Abstract
Il trasferimento adottivo di cellule T specifiche per patogeno può essere usato per prevenire e curare le infezioni opportunistiche come il citomegalovirus (CMV) che si verificano dopo il trapianto allogenico di cellule staminali. Cellule T specifiche virali-da donatori allogenici, compresi donatori di terze parti, possono essere propagati ex vivo in conformità con le attuali buone prassi di fabbricazione (cGMP), impiegando ripetuti cicli di stimolazione antigenica-driven per propagare selettivamente le cellule T desiderate. L'identificazione e l'isolamento di cellule T antigene-specifiche possono essere effettuati anche in base al sistema di acquisizione di citochine di cellule T che sono state attivate a secernere gamma-interferone (IFN-γ). Tuttavia, diffusa applicazione umana del sistema di cattura di citochine (CCS) contribuire a ripristinare l'immunità è stata limitata come il processo di produzione richiede tempo e richiede un operatore esperto. Lo sviluppo di un dispositivo di arricchimento cellulare di seconda generazione come CliniMACS Prodigy oraconsente agli investigatori di generare cellule T specifiche virali-con un sistema ad alta intensità di manodopera automatizzato, meno. Questo dispositivo separa magneticamente etichettati cellule dalle cellule senza etichetta utilizzando la tecnologia magnetica ordinamento delle cellule attivate per generare prodotti ad uso clinico, è stato progettato come un sistema chiuso e si può accedere e gestito sul banco. Abbiamo dimostrato il funzionamento di questo nuovo dispositivo arricchimento delle cellule automatizzato per la fabbricazione di cellule T specifiche per CMV pp65 ottenute da un prodotto aferesi stato stazionario ottenuto da un donatore sieropositivo CMV. Queste cellule T isolate possono essere infuse direttamente in un paziente sotto la supervisione regolamentare istituzionale e federale. Tutte le fasi bio-trattamento compresi rimozione dei globuli rossi, la stimolazione di cellule T, la separazione delle cellule T antigene-specifiche, purificazione e lavaggio sono completamente automatizzati. Dispositivi come questo sollevano la possibilità che le cellule T per applicazioni sull'uomo possono essere realizzati al di fuori di buone pratiche di fabbricazione dedicato (GMP) Strutture e invece essere prodotti in sangue servizi bancari in cui il personale può supervisionare protocolli automatizzati per la produzione di più prodotti.
Introduction
Il trapianto di cellule emopoietiche staminali (HSCT) 1 può essere combinato con la terapia delle cellule T adottiva per migliorare effetto graft-versus-tumorale e per fornire l'immunità alle infezioni opportunistiche 2. Generazione di linfociti T del donatore-derivato antigene-specifiche per infusione è storicamente richiesto personale specializzato e l'uso di strutture specializzate che sono GMP. La consegna di tali cellule T ha portato alla risoluzione di infezioni opportunistiche 3 e trattare il tumore di base 4. Recentemente, i ricercatori hanno dimostrato che il trasferimento adottivo di solo poche migliaia di cellule T virus-specifici (~ 1 x 10 4-2,5 x 10 5 cellule / kg di peso corporeo destinatario) in grado di trattare con successo le infezioni opportunistiche da CMV dopo HSCT allogenico 5-9. Un numero limitato di strutture GMP con relative esigenze produttive qualificati e gli alti costi associati con la produzione delle cellule ha, tuttavia, Restrl'accesso dei pazienti alle itto promettenti terapie delle cellule T 10. Un approccio per isolare le cellule T antigene-specifiche è basata su CCS utilizzando un reagente specifico bi-riconoscere CD45 e IFN-γ. Come mostrato, questa metodologia può essere utilizzato per generare uso clinico cellule T specifiche per CMV impiegano un dispositivo di arricchimento delle cellule automatizzato CCS (Figura 1B).
Cellule T specifiche per CMV sono generate incubando peptidi sovrapposti da pp65 CMV con le cellule leucoaferesi totale nucleari (TNC) da donatori CMV positivi. Questi peptidi, visualizzate nel contesto di leucociti antigene umano (HLA), attivare le cellule T specifiche CMV-PP65 nel TNC a secernere IFN-γ. Queste cellule T possono essere "catturati" e magneticamente separati. Il funzionamento del dispositivo di arricchimento delle cellule prima generazione (Figura 1A) richiesto personale specializzato in coltura in condizioni di GMP e coordinamento del personale di intraprendere le molteplici sTeps necessario generare un prodotto "catturato".
La procedura di richiesta tipicamente 10-12 ore di funzionamento continuo, e quindi il personale probabilmente bisogno di lavorare su due turni nella struttura GMP. Questi vincoli sono ora ovviato con l'attuazione di un dispositivo di seconda generazione (Figura 1B). Questo dispositivo si impegna arricchimento magnetico, simile al dispositivo di prima generazione, ma automatizza altri aspetti delle CCS in un approccio unbreached. Questo riduce notevolmente l'onere per la squadra GMP come la maggior parte delle fasi può essere realizzato senza sorveglianza da parte del personale. Inoltre, poiché il dispositivo opera come un sistema chiuso, le cellule T antigene-specifiche possono essere acquisiti e processati sul banco tranne le fasi isolatamente leucaferesi e preparazione dei materiali prima di avviare lo strumento. Dettagli della strumentazione completa e la funzionalità del dispositivo di arricchimento cellulare di seconda generazione sono stati pubtuito 11.
Qui, descriviamo la procedura per arricchire le cellule T specifiche per PP65 CMV da un prodotto aferesi steady-state utilizzando il sistema automatizzato CCS arricchimento delle cellule. Una volta isolato, queste cellule T specifiche per CMV possono essere immediatamente infuso in un paziente.
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Protocol
1. Preparazione dei materiali in condizioni sterili (vedi Materiali e attrezzature Table)
- Preparare 3 L di tampone PBS / EDTA supplementato con albumina sierica umana (HSA) a una concentrazione finale di 0,5% (w / v).
- Preparare 1 L sacchetto di soluzione clinica grade 0,9% di cloruro di sodio (NaCl) e 2 L di grado GMP terreno di coltura cellulare.
- Preparare 60 nmol di specifici antigeni CMV peptide cocktail ricostituendo un flaconcino di CMV pp65 con 8 ml di acqua sterile.
- Trasferire CMV pp65 peptide cocktail in un sacchetto di congelamento di 50 volumi ml utilizzando un Luer / Spike interconnessione e pinza con bloccaggio pinze per evitare la successiva distribuzione del cocktail nel set di tubi. Aperto cella set di tubi di arricchimento (TS 500) in condizioni di sterilità.
- Utilizzando sterili tubi saldatore, collegare borsa congelamento peptide cocktail in collegamento tubo per valvola 2 del set di tubi TS 500. Non aprire il morsetto per sacco peptide cocktail in questo momento.
- Rimuovere 1 x 10 9 TNC avvio prodotto cellulare e sospendere in tampone PBS / EDTA contenente 2,5% HSA ad un volume totale di 50 ml. Iniettare il prodotto cellulare in una sacca di trasferimento 150 ml.
2. Preparazione e utilizzo delle cellule automatizzato di arricchimento del sistema (vedi Materiali e attrezzature Table)
- Accendere il sistema di arricchimento di cellule (Figura 1B) e selezionare il programma "CCS_IFN-γ arricchimento". Osservare una interfaccia utente che mostra schermi con le istruzioni e le immagini che guidano l'operatore attraverso la procedura.
- Inserire il parametro "Operatore" e "Set di tubi P / N No". Successivamente, installare il Set di tubi da 500 ad un arricchimento delle cellule automatizzato dispositivo secondo le istruzioni visualizzate sullo schermo del monitor interattivo.
- Seguire le istruzioni passo passo visualizzate sullo schermo per collegare il medio e buffer per il dispositivo. Record numero di catalogo e il numero di lotto dei reagenti prima connecting allo strumento.
- Dopo il controllo finale del set di tubi, aprire il morsetto della borsa peptide cocktail. Aprire la busta medio e avviare innesco automatico del set di tubi.
- Dopo la fase di caricamento è completato, integrare HSA (2,5%) in tampone NaCl nel sacchetto serbatoio (200 ml) con l'aiuto del tubo saldatore sterile. Trasferire il prodotto di partenza cellulare nella "borsa Applicazione" utilizzando il tubo saldatore sterile.
- Collegare CCS (IFNγ) reagenti in rispettivo tubo tramite adattatori. Inserisci orario preferito per raccogliere una frazione del materiale cellulare prima di processo di arricchimento. Review e verificare l'esattezza di tutti i dati / parametri inseriti. Avviare il processo.
- Prima dell'inizio del processo di arricchimento delle cellule automatizzato, rimuovere il sacchetto di Controllo Qualità (QCB, frazione originale (ori) contiene circa 1,3 ml su 100 ml di contenuto camera diluito con tampone PBS / EDTA). Sigillare il QCB, pesare, e conservare a 4 ° C.
- Avviare il enrichmeprocesso nt. Alla fine del processo, cellule bersaglio vengono eluite con un volume di circa tampone di eluizione dal sacchetto serbatoio.
- Sigillare il cellulare Sacchetto non Target (NTCB, frazione negativo = neg) e Cell obiettivo Bag (TCB, frazione positiva = pos) e pesare ogni sacchetto. I pesi saranno utilizzati successivamente per il calcolo del numero di cellule.
- Immediatamente dopo la procedura di arricchimento raccogliere due aliquote per frazione per citometria a flusso, e memorizzare il resto dei campioni a 4 ° C. Utilizzare un'aliquota campione per la determinazione numero di celle e l'altra un'aliquota del campione per l'analisi delle prestazioni arricchimento (Tabella 1).
- Rimuovere il set di tubi dallo strumento di arricchimento delle cellule. Trasferire il file di log di un drive USB per un utilizzo futuro.
NOTA: Tutti i reagenti devono essere preparati in condizioni sterili. Si consiglia vivamente l'uso di un biosicurezza tipo II cofano. Utilizzare aferesi prodotto cellulare di stato stazionario (non mobilitati) isolato da un sanoCMV-sieropositivi donatore per arricchire specifiche cellule T antigene CMV. Solo la FDA licenza HSA deve essere utilizzato. Il buffer per la preparazione delle cellule deve essere conservato a 19 ° C a +25 ° C, temperature ambiente inferiori o superiori si tradurrà in purezza ridotta e una resa ridotta delle cellule bersaglio.
3. Determinazione delle cellule Conte
- Prendete le aliquote di QCB, NTCB e TCB per la conta delle cellule, come indicato nella tabella 1. Aggiungere CD45-VoBlue a ciascuna aliquota (titolo 1,11) e incubare al buio per 10 minuti a 4 ° C.
- Aggiungere 1,5 ml di soluzione di lisi dei globuli rossi preparata di fresco (1x) alla frazione originale e la frazione negativo, 450 microlitri soluzione appena preparata di lisi dei globuli rossi alla frazione positiva, e incubare tutte le frazioni per 15 minuti a RT.
- Appena prima dell'analisi, aggiungere ioduro di propidio ad una concentrazione finale di 1 mg / ml (1: 100 di 100 mg di diluizione / ml). Utilizzare contatore di cellule automatico per determinare conteggio e vi cellacapacità. Utilizzare dispositivo contatore di cellule software consigliato per analisi di citometria a flusso. Determinare i conteggi assoluti di leucociti per frazioni originali, negativi e positivi.
NOTA: Il numero di celle di leucociti vitali per ml dei campioni prelevati per l'analisi conta delle cellule è determinata con il software analizzatore di cellule consigliato. - Impostare la regione come mostrato nella Figura 2 (regione 5, leucociti vitali). Utilizzare la seguente strategia di gating per determinare il conteggio delle cellule. Un leucociti vitali in frazione originale è mostrato in Figura 2.
- Le regioni indicate (Figura 2, 1-6) sono gerarchicamente come segue:
1: Il tempo porta → 2: Singole cellule → 3: CD45 + cellule → 4: leucociti (detriti esclusa) → 5: leucociti vitali → 6: linfociti vitali - Ripetere gli stessi passaggi per determinare il conteggio delle cellule per le frazioni negativi e positivi. Calcolare il numero di cellule di tutta la frazioneconsiderando il fattore di diluente del campione e del volume totale della frazione (Tabella 2).
4. Esame della Performance separazione
- Lavare le aliquote di QCB, NTCB e cellule frazione TCB con pre-refrigerati tampone PBS / EDTA / siero AB 0,5%. Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e aspirare il surnatante.
- Risospendere le cellule in miscela colorazione 100 l anticorpi fluorocromo contenente: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue e anti-IFNγ-PE (titolo 1:11) e incubare al buio per 10 minuti a 4 ° C.
- Aggiungere 1 ml di soluzione di lisi dei globuli rossi preparata di fresco (1x) e incubare per 15 minuti a RT. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in un adeguato volume di PBS / EDTA Buffer / 0,5% AB Serum.
- Aggiungere propidio ioduro ad una concentrazione finale di 1 mg / ml appena prima dell'analisi (1: 100 dilutisu 100 mcg / ml). Eseguire analisi citofluorimetrica per valutare la purezza del campione.
- Utilizzare la seguente strategia di gating per calcolare le cellule T CD3 + in percorribile strategia di gating leucociti per la determinazione delle cellule T CD3 + è mostrato nella frazione positiva dopo il processo di CCS arricchimento. Le regioni indicate (figura 3A e 3B, 1-6) sono gerarchicamente collegati come segue:
1: Tempo di cancello → 2: Singole cellule → 3: CD45 + cellule → 4: Cells (detriti esclusa) → 5: leucociti vitali → 6: CD3 + cellule vitali di popolazione - Determinare le frequenze di CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + e CD8 + IFN-γ + cellule T dopo processo di arricchimento CCS (Tabella 2).
- Utilizzare la strategia di gating per determinare le frequenze di CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + e CD8 + cellule T IFN-γ + indicati di seguito fo (catturati) frazione positiva originale e arricchito dopo il processo di CCS. Le regioni indicate sono gerarchicamente collegati e denominati come segue:
1: Tempo di cancello → 2: Singole cellule → 3: CD45 + cellule → 4: Cells (detriti esclusa) → 5: I leucociti vitali → 6: CD3 + cellule vitali → 7: cellule CD4 + → 7a: CD4 + IFN-γ + celle (scatola) → 8: CD8 + cellule → 8a: + cellule CD8 + IFN-g (scatola)
NOTA: I primi 6 regioni dei collegamenti gerarchia indicate sono le stesse di figura 3, (1-6) e l'ultima 2 regioni sono mostrati in Figura 4 (6-8a).
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Representative Results
In questo studio, una cella automatizzata arricchimento sistema CCS è stato utilizzato per la produzione automatica di cellule T specifiche per CMV pp65. Cellule T specifiche per CMV sono stati arricchiti da tre prodotti di cellule aferesi. Il prodotto aferesi steady-state è stato raccolto più di 2 ore da un donatore CMV-sieropositivi e ha generato 10 10 cellule nucleari totali (TNC). 10 9 TNC sono stati poi attivati con CMV pp65 peptidi derivati dal (60 nmol) per 4 ore e l'IFN-γ secernenti cellule T sono state isolate con il CCS sul dispositivo di arricchimento delle cellule automatizzato. Un operatore era necessaria all'inizio dell'esperimento per caricare tutti i reagenti e set di tubi. Impostazione del sistema dagli iniziali dall'imballaggio all'avvio del dispositivo impiegato circa 60 a 120 min. Nota, la macchina può essere programmato per iniziare dopo i reagenti e set di tubi vengono caricati in tal modo consentendo alla macchina di operare senza sorveglianza (ad esempio durante la notte). L'operatore era necessaria dopo 15 ore per effettuare la caratterizzazione dii prodotti finali per la purezza e la vitalità delle cellule. Dopo arricchimento il surnatante cellulare è stato proiettato per micoplasma e la presenza di endotossine. Dopo la convalida, le cellule trasformate possono essere infuse direttamente in pazienti o crioconservati per le applicazioni successive.
Conta delle cellule sono stati determinati in seguito cella conteggio pratiche standard utilizzando le formule indicate nella tabella 2. Ogni tipo di conta delle cellule è stata ripetuta tre volte ei risultati sono stati espressi come media della conta dei cellulari totali con deviazione standard (SD). I rapporti sono stati poi analizzati utilizzando analizzatore di cellule software consigliato. Gating determinare leucociti e linfociti vitali è mostrato in Figura 2. I dati per i conteggi di cella sono presentati nella Tabella 3. La strategia di gating utilizzato per determinare cellule IFN-y + T è mostrata in Figura 3 e Figura 4. Prima di arricchimento, la vitalità delle cellule era regolarmente> 95%. Dopo enrichment, la vitalità delle cellule è stata <50%. Il conteggio assoluto delle cellule T IFN-γ + è stata valutata prima e dopo il processo di arricchimento. Il numero totale di cellule IFN-y + T prima arricchimento era 1,14 x 10 6 ± 0,35 x 10 6 ricavati dal 10 9 cominciando TNC, e dopo arricchimento era 3.09 x 10 5 ± 1,70 x 10 5 cellule IFN-y + T. Ci sono stati 0,16 ± 0,18% cellule T CD4 + presenti prima del trattamento IFN-γ + e questo è aumentato a 47,5 ± 34,7% dopo l'arricchimento. La percentuale di purezza di CD8 + cellule T prima della cattura IFN-γ + era 0,47 ± 0,1%, e aumentata a 90,3 ± 1,7% dopo arricchimento (tabella 3 e 4). Il recupero del campione nella frazione catturata (positivo) era 32,9 ± 15,7% per le cellule T CD4 + e 31,8 ± 13,2% per le cellule T CD8 + basata sulla misura delle cellule IFN-g + T nel sta rting popolazione (Tabella 4). Questi dati indicano che le cellule T specifiche per pp65 sia CD4 + e CD8 + CMV possono essere raccolte automaticamente in modo adatto per la loro applicazione umana.
Figura 1. Arricchimento dei linfociti T CMV-specifici utilizzando il sistema CCS. (A) Molteplici fasi di lavorazione coinvolti nel dispositivo di arricchimento delle cellule di prima generazione sono gestiti da professionisti qualificati. (B) La maggior parte delle fasi di lavorazione, ad eccezione di configurazione tubi iniziale, sono automatizzate nel secondo dispositivo di arricchimento delle cellule generazione che consente di risparmiare 10 - 12 ore di tempo di trattamento operatore in confronto con il dispositivo di prima generazione. Le cellule T-CMV-specifiche virus arricchiti sono caratterizzati dalla citometria di flusso analizzatore cellulare. > Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. strategia di gating utilizzato per determinare le cellule T vitali. I numeri da 1 a 6 indica la gerarchia di dominio gating corrispondente nella figura. (1) Impostazione della porta di, (2) Rimuovere le cellule doppietto tracciando FSC altezza contro FSC zona (3) Identificare le cellule CD45 +, (4) Rimozione detriti cellulari (5) Selezione leucociti vitali e (6) linfociti vitali di popolazione originale di ioduro di propidio colorazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. strategia di gating utilizzate per determinare le cellule T CD3 +. Citometria a flusso macchia analisi Cellule T CD3 + prima (3A) e dopo arricchimento (3B) cella è mostrato qui. È fondamentale determinare quanti peptide attivato specifiche cellule T-CMV sono presenti nei campioni prima e dopo il processo di arricchimento. In questa figura, i numeri da 1 a 6 indicano la popolazione corrispondente di cellule sia per dimensioni o macchiato da un anticorpo specifico. (1) Impostazione della porta del tempo, (2) Rimuovere le cellule doppietto, (3) Selezione + cellule CD45, (4) Rimozione detriti cellulari (5) Selezione leucociti vitali e (6) CD3 + linfociti vitali. Ioduro di propidio colorazione è stata eseguita per rimuovere le cellule morte./52808fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. strategia di gating utilizzato per determinare la purezza delle cellule T IFN-γ +. Le cellule T specifiche per CMV attivati sono fondamentali per il controllo di infezione da CMV, IFN-γ in modo + espressione sulle cellule T sono stati utilizzati per gating. IFN-g + cellule T tra CD4 + e CD8 + sottoinsiemi (A) prima di arricchimento e (B) dopo l'arricchimento. (7/8) Percentuale di cellule T CD4 + e delle cellule T CD8 + è mostrato in A e B (7a. ) Percentuale di cellule CD4 + IFN-g + T viene visualizzato nella scatola quadrata (a) all'interno dell'area di gating e allo stesso modo per C Cellule T in (8a) D8 + IFN-γ +. "T" rappresenta% della popolazione totale di cellule e "#" rappresenta% di cellule della popolazione gated. Ioduro di propidio colorazione è stata effettuata per le cellule morte cancello di partenza. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. I volumi delle frazioni utilizzati per la strategia di colorazione delle cellule.
Tabella 2. Formule utilizzate per il calcolo dei CD4 + T cellule IFN-γ + dopo il processo di arricchimento. Calcolo di CD8 + IFN-γ + cellule T viene eseguita in modo simile.
Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
Tabella 3. conta delle cellule totali in sottogruppi di cellule T prima e dopo l'arricchimento. Esempio # 1 risultati sono mostrati qui.
Tabella 4. La purezza e il recupero di IFN-γ + cellule T prima e dopo arricchimento processo di campione # 1.
Tabella 5. cellulare classificare strategie utilizzate nell'isolamento di cellule T antigene-specifiche CMV grado clinico. 5
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Discussion
La terapia delle cellule T adottiva è emersa come una valida opzione per il trattamento di tumori a cellule B 4. Il suo potenziale terapeutico dipende infondendo il numero desiderato di specifiche cellule T antigene bersaglio privi replicativa senescenza 2. Ciò può essere ottenuto da sistemare una popolazione pura di cellule T specifiche antigene da cellule T espanse le vigenti buona fabbricazione. Due procedure di smistamento sono ampiamente utilizzati, vale a dire, la fluorescenza delle cellule attivate (FACS) e magnetico cellule attivate ordinamento (MACS) per generare specifiche cellule T antigene CMV come abbiamo rivisto di recente 5. Il vantaggio di utilizzare una strategia sopra l'altro è descritto nella Tabella 5. Tecnologia MACS offre la massima purezza arricchimento delle cellule in un modo più economico e più veloce rispetto alla tecnologia FACS. Nell'uso aggiunta di colonne monouso e reagenti per l'arricchimento di cellule totalmente impedisce campione di contaminazione del campione che rendepiù facile da applicare in ambito clinico. Il dispositivo di arricchimento di cellule semi-automatico è laborioso e richiede tempo così lo sviluppo del dispositivo di arricchimento delle cellule automatizzato era necessario per alimentare la domanda clinica.
Il dispositivo cellulare arricchimento CCS automatizzato è uno strumento versatile per isolare cellule del grado clinici come le cellule staminali ematopoietiche, cellule staminali somatiche, così come le cellule T di trasferimento adottivo. Questo dispositivo automatizzato integra trasformazione cellulare, compreso frazionamento del materiale di partenza, il lavaggio delle cellule, la separazione delle cellule, coltura cellulare, e formazione di prodotto finale in un monouso un'unità monouso GMP. Il sistema chiuso riduce i requisiti di camera bianca e riduce al minimo l'intervento dell'operatore per il mantenimento di strutture GMP. L'automazione riduce il tempo richiesto per un operatore di essere presente diminuendo così i costi associati con queste procedure di laboratorio.
Per convalidare il dispositivo di arricchimento cellulare automatizzata, rispettocon il dispositivo di arricchimento di cellule semi-automatico, abbiamo isolato cellule T specifiche per CMV dopo incubazione peptidi CMV pp65-derivati con un prodotto aferesi. GMP grade CMV peptide cocktail pp65-derivato (es PepTivator) è una piscina peptide che consiste principalmente di 15 mer-peptidi con 11 aminoacidi sovrappongono, coprendo la sequenza completa della proteina pp65 del citomegalovirus umano. Resa recupero del campione era ~ 0,3 x 10 6 CD3 + IFN-g + cellule T da 10 9 TNC. Studi clinici hanno dimostrato che l'infusione di poche migliaia di specifiche CMV cellule T come trattamento profilattico per i pazienti (~ 360 a 4.000 cellule / kg di peso corporeo) sottoposti a trapianto ha comportato una protezione contro il CMV. Ad esempio, per trattare CMV in studi clinici con questa tecnologia, un adulto di 70 kg e un bambino di 30 kg apparentemente solo bisogno di 0.26 - 3.0 x 10 5 e 1 x 10 4 - 1.2 x 10 5 cellule, rispettivamente, di viral- specifiche cellule T 12-15 et al. 13. Un maggior numero di cellule vitali sarebbe accettabile come questo sarebbe associato con materiale sufficiente per diversi infusi. Tuttavia, le cellule più vitali in generale significa anche più cellule diverse cellule T (B, NK, ecc). I nostri dati dimostrano che le cellule T CMV-specifiche prodotte per il sistema di arricchimento di cellule automatizzato portato a numeri clinicamente interessanti di cellule T specifiche per CMV che possono poi essere infuse dopo trapianto allogenico.
Infezione da CMV può essere un grave problema dopo il trapianto per risultato un aumento della morbilità e della mortalità. Inoltre, infezione da CMV è associata ad un aumento dei costi, nonostante i recenti progressi nella diagnosi precoce e il trattamento precoce con farmaci anti-virali 16. L'attuale trattamento con ganciclovir e foscarnet può portare a tossicità in medico-fragili destinatari del trapianto.L'add-back di cellule T specifiche per CMV donatore-derivati è stato dimostrato per prevenire e curare le infezioni opportunistiche in riceventi di trapianto allogenico 9. Questo approccio alla immunoterapia adottiva è stata applicata anche per contribuire a ripristinare l'immunità ad altri agenti patogeni, come il virus di Epstein-Barr (EBV), adenovirus 8, e Aspergillus 3 incubando le cellule mononucleate (MNC) con grado clinico peptide cocktail reagenti rispettivo antigene derivati ( Materiali e tavolo di attrezzature). Recentemente, i ricercatori hanno infuso in modo sicuro le cellule T specifiche per patogeno di terze parti che vengono abbinati con almeno un allele HLA del ricevente presentare peptide immunodominante 17. Il sistema automatizzato CCS arricchimento cella può anche essere usato per generare cellule T di terze parti per applicazioni off-the-shelf che sarà utile quando il donatore è CMV-sieronegativi o non disponibili, come ad esempio nel caso di donatori allogenici cordone ombelicale il sangue transplantation.
In sintesi, abbiamo dimostrato l'utilità di un dispositivo di arricchimento delle cellule automatizzato per generare cellule T specifiche per CMV basati su automazione di CCS. Crediamo che questo dispositivo ha il potenziale per abbassare la soglia per le squadre clinici per infondere specifici patogeni, così come, le cellule T tumore-specifiche in pazienti immunocompromessi.
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Disclosures
Entrambi MD Anderson Cancer Center e il dottor Cooper hanno un interesse finanziario in ZIOPHARM Oncology, Inc., e Intrexon Corporation. Il 7 maggio 2015, il dottor Cooper è stato nominato Chief Executive Officer di ZIOPHARM Oncology. Dr. Cooper è ora un Visiting Scientist al MD Anderson. Dottor Cooper ha fondato e possiede InCellerate, Inc. Ha brevetti con Sangamo BioSciences con nucleasi artificiali. Svolge attività di consulenza con Targazyme, Inc. (cellule staminali precedentemente americane, Inc.), GE Healthcare, Ferring Pharmaceuticals, Fate Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals, e Bristol-Myers Squibb. Fa parte del comitato consultivo di Cellectis Scientifico. Egli riceve onorari da Miltenyi Biotec.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 ml Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/ml) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
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