Abstract
A transferência adoptiva de células T específica de agentes patogénicos podem ser utilizados para prevenir e tratar infecções oportunistas, tais como o citomegalovírus (CMV) que ocorrem após o transplante de células-tronco hematopoiéticas. Células virais T específicas de dadores alogénicos, incluindo os doadores de terceiros, podem ser propagadas ex vivo em conformidade com as boas práticas de fabrico corrente (cGMP), empregando ciclos repetidos de estímulo-driven antígeno para propagar selectivamente as células T desejados. A identificação e isolamento de células T específicas de antigénio pode também ser realizada com base no sistema de captura de citoquinas de células T que foram activadas para secretar gama-interferão (IFN-γ). No entanto, a aplicação humana generalizada do sistema de captura de citocinas (CCS) para ajudar a restaurar a imunidade tem sido limitado como o processo de produção é demorada e requer um operador qualificado. O desenvolvimento de um dispositivo de enriquecimento celular de segunda geração, como Prodigy CliniMACS agorapermite investigadores para gerar células T-virais específico usando um, menos sistema de trabalho intensivo automatizado. Este dispositivo separa magneticamente marcada células a partir de células não marcadas usando tecnologia de células activadas por triagem magnética para gerar produtos de grau clínico, foi concebido como um sistema fechado, e pode ser acedido e é operado na bancada. Nós demonstramos o funcionamento deste novo dispositivo de enriquecimento de células automatizado para a fabricação de células T específicas para CMV pp65 obtidos a partir de um produto de aférese steady-state obtidas a partir de um dador seropositivo a CMV. Estas células T isolados podem então ser directamente injectado a um doente sob a supervisão regulamentar e institucional federal. Todos os passos de processamento de bio incluindo a remoção de células vermelhas do sangue, a estimulação de células T, separação das células T específicas de antigénio, purificação e lavagem estão completamente automatizado. Dispositivos como este levantam a possibilidade de que as células T para aplicação em seres humanos pode ser produzido fora da boa prática de fabrico dedicada (GMP) Instalações e em vez disso ser produzido em instalações bancárias de sangue onde os funcionários podem supervisionam protocolos automatizados para produzir vários produtos.
Introduction
-Transplante de células estaminais hematopoiéticas (HSCT) 1 pode ser combinada com a terapia adoptiva de células T para melhorar o efeito do enxerto contra o tumor e para proporcionar imunidade a infecções oportunistas 2. Geração de células derivadas do doador T específicas de antigénio para perfusão tem historicamente exigido pessoal qualificado e uso de instalações especializadas que são GMP-compliant. A entrega dos referidos células T resultou na resolução de infecções oportunistas 3, bem como o tratamento da doença subjacente 4. Recentemente, os investigadores demonstraram que a transferência adoptiva de apenas alguns milhares de células T específicas do vírus (1 x 10 ~ 4 - 5 2,5 x 10 células / kg de peso corporal do receptor) podem tratar com sucesso infecções oportunistas CMV após transplante alogénico 5-9. Um número limitado de instalações GMP com requisitos de fabrico associados especializados e o custo elevado associado com a produção de células tem, no entanto, restro acesso dos doentes a terapias promissoras icted de células T 10. Uma abordagem para o isolamento de células T específicas de antigénio é calculada com base nos CAC usando um reagente bi-específico para reconhecer CD45 e IFN-γ. Como é mostrado, esta metodologia pode ser utilizada para gerar células T específicas para CMV grau clínico que empregam um dispositivo de enriquecimento de células CCS automatizado (Figura 1B).
Células específicas do CMV T são geradas por incubação de péptidos sobrepostos de antígeno pp65 do CMV com o total de células nucleares leucoferese (TNC) de doadores CMV-soropositivos. Estes péptidos, apresentados no contexto do antigénio dos leucócitos humanos (HLA), activar as células T específicas de pp65 de CMV dentro da TNC a secretar IFN-γ. Estas células T podem então ser "capturados" e separado magneticamente. O funcionamento do dispositivo de enriquecimento de células de primeira geração (Figura 1A), exigiam pessoal especializado em cultura de células em condições GMP, e coordenação de pessoal para realizar as múltiplas sTEPS necessário para gerar um produto "capturado".
O procedimento normalmente necessários de 10 a 12 horas de operação contínua, e, portanto, o pessoal provavelmente precisará trabalhar mais de dois turnos nas instalações GMP. Estas restrições são agora obviado pela aplicação de um dispositivo de segunda geração (mostrado na Figura 1B). Este dispositivo realiza enriquecimento magnético, semelhante ao primeiro dispositivo de geração, mas automatiza outros aspectos do CCS em uma abordagem unbreached. Isto reduz significativamente a carga sobre a equipe GMP como a maioria dos passos pode ser realizado por uma equipe autônoma. Além disso, uma vez que o dispositivo funciona como um sistema fechado, as células T específicas de antigénio pode ser capturado e processado na bancada excepto as etapas envolvidas no isolamento leucaferese e preparação dos materiais de partida antes de o instrumento. Detalhes da instrumentação completa e funcionalidade deste dispositivo enriquecimento celular de segunda geração foram pubcido 11.
Aqui, descrevemos os passos para enriquecer células específicas do CMV pp65 T a partir de um produto de aférese de estado estacionário com o sistema automatizado CCS enriquecimento celular. Uma vez isoladas, estas células T específicas de CMV pode ser imediatamente infundidas num paciente.
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Protocol
1. Preparação dos materiais em condições estéreis (Veja Materiais e Equipamentos Table)
- Prepare a 3 L de tampão de PBS / EDTA suplementado com albumina de soro humano (HSA) para uma concentração final de 0,5% (w / v).
- Prepare 1 litro de solução saco de qualidade clínica a 0,9% de cloreto de sódio (NaCl) e 2 L de GMP grau de meio de cultura celular.
- Preparar 60 nmol de CMV-específico antigénio peptídico cocktail por reconstituição de um frasco de CMV pp65 com 8 ml de água estéril.
- Transferir CMV pp65 peptídeo cocktail em um volume de 50 ml usando um saco de congelação Luer / Pico interligação e prenda com uma pinça de bloqueio para evitar a posterior distribuição de cocktail para o conjunto de tubos. Abra a pilha conjunto de tubos de enriquecimento (TS 500) em condições estéreis.
- Usando soldador tubulação estéril, ligue saco de congelação peptídeo cocktail na conexão do tubo de válvula 2 de conjunto de tubos TS 500. Não abra o peptídeo cocktail saco braçadeira neste momento.
- Remover 1 x 10 9 tNc do produto de partida e de suspensão celular em tampão / EDTA PBS contendo 2,5% de HSA para um volume total de 50 ml. Injectar o produto celular em um saco de transferência de 150 ml.
2. Preparação e Utilização do Sistema Automatizado celular Enrichment (Veja Materiais e Equipamentos Table)
- Ligue o sistema de enriquecimento de células (Figura 1B) e selecione o programa "CCS_IFN-γ Enrichment". Observar uma interface de usuário que mostra telas com instruções e imagens orientadores o operador através do procedimento.
- Digite o parâmetro "operador" e "Tubing Set P / N Não". Em seguida, instalar o dispositivo Tubing Set 500 para o enriquecimento de células automatizado, conforme as instruções exibidas na tela do monitor interativo.
- Siga o passo a passo exibidas na tela para ligar a médio e buffers para o dispositivo. Número da ficha de catálogo e número de lote dos reagentes antes connecting para o instrumento.
- Após a verificação final do conjunto de tubos, abra o grampo do saco peptídeo cocktail. Abra o saco de médio e iniciar priming automática do conjunto de tubos.
- Após o passo de iniciação está completo, complementar HSA (2,5%) em tampão de NaCl no saco de reservatório (200 ml) com a ajuda do soldador tubo estéril. Transferir o produto celular partida para o "saco de Aplicação" usando o soldador tubulação estéril.
- Conecte CCS (IFN-y) em reagentes respectiva tubagem através de adaptadores. Digite horário preferido para coletar uma fração do material celular antes processo de enriquecimento. Comente e verificar a exatidão de todos os dados / parâmetros inseridos. Iniciar o processo.
- Antes do início do processo de enriquecimento de células automatizado, retirar o saco de Controlo de Qualidade (BQC, fracção inicial (ori), contém cerca de 1,3 ml em 100 ml de conteúdo câmara diluída com tampão / EDTA PBS). Selar a BQC, pesar e armazenar a 4 ° C.
- Comece o enrichmeprocesso nt. No final do processo, as células alvo vai ser eluída com um volume aproximado de tampão de eluição a partir do saco de reservatório.
- Selar o não-alvo celular Bag (NTCB, fração negativo = neg) e Bolsa alvo celular (TCB, fração positiva = pos) e pesar cada saco. Os pesos serão usados mais tarde para o cálculo dos números de células.
- Imediatamente após o procedimento de enriquecimento recolher duas alíquotas por fracção para análise de citometria de fluxo, e armazenar o restante das amostras a 4 ° C. Utilize uma aliquota da amostra para determinação da contagem de células e a outra aliquota de amostra para a análise do desempenho de enriquecimento (quadro 1).
- Remover o conjunto de tubo do instrumento de enriquecimento de células. Transfira o arquivo de log para uma unidade USB para uso futuro.
NOTA: Todos os reagentes devem ser preparados em condições estéreis. O uso de uma capa Segurança Biológica tipo II é altamente recomendável. Use aférese produto celular em estado estacionário (não mobilizado) isolado a partir de uma saudávelCMV-dador seropositivo para enriquecer as células T específicas de antigénio CMV. Apenas licenciada pela FDA HSA deve ser usado. O tampão para a preparação de células deve ser mantida a 19 ° C a 25 ° C como temperaturas mais elevadas ou mais baixas irão resultar em ambientes reduzida pureza e um rendimento reduzido das células alvo.
3. celular Contagem Determinação
- Aqui as alíquotas de BQC, NTCB TCB e para as contagens de células, como mostrado na Tabela 1. Adicionar CD45-VoBlue para cada alíquota (título de 1,11) e incuba-se no escuro durante 10 min a 4 ° C.
- Adicionar 1,5 ml de solução de lise de glóbulos vermelhos recentemente preparada (1x) para a fracção original e fracção negativa, a 450 ul de solução preparada de fresco de lise de glóbulos vermelhos para a fracção positiva, todas as fracções e incubar durante 15 min à TA.
- Imediatamente antes da análise, adiciona-se iodeto de propídio para uma concentração final de 1 ug / ml (1: 100 de diluição de 100 ug / mL). Use contador de células automático para determinar a contagem de células e vihabilidade. Use software recomendado aparelho contador de células para citometria de fluxo análise. Determinar as contagens absolutas de leucócitos para as fracções originais, negativos e positivos.
NOTA: A contagem de células de leucócitos viáveis por ml das amostras colhidas para análise de contagem de células é determinado usando o software analisador de células recomendadas. - Definir a região como mostrado na Figura 2 (região 5, leucócitos viáveis). Utilize a seguinte estratégia gating para determinar a contagem de células. Uma fracção de leucócitos viável no original é mostrada na Figura 2.
- As regiões indicadas (Figura 2, 1-6), hierarquicamente são como se segue:
1: Tempo portão → 2: células individuais → 3: células CD45 + ^ 4: Os leucócitos (detritos excluído) → 5: leucócitos viáveis → 6: linfócitos viáveis - Repita os mesmos passos para determinar as contagens de células para as fracções positivas e negativas. Calcula-se a contagem de células de toda a fracçãoconsiderando o factor de diluente da amostra e o volume total da fracção (Tabela 2).
4. O exame do desempenho de separação
- Lavam-se as alíquotas de BQC, NTCB e células fracção TCB com tampão PBS / EDTA previamente arrefecido / 0,5% de soro AB. Centrifugar as células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e aspirar o sobrenadante.
- Ressuspender as células em 100 ul mistura de coloração anticorpo-fluorocromo contendo: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue e anti-IFN-y-PE (01:11) e título incubar no escuro durante 10 min a 4 ° C.
- Adicionar 1 ml de solução de lise de glóbulos vermelhos recentemente preparada (1x) e incubar durante 15 min à temperatura ambiente. Centrifuga-se a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e aspirar o sobrenadante. Ressuspender as células num volume adequado de PBS / EDTA Tampão / 0,5% de soro AB.
- Adicionou-se iodeto de propídio para uma concentração final de 1 ug / ml, imediatamente antes da análise (1: 100 dilutina de 100 ug / mL). Realizar análise de citometria de fluxo para avaliar a pureza da amostra.
- Utilize a seguinte estratégia gating para calcular as células T CD3 + em estratégia viável Supressão de leucócitos para a determinação das células T CD3 + é mostrada na fracção positiva após o processo de enriquecimento CCS. As regiões indicadas (Figura 3A e 3B, 1-6) estão hierarquicamente ligados como se segue:
As células CD45 + → 4:: 1: tempo portão → 2: Células individuais → 3 células (detritos excluídos) → 5: leucócitos viáveis → 6: As células viáveis CD3 + populacionais - Determinação das frequências de células CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + e CD8 + IFN-γ + células T após processo de enriquecimento de CCS (Tabela 2).
- Utilizar a estratégia de propagação para determinar as frequências de células CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + e CD8 + IFN-γ + células T mostrados abaixo fou um (capturado) fração positivo original e enriquecido após o processo de CCS. As regiões indicadas são hierarquicamente ligados e nomeados da seguinte forma:
As células CD45 + → 4:: 1: tempo portão → 2: Células individuais → 3 células (detritos excluídos) → 5: Os leucócitos viáveis → 6: As células viáveis CD3 + → 7: CD4 + células → 7a: CD4 + IFN-γ + células (box) → 8: CD8 + células → 8a: CD8 + IFN-gama + (box)
NOTA: Os primeiros 6 regiões indicadas de hierarquia as ligações são as mesmas que na Figura 3, (1-6) e 2 última regiões são mostradas na Figura 4 (6-8a).
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Representative Results
Neste estudo, um sistema de células automatizado enriquecimento CAC foi utilizado para a produção automatizada de células T específicas de pp65 de CMV. Células T específicas do CMV foram enriquecidas a partir de três produtos de células de aférese. O produto de aférese em estado estacionário foi colhida ao longo de 2 horas a partir de um doador CMV-soropositivos e gerou 10 10 células nucleares totais (CNC). 10 9 TNC foram então activadas com péptidos derivados de CMV pp65 (60 nmol) durante 4 h e o IFN-γ secretoras de células T foram isolados utilizando o CCS no dispositivo de enriquecimento de células automatizado. O operador era necessário no início da experiência para carregar todos os reagentes e os conjuntos de tubos. Configuração do sistema a partir da primeira abertura da embalagem para iniciar o dispositivo levou cerca de 60 a 120 min. Note-se, em seguida, a máquina pode ser programado para começar depois os reagentes e os conjuntos de tubos são carregados deste modo permitindo que a máquina a funcionar sem vigilância (tal como durante a noite). O operador foi necessário novamente após 15 horas para realizar a caracterização deos produtos finais de pureza e viabilidade celular. Após o enriquecimento do sobrenadante celular foi pesquisada quanto a micoplasma e presença de endotoxina. Após a validação, as células transformadas pode ser infundido diretamente em pacientes ou criopreservados para aplicações posteriores.
As contagens de células foram determinados após a contagem de células práticas convencionais, utilizando as fórmulas dadas na Tabela 2. Cada tipo de contagem das células foi repetida três vezes e os resultados foram expressos como contagens celulares totais médios com desvio padrão (SD). Relatórios foram então analisados usando o software recomendado analisador de células. Gating para determinar os leucócitos viáveis e linfócitos é mostrado na Figura 2. Os dados para as contagens de células são apresentados na Tabela 3. A estratégia gating utilizado para determinar células IFN-y + t é mostrada na Figura 3 e na Figura 4. Antes de enriquecimento, o viabilidade das células foi rotineiramente> 95%. Depois enrichment, a viabilidade das células era <50%. A contagem absoluta de IFN-γ + células T foi avaliada antes e após o processo de enriquecimento. O número total de IFN-y células + T antes do enriquecimento foi de 1,14 x 10 6 ± 0,35 x 10 6, como derivado a partir de 10 9 a partir TNC, e após enriquecimento foi 3,09 x 10 5 ± 1,70 x 10 5 células de IFN-y + T. Não foram 0,16 ± 0,18% de IFN-γ + células T CD4 + presentes antes do processamento e este aumentou para 47,5 ± 34,7%, após o enriquecimento. A percentagem de pureza de CD8 + IFN-γ + células T antes da captura foi de 0,47 ± 0,1%, e aumentou para 90,3 ± 1,7% após enriquecimento (quadro 3 e 4). A recuperação da amostra na fracção capturado (positivo) foi de 32,9 ± 15,7% para as células T CD4 + e 31,8 ± 13,2% para as células T CD8 + com base na medição das células de IFN-y + T na STA população rting (Tabela 4). Estes dados indicam que as células T específicas para pp65 tanto CD4 + e CD8 + CMV podem ser colhidas automaticamente de uma maneira adequada para a sua aplicação em seres humanos.
Figura 1. O enriquecimento de células T específicas de CMV-usando sistema CCS. (A) Os vários estágios de processamento envolvidas no dispositivo de enriquecimento de células de primeira geração são tratadas por profissionais especializados. (B) A maior parte dos passos de processamento, com excepção configuração inicial tubos, são automatizados no dispositivo de enriquecimento de células de segunda geração que economiza 10 - 12 horas de tempo de manipulação do operador em comparação com o primeiro dispositivo de geração. As células de CMV-específicos do vírus T enriquecidas são caracterizadas por citometria de fluxo da célula de analisador. > Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Gating estratégia usada para determinar as células T viáveis. Os números de 1 a 6 indicam a hierarquia de domínio gating correspondente na figura. (1) Criação de portal do tempo, (2) a remoção de células gibão traçando FSC-height contra-área FSC (3) Identificação de células CD45 +, (4) Remoção de detritos celulares (5) Seleção de leucócitos viáveis e (6) linfócitos viáveis de população original por coloração com iodeto de propídio. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3. Supressão estratégia utilizada para determinar as células T CD3 +. A citometria de fluxo de análise blot Células T CD3 + antes (3A) e após enriquecimento (3B) de células é mostrada aqui. É crucial para determinar quantas células activadas específicas de péptido-CMV T estão presentes nas amostras antes e após o processo de enriquecimento. Nesta figura, os números 1 a 6 indicam que a população de células correspondente, quer por tamanho ou manchada por um anticorpo específico. (1) Preparação de tempo portão, (2) a remoção de células dupleto, (3) selecção das células CD45 +, (4) A remoção de detritos celulares (5) Seleção de leucócitos e linfócitos viáveis (6) CD3 + viável. Coloração com iodeto de propídio foi efectuada para remover as células mortas."Target =" _ blank /52808fig3large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. gating estratégia utilizada para determinar a pureza de IFN-γ + células T. Específica células-T activadas CMV são críticos para a infecção por CMV controlando, assim IFN-γ + expressão em células T foram utilizados para propagação. IFN-gama + células T CD4 + e entre CD8 + (A) antes do enriquecimento e (B), após o enriquecimento. (7/8) Percentagem de células T CD4 + e células T CD8 + é mostrado em A e B (7a. ) Percentagem de células IFN-y + T CD4 + é mostrado na caixa quadrada (a) dentro da área de gating e similarmente para C D8 + IFN-γ + células T em (8a). "T" representa% de células na população total e "#" representa% de células na população fechado. Coloração com iodeto de propídio foi realizada para as células mortas porta-out. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Volumes das frações utilizados para a estratégia de coloração celular.
Tabela 2. fórmulas utilizadas para o cálculo de células T CD4 + IFN-γ + células T após o processo de enriquecimento. Cálculo de CD8 + IFN-γ + células T é realizada de forma semelhante.
Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
Tabela 3. contagens celulares totais em subconjuntos de células T, antes e após o enriquecimento. Amostra # 1 resultados são mostrados aqui.
Tabela 4. A pureza e recuperação de IFN-γ célula T + antes e depois do processo de enriquecimento da amostra # 1.
Tabela 5. triagem celular estratégias utilizadas no isolamento de células T específicas de antigénio CMV grau clínico. 5
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Discussion
Terapia adoptiva de células T tem emergido como uma opção viável para o tratamento de malignidades de células-B 4. O seu potencial terapêutico é dependente infundindo o número desejado de células T específicas para o antigénio alvo que carecem de senescência replicativa 2. Isto pode ser conseguido, classificando uma população pura de células T específicas de antigénios a partir de células T expandidas de acordo com as boas práticas de fabrico actuais. Dois procedimentos de triagem são amplamente utilizados, ou seja, de células activadas por fluorescência (FACS) e triagem de células activadas magnético (MACS) para gerar células T específicas de antigénio CMV que temos revisto recentemente 5. A vantagem de utilizar uma estratégia de sobre o outro é delineado na Tabela 5. MACS tecnologia oferece o maior pureza enriquecimento de células de uma forma mais barata e mais rápida em comparação com a tecnologia de FACS. No uso adição de colunas descartáveis e reagentes para o enriquecimento de células evita totalmente a contaminação da amostra amostra tornando-mais fácil de aplicar em ambientes clínicos. O dispositivo semi-automático de enriquecimento de células é trabalhoso e demorado assim o desenvolvimento do dispositivo de enriquecimento de células automatizado foi necessário para alimentar a demanda clínica.
O dispositivo de enriquecimento de células automatizado CCS é um instrumento versátil para o isolamento de células de qualidade clínica, tais como células estaminais hematopoiéticas, células estaminais somáticas, bem como células T para transferência adoptiva. Este dispositivo automatizado integra processamento de células, incluindo o fraccionamento do material de partida, de lavagem de células, separação de células, cultura de células, e a formação do produto final de uma unidade descartável GMP de uso único. O sistema fechado reduz os requisitos de sala limpa e minimiza o envolvimento do operador para a manutenção de instalações GMP. Automação reduz o tempo necessário para que um operador possa estar presente diminuindo desse modo o custo associado com estes procedimentos laboratoriais.
Para validar o dispositivo de enriquecimento de células automatizado, como comparadocom o dispositivo semi-automatizado de enriquecimento de células, foram isoladas células T específica do CMV após incubação péptidos derivados de CMV pp65-com um produto de aférese. GMP grau de cocktail de CMV pp65 derivado de péptido (por exemplo PepTivator) é um conjunto de peptídeos que consiste principalmente em 15-mer péptidos com 11 aminoácidos se sobrepõem, abrangendo a sequência completa da proteína pp65 do citomegalovírus humano. Amostra rendimento de recuperação foi ~ 0,3 x 10 6 CD3 + IFN-y + células T de 10 9 TNC. Estudos clínicos demonstraram que a infusão de alguns milhares de células T específicas para CMV como tratamento profilático para pacientes (~ 360 a 4.000 células / kg de peso corporal) submetidos a transplante resultou na protecção contra o CMV. Por exemplo, a fim de tratar de CMV em ensaios clínicos usando esta tecnologia, um adulto de 70 kg e uma criança com 30 kg aparentemente requer apenas 0,26 - 3,0 x 10 e 5 x 10 4 1 - 1,2 x 10 5 células, respectivamente, de viral- As células T específicas de 12-15 et ai. 13. Um aumento do número de células viáveis também seria aceitável, que estaria associado com material suficiente para diferentes infusões. No entanto, as células mais viável em geral também significa mais do que outras células T (B, NK, etc.) células. Os nossos dados demonstram que as células T específicas de CMV-geradas no sistema de enriquecimento de células automatizado resultou em número clinicamente atraentes de células T específica do CMV que podem então ser infundidos após transplante alogénico.
A infecção por CMV pode ser um grande problema após o transplante resultando tanto em aumento da morbidade e mortalidade. Além disso, a infecção por CMV está associada com aumento de custos, apesar dos recentes progressos no diagnóstico e tratamento precoce com drogas anti-virais 16. O tratamento atual usando ganciclovir e foscarnet pode levar a toxicidade em pacientes medicamente frágeis de transplante.O add-back de células específico de CMV-T derivadas do doador foi demonstrada para prevenir e tratar infecções oportunistas em receptores de transplante alogénico 9. Esta abordagem de imunoterapia adoptiva, também tem sido aplicada para ajudar a restaurar a imunidade a outros agentes patogénicos, tais como vírus de Epstein-Barr (EBV), adenovírus 8, e Aspergillus 3 através da incubação de células mononucleares (MNC) com respectivo antigénio derivado de grau clínico reagentes péptido cocktail ( Materiais e equipamentos de mesa). Recentemente, investigadores têm infundido com segurança as células T específica de agentes patogénicos de terceiros que são combinados com pelo menos um alelo de HLA no recipiente apresentar o péptido imunodominante 17. O sistema automatizado CAC enriquecimento de células também pode ser usado para gerar células T de terceiros para aplicações off-the-shelf que serão úteis quando o doador é CMV-seronegativos ou não disponível, tal como o caso com os doadores para alogénica cordão umbilical transplantati sangueligar.
Em resumo, que demonstram a utilidade de um dispositivo de enriquecimento de células automatizado para gerar células T específicas para CMV com base na automação de CCS. Acreditamos que este dispositivo tem o potencial para reduzir o limiar de equipas clínicos para infundir específica de agentes patogénicos, assim como, as células T específicas do tumor em pacientes imunocomprometidos.
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Disclosures
Ambos MD Anderson Cancer Center e Dr. Cooper tem um interesse financeiro em ZIOPHARM Oncology, Inc., e Intrexon Corporation. Em 7 de maio de 2015, Dr. Cooper foi apontado como o diretor executivo da ZIOPHARM Oncology. Dr. Cooper é agora um cientista visitante no MD Anderson. Dr. Cooper fundou e possui InCellerate, Inc. Ele tem patentes com Sangamo BioSciences com nucleases artificiais. Ele consulta com Targazyme, Inc. (As células-tronco anteriormente americanos, Inc.), GE Healthcare, Ferring Pharmaceuticals, o destino Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals, e Bristol-Myers Squibb. Ele é membro do Conselho Consultivo da Cellectis Scientific. Ele recebe honorários da Miltenyi Biotec.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 ml Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/ml) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
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