Abstract
La transferencia adoptiva de células T de patógenos específicos se puede utilizar para prevenir y tratar las infecciones oportunistas como citomegalovirus (CMV), la infección se producen después de un trasplante hematopoyético alogénico de células madre. Las células T-virales específicos de donantes alogénicos, incluidos los donantes de terceros, se pueden propagar ex vivo en el cumplimiento de las buenas prácticas de fabricación actuales (cGMP), que emplean a rondas repetidas de estimulación antígeno impulsado para propagar selectivamente las células T deseados. La identificación y aislamiento de células T específicas de antígeno también pueden llevarse a cabo basándose en el sistema de captura de citoquinas de las células T que han sido activadas para secretar interferón gamma (IFN-γ). Sin embargo, la aplicación humano generalizado del sistema de captura de citoquinas (CCS) para ayudar a restaurar la inmunidad ha sido limitado como el proceso de producción es mucho tiempo y requiere un operador experto. El desarrollo de un dispositivo de enriquecimiento celular de segunda generación, como CliniMACs Prodigy ahorapermite a los investigadores a generar células T-virales específicos utilizando un sistema automatizado menos, mano de obra intensiva. Este dispositivo separa magnéticamente etiquetados células a partir de células no marcadas que utilizan la tecnología de células activadas por la clasificación magnética para generar productos clínica de grado, se ha diseñado como un sistema cerrado y se puede acceder y operar en la mesa de trabajo. Se demuestra el funcionamiento de este nuevo dispositivo de enriquecimiento de células automatizado para la fabricación de células T-pp65 de CMV específica obtenidas a partir de un producto de aféresis de estado estacionario obtenida de un donante seropositivo CMV. Estas células T aisladas pueden ser infundidas directamente en un paciente bajo supervisión reglamentaria institucional y federal. Todos los pasos de procesamiento de bio incluyendo la eliminación de las células rojas de la sangre, la estimulación de las células T, la separación de las células T específicas de antígeno, purificación y lavado están completamente automatizados. Los dispositivos tales como esta plantean la posibilidad de que las células T para aplicación humana pueden ser fabricados fuera de las buenas prácticas de fabricación dedicada (GMP) Las instalaciones y en su lugar se produzcan en instalaciones bancarias de sangre donde el personal puede supervisar protocolos automatizados para producir varios productos.
Introduction
Trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) 1 se puede combinar con la terapia adoptiva de células T para mejorar el efecto injerto contra tumor y para proporcionar inmunidad frente a infecciones oportunistas 2. Generación de células T derivadas del donante de antígenos específicos para perfusión ha requerido históricamente personal calificado y uso de instalaciones especializadas que son GMP. La entrega de tales células T ha dado como resultado en la resolución de infecciones oportunistas 3, así como el tratamiento de la neoplasia maligna subyacente 4. Recientemente, los investigadores han demostrado que la transferencia adoptiva de tan sólo unos pocos miles de células T específicas del virus (~ 1 x 10 4 a 2,5 x 10 5 células / kg destinatario de peso corporal) puede tratar con éxito las infecciones por CMV oportunistas después de TCMH alogénico 5-9. Un número limitado de instalaciones GMP con los requisitos de fabricación expertos asociados y el alto costo asociado con la producción de células tiene, sin embargo, restracceso de los pacientes igido de terapias prometedoras de células T 10. Un enfoque para el aislamiento de células T específicas de antígeno se basa en los CCS utilizando un reactivo bi-específico para reconocer CD45 y IFN-γ. Como se muestra, esta metodología se puede utilizar para generar células T específicos de CMV clínico grado que emplean un dispositivo de CCS enriquecimiento de células automatizado (Figura 1B).
Las células T-CMV específicos se generan mediante la incubación de péptidos solapantes de antígeno pp65 de CMV con células leukapheresis totales nucleares (CNC) de donantes CMV-seropositivos. Estos péptidos, que se muestran en el contexto de antígeno leucocitario humano (HLA), activan las células T-pp65 de CMV específica dentro de la TNC para secretar IFN-γ. Estas células T pueden ser "capturados" y magnéticamente separados. El funcionamiento del dispositivo de enriquecimiento de células de primera generación (Figura 1A) requiere personal especializado en el cultivo de células bajo condiciones GMP, y la coordinación de personal para llevar a cabo las múltiples sPTE necesarias para generar un producto "capturado".
El procedimiento normalmente requiere de 10 a 12 horas de funcionamiento continuo, y por lo tanto el personal probablemente necesitan trabajar más de dos turnos en las instalaciones de GMP. Estas limitaciones están ahora obvian por la aplicación de un dispositivo de segunda generación (mostrado en la Figura 1B). Este dispositivo se compromete enriquecimiento magnética, similar al dispositivo de primera generación, pero automatiza otros aspectos de la CCS en un enfoque unbreached. Esto reduce significativamente la carga sobre el equipo de GMP ya que la mayoría de los pasos se puede lograr sin supervisión por parte del personal. Además, puesto que el dispositivo funciona como un sistema cerrado, las células T específicas de antígeno pueden ser capturadas y procesadas en la mesa de trabajo, excepto las etapas implicadas en el aislamiento leucoféresis y preparación de materiales antes de iniciar el instrumento. Los detalles de la instrumentación completa y la funcionalidad de este dispositivo de enriquecimiento celular de segunda generación han sido pubcido 11.
A continuación, describimos los pasos para enriquecer las células T-pp65 de CMV específica de un producto de aféresis en estado estacionario utilizando el sistema CCS enriquecimiento de células automatizado. Una vez aislado, estas células T específicos de CMV se pueden infundir inmediatamente en un paciente.
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Protocol
1. Preparación de los materiales bajo condiciones estériles (ver Materiales y Equipos Tabla)
- Preparar 3 L de tampón de PBS / EDTA suplementado con albúmina de suero humano (HSA) a una concentración final de 0,5% (w / v).
- Preparar 1 L bolsa de solución de cloruro sódico de grado clínico 0,9% (NaCl) y 2 L de medio de cultivo celular GMP grado.
- Preparar 60 nmol de CMV específica cóctel de antígeno peptídico mediante la reconstitución de un vial de CMV pp65 con 8 ml de agua estéril.
- Traslado pp65 de CMV cóctel de péptidos en una bolsa de congelación volumen de 50 ml usando un / a Spike interconector Luer y sujetar con pinzas de bloqueo para evitar la posterior distribución de cóctel en el conjunto de tubos. Célula abierta conjunto de tubos de enriquecimiento (TS 500) en condiciones estériles.
- El uso de soldador tubo estéril, conecte bolsa de congelación cóctel péptido en la conexión del tubo de la válvula 2 de conjunto de tubos TS 500. No abra la pinza bolsa de cóctel de péptidos en este momento.
- Eliminar 1 x 10 9 TNC del producto de partida celular y suspender en tampón PBS / EDTA que contiene 2,5% de HSA a un volumen total de 50 ml. Inyectar el producto celular en una bolsa de transferencia de 150 ml.
2. Preparación y Uso de Automated Cell Sistema de Enriquecimiento (Ver Materiales y Equipos Tabla)
- Encienda el sistema de enriquecimiento de células (Figura 1B) y seleccione el programa "CCS_IFN-γ enriquecimiento". Observar una interfaz de usuario que muestra pantallas con instrucciones y las imágenes que guían al operador a través del procedimiento.
- Introduzca el parámetro "Operador" y "Tubing Set P / N No". A continuación, instale el dispositivo Tubing Set 500 con el enriquecimiento de células automatizado según las instrucciones que aparecen en la pantalla del monitor interactivo.
- Siga las instrucciones paso a paso que aparecen en la pantalla para conectar el medio y tampones en el dispositivo. Número de catálogo de registros y número de lote de los reactivos antes connecting al instrumento.
- Después de la revisión final del conjunto de tubos, abra la abrazadera de la bolsa de cóctel de péptidos. Abra la bolsa de medio e iniciar el cebado automático del conjunto de tubos.
- Después de que se complete la etapa de imprimación, complementar HSA (2,5%) en tampón de NaCl en la bolsa de depósito (200 ml) con la ayuda de la soldadora tubo estéril. Transferir el producto celular de partida en la "bolsa de Aplicación" usando el soldador tubo estéril.
- Conecte CCS (IFN) los reactivos en un tubo respectivo a través de adaptadores. Introduzca el tiempo preferido para recoger una fracción de material celular antes del proceso de enriquecimiento. Revisar y verificar la veracidad de todos los datos / parámetros introducidos. Iniciar el proceso.
- Antes del inicio del proceso de enriquecimiento de células automatizado, quite el control de calidad Bolsa (QCB, fracción original (ori) contiene aproximadamente 1,3 ml de cada 100 ml de contenido cámara diluida con tampón / EDTA PBS). Sellar el Banco Central de Qatar, pesar, y se almacena a 4 ° C.
- Inicie el enrichmeproceso nt. Al final del proceso, las células diana se eluyeron con un volumen aproximado de tampón de elución de la bolsa de depósito.
- Selle la no Target Cell Bolsa (NTCB, fracción negativa = neg) y Bolsa de la célula diana (TCB, positivo fracción = pos) y pesar cada bolsa. Los pesos serán utilizados más tarde para el cálculo de los números de células.
- Inmediatamente después del procedimiento de enriquecimiento de recoger dos alícuotas por fracción para citometría de flujo análisis, y almacenar el resto de las muestras a 4 ° C. Utilice una alícuota de la muestra para la determinación del recuento de células y la otra alícuota de la muestra para el análisis de rendimiento de enriquecimiento (Tabla 1).
- Retire el tubo del equipo del instrumento de enriquecimiento celular. Transferir el archivo de registro en una unidad USB para su uso futuro.
NOTA: Todos los reactivos deben ser preparadas en condiciones estériles. Es muy recomendable el uso de una campana de bioseguridad de tipo II. Utilice producto celular aféresis de estado estacionario (no movilizaron) aislado a partir de una sanaCMV-seropositivos donantes para enriquecer las células T específicas de antígeno CMV. Sólo FDA licencia HSA se debe utilizar. El tampón para la preparación de células debe mantenerse a 19 ° C a 25 ° C como temperaturas ambiente bajas o más altas darán como resultado la pureza reducida y un rendimiento reducido de las células diana.
3. Cell Count Determinación
- Tome las alícuotas de QCB, NTCB y TCB para los recuentos de células como se muestra en la Tabla 1. Añadir CD45-VoBlue a cada alícuota (título 1:11) y se incuba en la oscuridad durante 10 min a 4 ° C.
- Añadir 1,5 ml de solución de lisis de glóbulos rojos recién preparado (1x) a la fracción original y la fracción negativa, 450 l recién preparada sangre roja solución de lisis de células a la fracción positiva, e incubar todas las fracciones durante 15 min a RT.
- Justo antes del análisis, añadir yoduro de propidio a una concentración final de 1 mg / ml (1: 100 dilución de 100 g / ml). Utilice contador celular automático para determinar el recuento de células y vihabilidad. Utilice dispositivo contador de células software recomendado para citometría de flujo análisis. Determinar los recuentos absolutos de leucocitos para las fracciones originales, negativos y positivos.
NOTA: El recuento de células de leucocitos viables por ml de las muestras tomadas para el análisis de recuento de células se determina utilizando el software recomendado analizador de células. - Establecer la región como se muestra en la figura 2 (región 5, los leucocitos viables). Utilice la siguiente estrategia de compuerta para determinar el recuento de células. A leucocitos viable en la fracción original se muestra en la Figura 2.
- Las regiones indicadas (Figura 2, 1-6) son jerárquicamente como sigue:
1: Tiempo de puerta → 2: las células individuales → 3: CD45 + células → 4: leucocitos (residuos no incluidos) → 5: leucocitos viables → 6: linfocitos viables - Repita los mismos pasos para determinar el recuento de células de fracciones positivas y negativas. Calcular el recuento de células de toda la fracciónteniendo en cuenta el factor de diluyente de la muestra y el volumen total de la fracción (Tabla 2).
4. Examen del Rendimiento Separación
- Lávese las alícuotas de QCB, NTCB y las células de la fracción TCB con pre-enfriado tampón PBS / EDTA / 0,5% de suero AB. Centrifugar las células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante.
- Resuspender las células en 100 l mezcla de tinción de anticuerpos fluorocromo que contiene: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue y anti-IFN-PE (título 1:11) y incubar en la oscuridad durante 10 min a 4 ° C.
- Añadir 1 ml de solución de lisis de glóbulos rojos recién preparado (1x) y se incuba durante 15 min a TA. Centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C y aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en un volumen adecuado de PBS / EDTA Buffer / 0,5% de suero AB.
- Añadir yoduro de propidio a una concentración final de 1 mg / ml Apenas antes del análisis (1: 100 dilutien de 100 g / ml). Realizar análisis de citometría de flujo para evaluar la pureza de la muestra.
- Utilice la siguiente estrategia gating para calcular las células T CD3 + en la estrategia de apertura de puerta de leucocitos viable para la determinación de las células T CD3 + se muestra en la fracción positiva después de proceso de enriquecimiento CCS. Las regiones indicadas (Figura 3A y 3B, 1-6) están vinculados jerárquicamente de la siguiente manera:
1: Tiempo de compuerta → 2: las células individuales → 3: CD45 + células → 4: Células (residuos no incluidos) → 5: leucocitos viables → 6: Las células viables CD3 + población - Determinar las frecuencias de CD4 +, CD8 +, CD4 + células T después de proceso de enriquecimiento CCS (Tabla 2) IFN-γ + y CD8 + IFN-γ +.
- Utilizar la estrategia gating para determinar las frecuencias de CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + y CD8 + células T IFN-γ + f se muestran a continuacióno un (capturado) fracción positiva original y enriquecido después del proceso de CCS. Las regiones indicadas son jerárquicamente vinculados y nombrados de la siguiente manera:
1: Tiempo de compuerta → 2: las células individuales → 3: CD45 + células → 4: Células (residuos no incluidos) → 5: Los leucocitos viables → 6: Las células viables CD3 + → 7: CD4 + células → 7a: CD4 + IFN-γ + células (caja) → 8: CD8 + células → 8a: células CD8 + IFN-gamma + (caja)
NOTA: Los primeros 6 regiones indicadas de los enlaces de jerarquía son los mismos que en la Figura 3, (1-6) y el último 2 regiones se muestran en la Figura 4 (6-8a).
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Representative Results
En este estudio, se utilizó una célula automatizado enriquecimiento Sistema CCS para la producción automatizada de las células T-pp65 de CMV específica. Las células T-CMV específicos fueron enriquecidos a partir de tres productos de células de aféresis. El producto de aféresis en estado estacionario se cosechó más de 2 horas de un donante CMV-seropositivos y generó 10 10 células nucleares totales (CNC). 10 9 TNC se activa entonces con péptidos derivados de pp65 de CMV (60 nmol) durante 4 hr y la células T secretoras se aislaron utilizando los CCS en el dispositivo de enriquecimiento de células automatizado IFN-γ. Un operador se necesitaba al comienzo del experimento para cargar todos los reactivos y juegos de tubos. Configuración del sistema desde la inicial desembalaje hasta el inicio del dispositivo tomó aproximadamente 60 a 120 min. Nota, la máquina puede entonces ser programado para comenzar después de que los reactivos y juegos de tubos se cargan con ello permitiendo a la máquina en funcionamiento sin vigilancia (tal como durante la noche). El operador se necesitaba de nuevo después de 15 horas para realizar la caracterización delos productos finales para la pureza y la viabilidad celular. Después de enriquecimiento el sobrenadante celular se proyectó para micoplasma y la presencia de endotoxinas. Después de la validación, las células transformadas se pueden infundir directamente a los pacientes o criopreservados para aplicaciones posteriores.
Los recuentos celulares se determinaron después de células contando las prácticas estándar utilizando las fórmulas dadas en la Tabla 2. Cada tipo de recuento de células se repitió tres veces y los resultados se expresaron como media total de células con desviación estándar (SD). Los informes se analizaron entonces usando analizador de células software recomendado. Apertura de puerta para determinar los leucocitos viables y linfocitos se muestra en la Figura 2. Los datos para los recuentos de células se presentan en la Tabla 3. La estrategia gating utilizado para determinar las células IFN-gamma + T se muestra en la Figura 3 y la Figura 4. Antes de enriquecimiento, la viabilidad de las células era rutinariamente> 95%. Después enrichment, la viabilidad de las células era <50%. El recuento absoluto de células T IFN-γ + se evaluó antes y después del proceso de enriquecimiento. El número total de IFN-gamma + células T antes del enriquecimiento era 1,14 x 10 6 ± 0,35 x 10 6 como se deriva de 10 9 de partida TNC, y después de enriquecimiento era 3,09 x 10 5 ± 1,70 x 10 5 células IFN-gamma + T. Había 0,16 ± 0,18% de células T CD4 + presentes antes de la elaboración IFN-γ + y esto aumentó a 47,5 ± 34,7% después de enriquecimiento. El porcentaje de pureza de las células T CD8 + antes de la captura IFN-γ + fue de 0,47 ± 0,1%, y aumentó a 90,3 ± 1,7% después del enriquecimiento (Tabla 3 y 4). Recuperación de la muestra en la fracción capturado (positivo) fue de 32,9 ± 15,7% para las células T CD4 + y 31,8 ± 13,2% para las células T CD8 + basado en la medición de las células IFN-gamma + T en el sta rting población (Tabla 4). Estos datos indican que las células T-pp65 específica tanto CD4 + y CD8 + CMV pueden ser cosechadas de forma automática de una manera adecuada para su aplicación en seres humanos.
Figura 1. El enriquecimiento de células T CMV específicos que utilizan el sistema CCS. (A) los pasos de procesamiento múltiples involucrados en el dispositivo de enriquecimiento de células de primera generación son manejados por profesionales cualificados. (B) La mayoría de los pasos del proceso, salvo la configuración inicial de tubos, están automatizadas en el dispositivo de enriquecimiento celular de segunda generación que ahorra 10 - 12 horas de tiempo de manipulación del operador en comparación con el dispositivo de primera generación. Las células T-CMV específicos del virus enriquecidas se caracterizan por la citometría de flujo analizador de células. > Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Estrategia Gating utiliza para determinar las células T viables. Los números del 1 al 6 indican el dominio jerarquía compuerta correspondiente en la figura. (1) La creación de puerta del tiempo, (2) Extracción de células doblete por el trazado de FSC-altura contra FSC-zona (3) La identificación de las células CD45 +, (4) Eliminación de restos celulares (5) Selección de leucocitos viables y (6) linfocitos viables de población original por tinción con yoduro de propidio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. estrategia de apertura de puerta se usa para determinar las células T CD3 +. Citometría de flujo blot análisis de Las células T CD3 + antes (3A) y después del enriquecimiento (3B) de células se muestra aquí. Es crucial para determinar cuántos péptido activado células T específicos de CMV están presentes en las muestras antes y después del proceso de enriquecimiento. En esta figura, los números de 1 a 6 indican la población de células correspondiente, ya sea por tamaño o manchada por un anticuerpo específico. (1) Configuración de la puerta del tiempo, (2) Extracción de células doblete, (3) Selección de células CD45 +, (4) Extracción de residuos celulares (5) Selección de leucocitos viables y (6) CD3 + linfocitos Viable. Yoduro de propidio tinción se realizó para eliminar las células muertas./52808fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Supresión estrategia utilizada para determinar la pureza de las células T IFN-γ +. Células T específicos de CMV activados son críticos para el control de la infección por CMV, por lo IFN-γ + la expresión en las células T se utilizaron para gating. IFN-gamma + células T entre CD4 + y CD8 + subconjuntos (A) antes de enriquecimiento y (B) después del enriquecimiento. (7.8) Porcentaje de células T CD4 + y células T CD8 + se muestra en A y B (7a. ) Porcentaje de IFN-gamma + T CD4 + se muestra en el cuadro cuadrado (a) dentro del área de compuerta y de manera similar para C Células T en (8a) D8 + IFN-γ +. "T" representa% de las células en la población total y "#" representa% de las células en la población cerrada. Tinción con yoduro de propidio se realizó para las células muertas de la puerta de salida. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1. Los volúmenes de las fracciones utilizadas para la estrategia de la tinción celular.
Tabla 2. Las fórmulas utilizadas para el cálculo de las células CD4 + células T IFN-γ + después del proceso de enriquecimiento. Cálculo de CD8 + células T IFN-γ + se lleva a cabo de manera similar.
Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
Tabla 3. Total de los recuentos de células en subconjuntos de células T antes y después del enriquecimiento. Muestra # 1 se muestran los resultados aquí.
Tabla 4. La pureza y la recuperación de IFN-γ + T de células antes y después del proceso de enriquecimiento de la muestra # 1.
Tabla 5. clasificación de células estrategias utilizadas en el aislamiento de células T específicas de antígeno CMV grado clínico. 5
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Discussion
Terapia adoptiva de células T ha surgido como una opción viable para el tratamiento de neoplasias malignas de células B 4. Su potencial terapéutico depende de la infusión el número deseado de células T específicas de antígeno diana que carecen de la senescencia replicativa 2. Esto se puede lograr mediante la clasificación de una población pura de células T específicas de antígeno de las células T expandidas de acuerdo con buenas prácticas de fabricación actuales. Dos procedimientos de clasificación se utilizan ampliamente, a saber, células activadas por fluorescencia (FACS) y de células activadas magnética de clasificación (MACS) para generar células T específicas de antígeno CMV como hemos revisado recientemente 5. La ventaja de usar una estrategia sobre el otro se describe en la Tabla 5. Tecnología MACS ofrece la pureza más alta de enriquecimiento celular en una manera más barata y más rápida en comparación con la tecnología FACS. En el uso adición de columnas desechables y reactivos para el enriquecimiento de células impide totalmente la muestra a la contaminación de la muestra por lo que esmás fácil de aplicar en entornos clínicos. El dispositivo de enriquecimiento de células semi-automatizado es una labor intensiva y requiere mucho tiempo lo que el desarrollo del dispositivo de enriquecimiento de células automatizado era necesario para alimentar la demanda clínica.
El dispositivo de enriquecimiento de células automatizado CCS es un instrumento versátil para el aislamiento de las células de grado clínico tales como las células madre hematopoyéticas, células madre somáticas, así como las células T para la transferencia adoptiva. Este dispositivo automatizado integra procesamiento de células, incluyendo el fraccionamiento del material de partida, el lavado de células, separación de células, cultivo celular, y la formación del producto final en un solo uso unidad desechable GMP. El sistema cerrado reduce los requisitos de limpieza de habitaciones y minimiza la participación del operador para el mantenimiento de las instalaciones de GMP. La automatización reduce el tiempo requerido para que un operador estar presente disminuyendo de ese modo el coste asociado con estos procedimientos de laboratorio.
Para validar el dispositivo de enriquecimiento de células automatizado, en comparacióncon el dispositivo de enriquecimiento de células semi-automatizado, aislamos células T específicos de CMV después de la incubación de péptidos derivados de pp65 de CMV con un producto de aféresis. GMP grado CMV pp65 cóctel péptido derivado (por ejemplo PepTivator) es un conjunto de péptidos que se compone principalmente de 15 mer-péptidos con 11 aminoácidos se superponen, que cubre la secuencia completa de la proteína pp65 de citomegalovirus humano. Muestra de rendimiento de recuperación fue ~ 0.3 x 10 6 células CD3 + IFN-gamma células T + de 10 9 TNC. Los estudios clínicos han demostrado que la infusión de unos pocos miles de células T-CMV específicos como tratamiento profiláctico para pacientes (~ 360 a 4000 células / kg de peso corporal) sometidos a TCMH dio lugar a la protección contra el CMV. Por ejemplo, con el fin de tratar el CMV en los ensayos clínicos utilizando esta tecnología, un adulto de 70 kg y un 30 kg niño al parecer sólo requieren 0.26 - 3,0 x 10 5 y 1 x 10 4 - 1,2 x 10 5 células, respectivamente, de viral- células T específicas 12-15 et al. 13. Un mayor número de células viables también sería aceptable ya que esto estaría asociada con suficiente material para diferentes infusiones. Sin embargo, las células más viables en general también significa más células distintas de las células T (B, NK, etc). Nuestros datos demuestran que las células T-CMV específicos generados en el sistema de enriquecimiento de células automatizado resultó en números clínicamente atractivos de células T específicos de CMV que pueden luego ser infundidos después de HSCT alogénico.
La infección por CMV puede ser un problema importante después de TPH que resulta tanto en aumento de la morbilidad y la mortalidad. Además, la infección por CMV se asocia con aumento de los costos, a pesar de los recientes avances en el diagnóstico precoz y el tratamiento temprano con medicamentos antivirales 16. El tratamiento actual con ganciclovir y foscarnet puede conducir a la toxicidad en los receptores médicamente frágiles de TPH.El add-back de las células T-CMV específicas derivadas del donante se ha demostrado para prevenir y tratar las infecciones oportunistas en receptores de TCMH alogénico 9. Este enfoque de la inmunoterapia adoptiva también se ha aplicado para ayudar a restaurar la inmunidad a otros patógenos, tales como virus de Epstein-Barr virus (EBV), adenovirus 8, y Aspergillus 3 mediante la incubación de células mononucleares (MNC) con grado clínico reactivos de cóctel péptido antígeno respectivo derivados ( Los materiales y la mesa del equipo). Recientemente, los investigadores han infundido con seguridad células T de patógenos específicos de terceros que se corresponden con al menos un alelo HLA en el receptor la presentación de péptido inmunodominante 17. El sistema CCS enriquecimiento de células automatizado también puede ser utilizado para generar células T de terceros para aplicaciones off-the-shelf que serán de utilidad cuando el donante es CMV-seronegativos o no disponibles, como por ejemplo el caso de donantes para trasplante alogénico cordón umbilical transplantati sangreen.
En resumen, se demuestra la utilidad de un dispositivo de enriquecimiento de células automatizado para generar células T-CMV específicos basados en la automatización de la CAC. Creemos que este dispositivo tiene el potencial de reducir el umbral para los equipos clínicos para infundir de patógenos específicos, así como específicos de tumores, las células T en pacientes inmunocomprometidos.
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Disclosures
Tanto MD Anderson Cancer Center y el Dr. Cooper tienen un interés financiero en ZIOPHARM Oncología, Inc., y Intrexon Corporation. El 7 de mayo de 2015, el Dr. Cooper fue nombrado Consejero Delegado en ZIOPHARM Oncología. Dr. Cooper es ahora un científico visitante en el MD Anderson. Dr. Cooper fundó y es propietaria InCellerate, Inc. tiene patentes con Sangamo BioSciences con nucleasas artificiales. Él consulta con Targazyme, Inc. (células madre antes americanas, Inc.), GE Healthcare, Ferring Pharmaceuticals, Fate Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals, y Bristol-Myers Squibb. Él está en el Consejo Científico Asesor de Cellectis. Él recibe honorarios de Miltenyi Biotec.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 ml Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/ml) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
- Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
- Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
- Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
- Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), Available from: http://www.cambridgeresearchcentre.co.uk/all-publications/blood-and-marrow-transplantation/ 55-59 (2014).
- Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
- Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
- Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
- Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
- Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
- Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
- Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
- Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
- Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
- Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).
