Abstract
Le transfert adoptif de lymphocytes T spécifiques de l'agent pathogène peut être utilisé pour prévenir et traiter les infections opportunistes telles que le cytomégalovirus (CMV) survenant après allogéniques hématopoïétiques transplantation de cellules souches. Cellules T virales spécifiques de donneurs allogéniques, y compris les bailleurs de fonds tiers, peuvent être propagés ex vivo en conformité avec les bonnes pratiques de fabrication (cGMP), employant des cycles répétés de stimulation conduit antigène pour propager sélectivement les cellules T souhaités. L'identification et l'isolement des cellules T spécifiques de l'antigène peuvent également être effectuées sur la base du système de capture de cytokine des cellules T qui ont été activées pour sécréter de l'interféron-gamma (IFN-γ). Cependant, l'application humaine généralisée du système cytokine de capture (CCS) pour aider à rétablir l'immunité a été limitée que le processus de production prend du temps et nécessite un opérateur qualifié. Le développement d'un dispositif d'enrichissement cellulaire de deuxième génération tels que CliniMACS Prodigy maintenantpermet aux enquêteurs de générer des cellules T-viraux spécifiques en utilisant un système de main-d'œuvre moins automatisé. Ce dispositif sépare magnétiquement marqué cellules de cellules non marquées à l'aide de la technologie de tri activé magnétique de cellules pour générer des produits de qualité clinique, est conçu comme un système fermé et peut être consulté et utilisé sur la paillasse. Nous démontrons le fonctionnement de ce nouveau dispositif d'enrichissement de cellules automatisé pour la fabrication de cellules T spécifiques de pp65 CMV obtenus à partir d'un produit d'aphérèse l'état d'équilibre obtenu à partir d'un donneur séropositif CMV. Ces cellules T isolées peuvent ensuite être directement perfusé à un patient sous la supervision réglementaire et institutionnel fédéral. Toutes les étapes de traitement, y compris la bio-élimination des cellules rouges du sang, la stimulation des cellules T, la séparation des cellules T spécifiques de l'antigène, la purification et le lavage sont entièrement automatisés. Les dispositifs tels que ce soulèvent la possibilité que les cellules T pour application humaine peuvent être fabriqués à l'extérieur de bonnes pratiques de fabrication dédié (GMP) Et des installations au lieu être obtenus dans des installations bancaires de sang où le personnel peut superviser les protocoles automatisés pour produire des produits multiples.
Introduction
Hématopoïétiques transplantation de cellules souches (HSCT) 1 peut être combiné avec la thérapie des cellules T adoptive pour améliorer l'effet du greffon contre la tumeur et de fournir l'immunité aux infections opportunistes 2. Génération de cellules T donateurs dérivés spécifiques de l'antigène pour perfusion a historiquement nécessaire du personnel et l'utilisation des installations spécialisées qui sont conformes aux BPF qualifiés. La livraison de ces cellules T a abouti à la résolution des infections opportunistes 3 ainsi que le traitement de la maladie sous-jacente 4. Récemment, des chercheurs ont démontré que le transfert adoptif de seulement quelques milliers de cellules T spécifiques du virus (~ 1 x 10 4 à 2,5 x 10 5 cellules / kg de poids corporel du receveur) peuvent réussir à traiter les infections à CMV opportunistes après allogéniques HSCT 5-9. Un nombre limité d'installations GMP aux exigences de fabrication qualifiés associés et le coût élevé associé à la production de cellules a, cependant, restrl'accès des patients à des thérapies prometteuses igés cellules T 10. Une approche pour isoler des cellules T spécifiques d'antigène est basée sur le CCS en utilisant un réactif bi-spécifique pour reconnaître CD45 et IFN-γ. Comme on le voit, cette méthodologie peut être utilisée pour générer des cellules T spécifiques de CMV de qualité clinique utilisant un dispositif d'enrichissement de cellules automatisé CCS (figure 1B).
Des cellules T spécifiques de CMV sont générés par incubation de peptides chevauchants à partir de l'antigène pp65 de CMV avec des cellules de leucaphérèse totales (TNC) nucléaires provenant de donneurs CMV-séropositif. Ces peptides, affichés dans le contexte de l'antigène de leucocyte humain (HLA), activent les cellules T spécifiques de CMV pp65 au sein du TNC à sécréter IFN-γ. Ces cellules T peuvent alors être "capturés" et séparées magnétiquement. Le fonctionnement du dispositif d'enrichissement de cellules de première génération (figure 1A) requis personnel qualifié dans la culture cellulaire dans des conditions GMP, et la coordination du personnel pour entreprendre les multiples sTeps nécessaire pour générer un produit "capturé".
La procédure généralement requis 10 à 12 h de fonctionnement continu, et donc le personnel probablement besoin de travailler sur deux quarts de travail dans l'établissement GMP. Ces contraintes sont désormais évités par la mise en œuvre d'un dispositif de deuxième génération (le montre la figure 1B). Ce dispositif engage enrichissement magnétique, similaire au premier dispositif de génération, mais automatise les autres aspects de la SCC dans une approche unbreached. Cela réduit considérablement le fardeau de l'équipe GMP que la plupart des étapes peut être accompli sans surveillance par le personnel. En outre, puisque le dispositif fonctionne comme un système fermé, les cellules T spécifiques de l'antigène peuvent être capturées et traitées sur la paillasse à l'exception des étapes impliquées dans l'isolement de leucaphérèse et préparation des matières de départ avant de l'instrument. Détails de l'instrumentation complète et la fonctionnalité de ce dispositif d'enrichissement cellulaire de deuxième génération ont été pubblies 11.
Ici, nous décrivons les étapes pour enrichir les cellules T spécifiques de pp65 CMV d'un produit d'aphérèse l'état d'équilibre en utilisant le système de CCS d'enrichissement de cellules automatisé. Une fois isolé, ces cellules T spécifiques de CMV peuvent être immédiatement perfusé dans un patient.
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Protocol
1. Préparation du matériel dans des conditions stériles (Voir Tableau Matériaux et Équipement)
- Préparation 3 L de tampon PBS / EDTA additionné de sérum-albumine humaine (HSA) à une concentration finale de 0,5% (p / v).
- Préparer 1 L sac de classe 0,9% de chlorure de sodium (NaCl) clinique et 2 L de qualité GMP milieu de culture cellulaire.
- Préparer 60 nmol de CMV spécifiques à l'antigène peptidique cocktail en reconstituant un flacon de CMV pp65 avec 8 ml d'eau stérile.
- Transfert CMV pp65 peptide cocktail dans un sac de congélation de 50 ml de volume en utilisant un / de Spike interconnexion Luer et serrer avec une pince de verrouillage pour éviter une distribution ultérieure de cocktail dans le jeu de tuyaux. Ouvrir cellule tube enrichissement jeu (TS 500) dans des conditions stériles.
- Utilisant un tube stérile soudeur, connectez peptide cocktail sac de congélation en connexion de tube pour valve 2 du jeu de tuyaux TS 500. Ne pas ouvrir le sac pince peptide cocktail à cette époque.
- Retirer 1 x 10 9 TNC à partir de produit de départ et de suspension cellulaire dans du tampon PBS / EDTA contenant 2,5% de HSA à un volume total de 50 ml. Injecter le produit cellulaire dans un sac de transfert de 150 ml.
2. Préparation et utilisation de cellules automatisé Système d'enrichissement (Voir Tableau Matériaux et Équipement)
- Allumez le système d'enrichissement de cellules (figure 1B) et sélectionnez le programme "CCS_IFN-γ enrichissement". Observez une interface utilisateur montrant des écrans avec des instructions et des photos directeurs l'opérateur à travers la procédure.
- Entrez le paramètre "Opérateur" et "Tubing Set P / N Non". Ensuite, installez le dispositif Tubing Set 500 à l'enrichissement de cellules automatisé selon les instructions affichées sur l'écran du moniteur interactif.
- Suivez les instructions étape par étape affichées sur l'écran pour connecter le moyen et les tampons à l'appareil. Numéro de catalogue et le numéro de lot des réactifs avant connecting à l'instrument.
- Après le contrôle final de l'ensemble de tubes, ouvrir la pince du sac peptide cocktail. Ouvrez le sac moyen et initier amorçage automatique de l'ensemble de tubes.
- Après l'étape d'amorçage est terminée, compléter HSA (2,5%) dans un tampon de NaCl dans le sac de réservoir (200 ml) à l'aide de la soudeuse tube stérile. Transférer le produit cellulaire à partir dans le "sac de l'application" en utilisant le tube soudeur stérile.
- Connectez CCS (IFN) réactifs dans les tubes respectifs via des adaptateurs. Entrez le temps préféré pour recueillir une fraction de matériau cellulaire avant que le processus d'enrichissement. Examiner et de vérifier l'exactitude de toutes les données / paramètres entrés. Lancer le processus.
- Avant le début du processus automatisé d'enrichissement de cellules, enlever le sac Quality Control (BRC, la fraction originale (ori) contient environ 1,3 ml de 100 ml le contenu de la chambre diluée avec un tampon / EDTA PBS). Sceller le BRC, peser et stocker à 4 ° C.
- Démarrez le enrichmeprocessus nt. A la fin du processus, les cellules cibles sont éluées avec un volume approximatif de tampon d'élution à partir de la poche de réservoir.
- Sceller la cellule cible Sac non (NTCB, fraction négative = neg) et Sac cellulaire cible (TCB, positif fraction = pos) et peser chaque sac. Les poids seront utilisés ultérieurement pour le calcul des nombres de cellules.
- Immédiatement après la procédure d'enrichissement recueillir deux aliquotes par fraction de cytométrie de flux, et stocker le reste des échantillons à 4 ° C. Utilisez une aliquote de l'échantillon pour la détermination de la numération cellulaire et l'autre partie aliquote de l'échantillon pour l'analyse des performances de l'enrichissement (tableau 1).
- Retirer le tube fixé à partir de l'instrument d'enrichissement cellulaire. Transférez le fichier journal sur un lecteur USB pour une utilisation future.
REMARQUE: Tous les réactifs doivent être préparés dans des conditions stériles. L'utilisation d'une hotte de biosécurité de type II est fortement recommandé. Utilisez aphérèse produit cellulaire à l'état stable (non-mobilisés) isolé à partir d'une bonne santéCMV-séropositif donateurs pour enrichir les cellules T spécifiques de l'antigène CMV. Seulement autorisé par la FDA HSA doit être utilisé. Le tampon pour la préparation de la cellule doit être maintenue à 19 ° C à 25 ° C alors que les températures ambiantes inférieures ou supérieures se traduira par la pureté réduite et un rendement réduit des cellules cibles.
3. Détermination comte cellulaire
- Prenez les aliquotes de QCB, NTCB et TCB pour la numération des cellules, comme indiqué dans le tableau 1. Ajouter CD45-VoBlue à chaque aliquote (titre 01h11) et incuber dans l'obscurité pendant 10 min à 4 ° C.
- Ajouter 1,5 ml de solution de globules rouges de lyse fraîchement préparé (1x) à la fraction initiale et la fraction négative, à 450 ul fraîchement préparé solution de lyse des globules rouges à la fraction positive, et incuber toutes les fractions de 15 min à température ambiante.
- Juste avant l'analyse, ajouter l'iodure de propidium à une concentration finale de 1 pg / ml (dilution 1: 100 de 100 ug / ml). Utilisez compteur de cellules automatique pour déterminer le nombre de cellules et vicapacité. Utilisez dispositif de compteur de cellules logiciel recommandé pour cytométrie de flux. Déterminer les valeurs absolues de leucocytes pour les fractions originaux, négatifs et positifs.
NOTE: Le nombre de cellules de leucocytes viables par ml des échantillons prélevés pour l'analyse de numération cellulaire est déterminée en utilisant le logiciel de l'analyseur recommandé cellulaire. - Réglez la région comme représenté sur la Figure 2 (région 5, leucocytes viables). Utilisez la stratégie de déclenchement suivant pour déterminer le nombre de cellules. Une fraction de leucocytes viables d'origine est représenté sur la figure 2.
- Les régions indiquées (figure 2, 6.1) sont hiérarchiquement comme suit:
1: Temps porte → 2: cellules individuelles → 3: CD45 + cellules → 4: leucocytes (débris exclu) → 5: leucocytes viables → 6: lymphocytes viables - Répétez les mêmes étapes pour déterminer le nombre de cellules pour les fractions positives et négatives. Calculer le nombre de cellules de la fraction ensembleen considérant le facteur de dilution de l'échantillon et le volume total de la fraction (tableau 2).
4. Examen de la performance de séparation
- Laver les aliquotes de QCB, NTCB et les cellules de la fraction TCB avec / EDTA mémoire tampon de pré-réfrigérés PBS / 0,5% de sérum AB. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 5 min à 4 ° C et aspirer le surnageant.
- Resuspendre les cellules dans le mélange de coloration 100 pi anticorps fluorochrome contenant: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-PerCP, CD20-PerCP, CD45-VioBlue et anti-IFN-PE (titre 01h11) et incuber dans l'obscurité pendant 10 min à 4 ° C.
- Ajouter 1 ml de solution de globules rouges de lyse fraîchement préparé (1x) et incuber pendant 15 min à température ambiante. Centrifugeuse à 300 g pendant 5 min à 4 ° C et aspirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans un volume suffisant de PBS / EDTA / 0,5% de sérum AB.
- Ajouter l'iodure de propidium à une concentration finale de 1 pg / ml juste avant l'analyse (1: 100 dilutisur 100 ug / ml). Effectuer l'analyse de cytométrie de flux pour évaluer la pureté de l'échantillon.
- Utilisez la stratégie de déclenchement suivante pour calculer les lymphocytes T CD3 + dans la stratégie de vannage de leucocytes viables pour déterminer les lymphocytes T CD3 + est montré dans la fraction positive après processus d'enrichissement de CCS. Les régions indiquées (Figure 3A et 3B, 1-6) sont liés hiérarchiquement comme suit:
1: Temps de porte → 2: cellules individuelles → 3: CD45 + cellules → 4: Cellules (débris exclu) → 5: leucocytes viables → 6: CD3 + cellules viables population - Déterminer les fréquences de CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + et CD8 + IFN-γ + cellules T après processus d'enrichissement CCS (tableau 2).
- Utiliser la stratégie de déclenchement pour déterminer les fréquences de cellules CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-γ + et CD8 + IFN-γ + cellules T au-dessous fou un (capturé) fraction positive original et enrichi après le processus de CCS. Les régions indiquées sont hiérarchiquement liés et nommés comme suit:
1: Temps de porte → 2: cellules individuelles → 3: CD45 + cellules → 4: Cellules (débris exclu) → 5: leucocytes viables → 6: CD3 + cellules viables → 7: cellules CD4 + → 7a: CD4 + IFN-γ + cellules (encadré) → 8: cellules CD8 + → 8a: CD8 + IFN-y + cellules (encadré)
REMARQUE: Les 6 premières régions des liens hiérarchiques indiqués sont les mêmes que sur la figure 3, (6.1) et des 2 dernières régions sont présentés dans la figure 4 (6-8a).
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Representative Results
Dans cette étude, une cellule d'enrichissement du système automatisé CCS a été utilisée pour la production automatisée de cellules T spécifiques de pp65 du CMV. Des cellules T spécifiques de CMV ont été enrichies à partir de trois produits d'aphérèse de cellules. Le produit d'aphérèse l'état d'équilibre a été récolté plus de 2 h à partir d'un donneur CMV-séropositif et a généré 10 10 cellules nucléaires totales (TNC). 10 9 TNC ont ensuite été activé avec CMV pp65 peptides dérivés (60 nmol) pour 4 h et l'IFN-γ cellules T sécrétant ont été isolés en utilisant le CCS sur le dispositif d'enrichissement de cellules automatisé. Un opérateur a été nécessaire au début de l'expérience pour charger tous les réactifs et les ensembles de tubes. Configuration du système à partir de la première déballage de démarrage de l'appareil a pris environ 60 à 120 min. Remarque, la machine peut alors être programmé pour démarrer après les réactifs et les ensembles de tubes sont chargés de ce fait permettant à la machine de fonctionner sans surveillance (notamment la nuit). L'opérateur a été nécessaire après 15 h pour effectuer la caractérisation desles produits finaux de la pureté et la viabilité cellulaire. Après enrichissement le surnageant cellulaire a été criblée pour la présence de mycoplasmes et de l'endotoxine. Après validation, les cellules traitées peuvent être infusés directement dans les patients ou cryoconservés pour les applications ultérieures.
Les comptages de cellules ont été déterminés cellule suivante compter pratiques standard en utilisant les formules indiquées au tableau 2. Chaque type de comptage cellulaire a été répété trois fois et les résultats ont été exprimés nombre total de cellules en tant que moyenne avec déviation standard (SD). Des rapports ont été ensuite analysées en utilisant analyseur de cellules logiciel recommandé. Déclenchement pour déterminer les leucocytes et des lymphocytes viables est représenté sur la Figure 2. Les données pour les numérations cellulaires sont présentés dans le tableau 3. La stratégie de déclenchement utilisés pour déterminer les cellules IFN-y + t est représentée sur la figure 3 et la figure 4. Avant d'enrichissement, la la viabilité des cellules était régulièrement> 95%. Après enrichment, la viabilité des cellules était <50%. Le nombre absolu de l'IFN-γ + cellules T a été évaluée avant et après le processus d'enrichissement. Le nombre total de cellules IFN-y + T avant l'enrichissement était de 1,14 x 10 6 ± 0,35 x 10 6 comme provenant de 10 9 à partir TNC, et après l'enrichissement était de 3,09 x 10 5 ± 1,70 x 10 5 cellules IFN-y + T. Il y avait 0,16 ± 0,18% de l'IFN-γ + cellules T CD4 + présents avant le traitement et cela a augmenté à 47,5 ± 34,7% après enrichissement. Le pourcentage de pureté de CD8 + IFN-γ + cellules T avant de capture était de 0,47 ± 0,1%, et a augmenté à 90,3 ± 1,7% après enrichissement (tableau 3 et 4). Récupération de l'échantillon dans la fraction capturé (positif) était de 32,9 ± 15,7% pour les cellules T CD4 + et de 31,8 ± 13,2% pour les cellules T CD8 + basé sur la mesure des cellules IFN-y + T dans la sta rter population (tableau 4). Ces données indiquent que les cellules T spécifiques de pp65 la fois CD4 + et CD8 + CMV peuvent être récoltées automatiquement d'une manière appropriée pour leur application humaine.
Figure 1. Enrichissement des cellules T spécifiques du CMV en utilisant le système CCS. (A) des étapes de traitement multiples impliqués dans le dispositif d'enrichissement de cellules de première génération sont manipulés par des professionnels qualifiés. (B) La plupart des étapes de traitement, à l'exception de la configuration initiale du tube, sont automatisées dans le deuxième dispositif d'enrichissement de cellules de génération qui permet d'économiser de 10 à 12 heures de temps de traitement de l'opérateur par rapport au premier dispositif de génération. Les cellules T spécifiques de CMV-virus enrichies sont caractérisées par la cytométrie en flux analyseur de cellules. > S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Stratégie entrée sont utilisés pour déterminer les cellules T viables. Les numéros 1 à 6 indiquent le domaine de la hiérarchie de déclenchement correspondant dans la figure. (1) Mise en place de grille de temps, (2) l'élimination des cellules de doublet en traçant FSC-hauteur contre FSC-zone (3) l'identification de cellules CD45 +, (4) élimination des débris cellulaires (5) Sélection leucocytes viables et (6) de lymphocytes viables de population d'origine par l'iodure de propidium. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. Gating stratégie utilisée pour déterminer les cellules T CD3 +. Cytométrie en flux efface analyse des Lymphocytes T CD3 + avant (3A) et après enrichissement (3B) de la cellule est montré ici. Il est crucial de déterminer le nombre de cellules T activées peptidiques spécifiques pour le CMV sont présents dans les échantillons avant et après le processus d'enrichissement. Dans cette figure, les numéros 1 à 6 indiquent que la population de cellules correspondant à leur taille ou taché par un anticorps spécifique. (1) Mise en place gâchette temps, (2) l'élimination des cellules de doublets, (3) Sélection CD45 + cellules, (4) élimination des débris cellulaires (5) Sélection des leucocytes viables et (6) CD3 + lymphocytes viables. L'iodure de propidium a été effectuée pour éliminer les cellules mortes./52808fig3large.jpg "Target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. gate stratégie utilisée pour déterminer la pureté de l'IFN-γ + cellules T. Cellules T spécifiques de CMV activés sont critiques pour commander infection par le CMV, de sorte que l'IFN-γ + expression sur les cellules T ont été utilisés pour déclenchement. IFN-y + cellules T CD4 + et parmi les CD8 + (A) avant l'enrichissement et (B) après enrichissement. (7/8) Pourcentage de cellules T CD4 + et CD8 + est représenté en A et B (7a. ) Pourcentage de cellules IFN-gamma de + T CD4 + est affiché dans la boîte carrée (a) dans la zone de déclenchement et de même pour C D8 + IFN-γ + dans les cellules T (8a). "T" représente% des cellules dans la population totale et "#" représente en% de cellules population fermée. L'iodure de propidium a été réalisée pour les cellules mortes grille de départ. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1. Les volumes des fractions utilisées pour la stratégie de la coloration des cellules.
Tableau 2. Formules utilisées pour le calcul des CD4 + IFN-γ + cellules T, après l'opération d'enrichissement. Calcul des CD8 + IFN-γ + des cellules T est une performance similaire.
S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.
Tableau 3. Le nombre total de cellules dans des sous-ensembles de cellules T avant et après enrichissement. Exemple # 1 résultats sont présentés ici.
Tableau 4. La pureté et la récupération de l'IFN-γ + T cellule avant et après l'opération d'enrichissement de l'échantillon n ° 1.
Tableau 5. Cellule tri stratégies utilisées dans l'isolement des cellules T spécifiques de l'antigène CMV qualité clinique. 5
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Discussion
La thérapie des cellules T adoptive a émergé comme une option viable pour traiter les tumeurs malignes à cellules B 4. Son potentiel thérapeutique dépend de l'infusion le nombre désiré de cellules T spécifiques de l'antigène cible sénescence réplicative qui manquent deux. Ceci peut être obtenu par le tri d'une population pure de cellules T spécifiques de l'antigène de lymphocytes T expansés en conformité avec les pratiques de fabrication actuelles bons. Deux procédures de tri sont largement utilisés, à savoir, une cellule de tri activé par fluorescence (FACS) et le tri cellulaire activé magnétique (MACS) pour générer des cellules T spécifiques de l'antigène CMV comme on l'a récemment examiné cinq. L'avantage d'utiliser une seule stratégie sur l'autre est présenté dans le tableau 5. Technologie MACS offre la plus grande pureté d'enrichissement de cellules d'une manière économique et plus rapide par rapport à la technologie FACS. Dans l'usage de plus de colonnes jetables et des réactifs pour l'enrichissement de la cellule empêche totalement l'échantillon à la contamination de l'échantillon qui rendplus facile à appliquer dans les milieux cliniques. Le dispositif semi-automatique enrichissement cellulaire main-d'oeuvre et de temps afin développement du dispositif d'enrichissement de cellules automatisé était nécessaire pour nourrir la demande clinique.
Dispositif d'enrichissement de cellule CCS automatisé est un instrument souple pour isoler des cellules de qualité clinique telles que des cellules souches hématopoïétiques, les cellules souches somatiques, ainsi que des lymphocytes T pour le transfert adoptif. Ce dispositif automatisé intégrant traitement de cellules, y compris le fractionnement du produit de départ, le lavage des cellules, la séparation cellulaire, culture cellulaire, et la formation du produit final dans une unité jetable GMP à usage unique. Le système fermé réduit les besoins en salle blanche et minimise l'implication de l'opérateur pour maintenir des installations GMP. L'automatisation permet de réduire le temps nécessaire à un opérateur pour être présent en diminuant ainsi le coût associé à ces procédures de laboratoire.
Afin de valider le dispositif d'enrichissement de cellules automatique, comparativementavec le dispositif de semi-automatisé enrichissement des cellules, nous avons isolé des cellules T spécifiques de CMV après incubation des peptides CMV pp65-dérivés avec un produit d'aphérèse. GMP qualité CMV peptide pp65 cocktail de dérivés (par exemple PepTivator) est un pool de peptide qui se compose essentiellement de 15-mer peptides avec 11 acides aminés se chevauchent, couvrant la séquence complète de la protéine pp65 du cytomégalovirus humain. Rendement de récupération de l'échantillon était de 0,3 x 10 ~ 6 CD3 + IFN-y de 10 cellules 9 TNC + T. Des études cliniques ont démontré que la perfusion de quelques milliers de cellules T spécifiques de CMV comme traitement prophylactique de patients (~ 360 à 4000 cellules / kg de poids corporel) a donné lieu à subir TCSH protection contre le CMV. Par exemple, afin de traiter le CMV dans des essais cliniques en utilisant cette technologie, un adulte de 70 kg et un enfant de 30 kg apparemment nécessiter seulement 0,26 - 3,0 x 10 5 et 1 x 10 4 à 1,2 x 10 5 cellules, respectivement, de viral- cellules T spécifiques 12-15 et al. 13. Un nombre plus élevé de cellules viables serait également acceptable car cela serait associé avec assez de matériel pour différentes perfusions. Cependant, les cellules viables en général signifie également plusieurs cellules autres que les cellules T (B, NK, etc.). Nos résultats démontrent que les cellules T spécifiques du CMV générées sur le système d'enrichissement de cellules automatique ont donné lieu à un nombre cliniquement intéressantes de cellules T spécifiques de CMV qui peuvent ensuite être perfusé après TCSH allogénique.
L'infection à CMV peut être un problème majeur après HSCT résultant à la fois augmentation de la morbidité et de la mortalité. En outre, l'infection à CMV est associée à une augmentation des coûts, malgré les progrès récents dans le diagnostic précoce et le traitement précoce avec des médicaments anti-viraux 16. Le traitement actuel en utilisant le ganciclovir et le foscarnet peut conduire à une toxicité chez les receveurs médicalement fragiles de HSCT.L'add-back de cellules T spécifiques de CMV donateurs dérivé a été démontré pour prévenir et traiter les infections opportunistes chez les receveurs de allogéniques HSCT 9. Cette approche de l'immunothérapie adoptive a également été appliquée pour aider à rétablir l'immunité à d'autres agents pathogènes tels que le virus d'Epstein-Barr (EBV), adénovirus 8, et Aspergillus 3 en incubant des cellules mononucléaires (MNC) de grade clinique réactifs peptide cocktail antigène respectif dérivés ( Matériaux et la table de l'équipement). Récemment, des chercheurs ont infusé en toute sécurité des cellules T tiers pathogènes spécifiques qui sont appariés avec au moins un allèle HLA chez le receveur présentant peptide immunodominant 17. Le système de CSC d'enrichissement de cellules automatisé peut aussi être utilisé pour générer des tiers cellules T pour les applications off-the-shelf qui sera utile lorsque le donneur est CMV-séronégatifs ou indisponible, comme le cas avec les donateurs pour allogénique cordon ombilical transplantati de sangsur.
En résumé, nous démontrons l'utilité d'un dispositif d'enrichissement de cellules automatisé pour générer des cellules T spécifiques de CMV basé sur l'automatisation de la CSC. Nous croyons que ce dispositif a le potentiel d'abaisser le seuil pour les équipes cliniques pour infuser spécifique des agents pathogènes, ainsi que, les cellules T spécifiques de la tumeur chez les patients immunodéprimés.
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Disclosures
Les deux MD Anderson Cancer Center et le Dr Cooper ont un intérêt financier dans ZIOPHARM Oncology, Inc., et Intrexon Corporation. Le 7 mai, 2015, le Dr Cooper a été nommé chef de la direction au ZIOPHARM oncologie. Dr Cooper est maintenant un chercheur invité au MD Anderson. Le Dr Cooper a fondé et possède InCellerate, Inc. Il possède des brevets avec Sangamo BioSciences avec nucléases artificielles. Il consulte Targazyme, Inc. (cellules souches anciennement américains, Inc.), GE Healthcare, Ferring Pharmaceuticals, le destin Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals et Bristol-Myers Squibb. Il est membre du conseil consultatif scientifique de Cellectis. Il reçoit des honoraires de Miltenyi Biotec.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 ml Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/ml) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
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