片除外)→5:活白细胞→6:活CD3 +细胞→7:CD4 +细胞→7A:CD4 + IFN-γ+细胞(盒)→8:CD8 +细胞→8A:CD8 + IFN-γ+细胞(盒)
注:层级链接的前6所示区域是相同的。图3中,(1-6)和最后2个区域示于图4(6-8a)。
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Representative Results
在这项研究中,一个自动细胞富集的CCS系统被用于自动化生产的CMV pp65抗原特异性T细胞。 CMV特异性T细胞从三个血液分离细胞产物富集。稳态单采产品收获了2小时从CMV血清阳性供体和生成的10 10总有核细胞(TNC)。 10 9 TNC然后用CMV病毒pp65衍生肽(60纳摩尔)4小时,所述IFN-γ的分泌使用自动化细胞富集设备上的CCS的T细胞中分离激活。操作者需要在实验开始时以装载所有的试剂和管套。该系统从初始打开包装到启动设备的安装需要约60至120分钟。注意,设备可以编程以启动试剂和管套被加载从而使机器操作无人值守(如过夜)之后。操作者被再次需要15小时之后进行的表征最终产品为细胞纯度和生存能力。富集后的细胞上清液中筛选支原体和内毒素的存在。在验证后,处理的细胞可以直接输注到患者或冷冻保存的购买申请。
细胞计数测定下列细胞计数用表2中给出的配方标准做法。每种类型的细胞计数,重复三次,结果表示为平均总细胞计数与标准偏差(SD)。报告然后用细胞分析仪推荐的软件进行分析。选通,以确定可行的白细胞和淋巴细胞示于图2。用于细胞计数的数据在表3中给出。用于确定IFN-γ+ T细胞示出在图3和图4的门控策略。富集之前,细胞的存活力是常规> 95%。之后enrichmen吨,细胞的存活率为<50%。 IFN-γ+ T细胞的绝对计数之前和浓缩处理之后进行评估。 IFN-γ+ T细胞的富集前的总数为1.14×10 6±0.35×10 6如来自于10 9起始TNC,并且为3.09×10 5±1.70×10 5的IFN-γ+ T细胞富集。有0.16±0.18%的IFN-γ+前处理本CD4 + T细胞富集后增加至47.5±34.7%。 的 CD8 + IFN-γ+之前捕获的T细胞的纯度百分率是0.47±0.1%,和后富集增加至90.3±1.7%(表3 和4)。在所捕获的(正)馏分样品回收率为32.9±15.7%的CD4 + T细胞和CD8 + T细胞31.8±13.2%,基于IFN-γ+ T细胞中的站测量 rting人口( 表4)。这些数据表明,CD4 +和CD8 +的CMV pp65抗原特异性T细胞可以在适合其人类应用的方式自动收获。
图1.利用富集CCS系统的巨细胞病毒特异性T细胞。(一)参与了第一代细胞富集装置是通过熟练的专业人员来处理多个处理步骤。(二)大部分的处理步骤,除了最初的管道设置,是自动在这节省10第二代细胞富集装置 - 12小时的操作者处理的时间与第一代器件相比。富集的CMV病毒特异性T细胞的特征在于术细胞分析仪的流动。 >点击此处查看该图的放大版本。
图2.门控策略用于确定可行的T细胞。数字1至6表示在图中的相应门控层次结构域:(1)设置时间门;(2)通过绘制FSC-高度对FSC-区卸下双峰细胞(3)确定 CD45 +细胞 ,(4)消除细胞碎片(5)选择可行的白细胞和(6)从原来的人口碘化丙啶染色可行的淋巴细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图用于确定CD3 + T细胞 3.门控策略。流式细胞仪印迹分析 前(3A)和之后(图3B)细胞富集在此处显示的CD3 + T细胞。关键的是要确定有多少CMV特异性肽激活的T细胞存在于样品中的前和浓缩过程后。在该图中,数字1到6指示相应细胞群或者通过尺寸或通过特异性抗体染色。(1)设置时间门;(2)卸下双峰细胞,(3)选择的CD45 +细胞 ,(4)除去细胞碎片(5)选择可行的白细胞和(6)的可行的 CD3 +淋巴细胞。碘化丙啶染色,以去除死细胞。/52808fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图4.门控策略用于确定IFN-γ+ T细胞的纯度。活化CMV特异性T细胞是用于控制CMV感染关键的,所以IFN-γ+ 在T细胞上表达被用于门控。充实和(B)浓缩前后IFN-γ+ T细胞CD4 +和CD8 +亚群(A)之间。(7/8)CD4 + T细胞和CD8 + T细胞的百分比显示在A和B。(7A ) 的 CD4 + IFN-γ+ T细胞的百分比显示在方框(a)该浇口区域内,同样对于C D8 + IFN-γ+ T细胞中(图8a)。 “T”表示%的细胞在总人口和“#”的表示%的细胞在门控群体。碘化丙啶染色检测门出死细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。
表1.卷用于细胞染色战略的分数。
表2浓缩过程。计算的CD8 + IFN-γ+ T细胞后用于CD4 + IFN-γ+ T细胞的计算公式是类似地执行。
请点击这里查看此表的放大版本。
表3.细胞总数在之前和之后的富集。样品#1的结果显示在这里的T细胞亚群 。
表4纯度和IFN-γ+ T细胞之前和样品#1富集处理后的恢复。
表5.细胞分选在临床级的CMV抗原特异性T细胞的分离使用策略。5
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Discussion
继T细胞疗法已成为一个可行的办法来治疗B细胞恶性肿瘤4。其治疗潜力是依赖于注入缺乏复制衰老2靶抗原特异性T细胞的期望数量。这可以通过用当前的良好生产规范整理抗原特异性T细胞的纯人口从扩增的T细胞的合规性来实现。两个分拣程序被广泛应用,即,荧光激活细胞分选(FACS)和磁性活化细胞分选(MACS)来产生的CMV抗原特异性T细胞因为我们最近5审查。使用一个策略比其他的优点在表5中概述。MACS技术提供了最高的细胞富集纯度在一个更便宜和更快的方式相比FACS技术。在一次性柱和试剂,细胞富集的另外使用完全防止样品样品污染使它易于应用在临床环境。半自动细胞富集设备是劳动密集且耗时的,以便发展自动化细胞富集装置的必要进给临床需求。
自动化细胞富集的CCS设备是一个通用的仪器用于分离临床级细胞如造血干细胞,体干细胞,以及T细胞过继转移。这种自动化器件集成细胞处理,包括起始材料,洗涤细胞,细胞分离,细胞培养,和最终产品的形成在单次使用的符合GMP的一次性单元分馏。封闭的系统减少洁净室的要求和维护GMP设施最大限度地减少操作者的介入。自动化减少为存在从而减小与这些实验室程序相关的成本所需的操作员的时间。
为了验证自动细胞富集装置中,相比用半自动细胞富集设备,我们分离孵育CMV pp65抗原衍生的肽与分离性输血产品之后CMV特异性T细胞。 GMP级的CMV pp65抗原衍生肽的鸡尾酒(例如PepTivator)是主要由重叠的15聚体肽具有11个氨基酸,覆盖人巨细胞病毒的病毒pp65蛋白的完整序列的肽池。样品回收率为〜0.3×10 6的 CD3 + IFN-γ+ T从10 9 TNC细胞。临床研究表明,注入几千CMV特异性T细胞作为预防性治疗的患者(〜360至4000个细胞/ kg体重)进行造血干细胞移植造成防止CMV。例如,为了使用这种技术,70kg成年人和一个30千克子治疗CMV在临床试验中显然仅需要0.26 - 3.0×10 5和1×10 4 - 1.2×10 5个细胞 ,分别的,viral-特异性T细胞12月15日 等人 13。数字越大,活细胞也将是可接受的,因为这将有足够的材料不同输注相关联。然而,更多的活细胞,一般也意味着更多的细胞比T细胞(B,NK等)等。我们的数据表明,自动细胞富集系统上产生的CMV特异性T细胞导致CMV特异性T细胞的临床上有吸引力的号码可能然后同种异体HSCT之后要输注。
巨细胞病毒感染可能是一个主要问题HSCT导致既增加了发病率和死亡率后。此外,巨细胞病毒感染与成本增加关联,尽管早期诊断和早期治疗的最新进展与抗病毒的药物16。使用更昔洛韦和膦甲酸钠目前的治疗可导致中毒的造血干细胞移植医学上脆弱的收件人。在加回供体衍生的CMV特异性T细胞已被证明以预防和治疗中的同种异体HSCT 9的接受者的机会性感染。这种方法来继免疫疗法也被应用,以帮助通过将单核细胞(MNC)与相应的抗原衍生临床级的肽的鸡尾酒试剂还原免疫力对其他病原体,如Epstein-Barr病毒(EBV),腺病毒8, 和曲霉3( 材料和设备的表)。最近,研究人员已经安全地注入了与在受体呈递免疫显性肽17的至少一个HLA等位基因匹配第三方病原体特异性T细胞。自动化细胞富集的CCS系统还可以被用于产生第三方T细胞为现成的,货架应用时的供体是巨细胞病毒血清阴性或不可用的,例如与供体同种异体脐带血transplantati的情况下,这将是有用上。
综上所述,我们展示了一个自动化的细胞富集装置的工具来生成基于CCS的自动化巨细胞病毒特异性T细胞。我们相信,这装置具有降低的阈值临床团队注入病原体特异性,以及肿瘤特异性,T细胞在免疫受损的患者的潜力。
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Disclosures
这两个MD安德森癌症中心和Cooper博士拥有财务利益ZIOPHARM肿瘤,公司和Intrexon公司。 5月7日,2015年,Cooper博士被任命为ZIOPHARM肿瘤首席执行官。 Cooper博士现在是一个访问学者在MD安德森。 Cooper博士创立,拥有InCellerate,Inc.的他拥有的专利与Sangamo生物科学人工核酸酶。他担任过Targazyme公司(前身为美国干细胞公司),GE医疗集团,辉凌制药,命运治疗,扬森制药和百时美施贵宝。他是Cellectis公司的科学顾问委员会。他收到来自美天旎酬金。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
60 ml Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
Propidium Iodide Solution (100 µg/ml) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
Software V1.0.0.RC | |||
MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
Software 2.4 | |||
Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
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