Abstract
Приемная передача возбудителя конкретных Т-клеток может быть использован для профилактики и лечения оппортунистических инфекций, таких как цитомегаловирус (ЦМВ) инфекции, происходящие после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. Вирусные конкретных Т-клеток из аллогенных доноров, в том числе доноров сторонних, могут распространяться экс естественных условиях в соответствии с действующим надлежащей производственной практики (цГМФ), используя повторные раундов антиген-приводом стимуляции выборочно распространяются желаемых Т-клеток. Идентификация и выделение антиген-специфических Т-клеток может быть также проведена на основе системы захвата цитокинов Т-клеток, которые были активированы секретировать гамма-интерферона (IFN-gamma). Тем не менее, широко распространены человека применение системы захвата цитокинов (CCS), чтобы помочь восстановить иммунитет был ограничен, как производственный процесс занимает много времени и требует квалифицированного оператора. Развитие устройство обогащения клеток второго поколения, таких как CliniMACS Prodigy Сейчаспозволяет следователям генерируют вирусных конкретных Т-клеток, используя автоматизированную, менее трудоемким систему. Это устройство отделяет магнитно меченых клеток из клеток с использованием немеченых магнитного активированного технологии сортировки клеток для создания клинико-класса продуктов, спроектирована как закрытая система, и могут быть доступны и работают по крышке. Мы демонстрируем действие этого нового устройства автоматизированного обогащения клеток для производства CMV РР65-специфических Т клеток, полученных из стационарного афереза продукта, полученного из ЦМВ серопозитивным донора. Эти изолированные Т-клетки могут быть непосредственно вливаются в пациента под институциональной и федерального регулирующего надзора. Все стадии био-обработки, включая удаление эритроцитов, стимуляция Т-клеток, разделения антиген-специфических Т-клеток, очистки и промывки полностью автоматизированы. Такие устройства, как это повышает вероятность, что Т-клетки для человека применения могут быть изготовлены за пределами посвященной надлежащей производственной практики (GMP) Средства и вместо быть произведены в банковских услуг крови, где сотрудники могут контролировать автоматизированные протоколы, чтобы произвести несколько продуктов.
Introduction
Трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) 1 могут быть объединены с приемной терапии Т-клеток, чтобы улучшить трансплантат против опухоли эффект и обеспечить устойчивость к оппортунистических инфекций 2. Генерация антигенспецифических доноров полученных Т-клеток для инфузий исторически требуется квалифицированный персонал и использование специализированных объектов, которые GMP-совместимый. Доставка таких Т-клеток привела к решению оппортунистических инфекций 3, а также в лечении основного злокачественности 4. Недавно исследователи показали, что усыновитель перевод только несколько тысяч вирусспецифических Т-клеток (~ 1 х 10 4 - 2,5 х 10 5 клеток / кг массы тела получатель) может успешно лечения оппортунистических инфекций ЦМВ после аллогенной HSCT 5-9. Ограниченное число GMP объектов с соответствующими квалифицированных производственных требований и высокая стоимость, связанная с производством клеток, однако, Ограничicted доступ пациента обещая Т-клеточной терапии 10. Один из подходов к выделению антиген-специфических Т-клеток основан на CCS с помощью би-специфическим реагентом распознавать CD45 и IFN-gamma. Как показано, эта методика может быть использована для генерации клинико-класса CMV-специфичные Т-клетки, использующие автоматический CCS обогащение клеток устройство (Фигура 1В).
CMV-специфические Т-клетки генерируются путем инкубации перекрывающихся пептидов из ЦМВ РР65 антигена с лейкафереза общего ядерных клеток (ТНК) из ЦМВ серопозитивных доноров. Эти пептиды, отображаемые в контексте человеческого лейкоцитарного антигена (HLA), активировать ЦМВ РР65-специфических Т клеток в ТНК секретируют IFN-gamma. Эти Т-клетки могут быть "захвачены" и магнитно разделены. Работа устройства по обогащению первого поколения клеток (1А) требуется персонал квалифицированных в культуре клеток в условиях GMP, и координация персонала для проведения многочисленных SТЭЦ необходимо сформировать "захваченный" продукт.
Процедура обычно требуется от 10 до 12 ч непрерывной работы, и, следовательно, скорее всего, потребуется персонал для работы в течение двух смен на объекте GMP. Эти ограничения в настоящее время устранены путем реализации второго поколения устройства (как показано на фиг.1В). Это устройство осуществляет магнитное обогащение, похожий на устройство первого поколения, но автоматизирует другие аспекты CCS в unbreached подхода. Это значительно снижает нагрузку на команду GMP, как большинство из шагов можно выполнить без присмотра персонала. Кроме того, поскольку устройство действует как замкнутой системе, антиген-специфические Т-клетки могут быть захвачены и обработаны по крышке, кроме операций, связанных с изоляцией лейкафереза и подготовки материалов перед запуском инструмента. Подробная информация о полной приборов и функциональности этого устройства по обогащению клеток второго поколения были пабчания 11.
Здесь мы опишем шаги, чтобы гости чувствовали ЦМВ РР65-специфических Т клеток из стационарного афереза продукта с использованием автоматизированной системы CCS обогащению клеток. После выделения эти CMV-специфические Т-клетки могут быть немедленно вливают пациенту.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка материалов в стерильных условиях (см Материалы и оборудование таблицу)
- Подготовьте 3 л PBS / EDTA буфера с добавлением сывороточного альбумина человека (HSA) до конечной концентрации 0,5% (вес / объем).
- Подготовьте 1 L мешок 0,9% раствора натрия хлорида клинической класса (NaCl) и 2 л клеточной культуральной среде GMP класса.
- Подготовьте 60 нмоль ЦМВ конкретных пептид антигена коктейль путем восстановления один флакон ЦМВ РР65 с 8 мл стерильной воды.
- Перевести ЦМВ РР65 пептидный коктейль в 50 мл объема морозильной сумку с использованием Луер / Spike соединительного элемента и зажим с фиксатором щипцы, чтобы избежать последующее распределение коктейль в наборе труб. Открыть клеток набор обогащение трубки (TS 500) в стерильных условиях.
- Использование стерильного сварщика труб, подключения пептид коктейль мешок замерзания в связи трубки для клапана 2 комплекта трубок TS 500. Не открыть пептид коктейль мешок зажим в это время.
- Удалить 1 х 10 9 тNC от исходного клеточного продукта и приостановить в PBS / EDTA буфером, содержащим 2,5% HSA до общего объема 50 мл. Внедрить сотовой продукта в мешке передачи 150 мл.
2. Подготовка и использование автоматизированной системы по обогащению клеток (см Материалы и оборудование таблицу)
- Включить систему обогащения клеток (рис 1B) и выберите программу "CCS_IFN-γ обогащению". Соблюдайте пользовательский интерфейс, показывающий экраны с инструкциями и руководящими фотографий оператора в порядке.
- Введите параметр "оператор" и "Трубы Набор P / N нет". Затем установите трубки набора 500 автоматизированного обогащения клеток устройство в соответствии с инструкциями, отображаемых на экране интерактивного монитора.
- Следуйте шаг за шагом инструкции, отображаемых на экране, чтобы подключить носитель и буферы в устройстве. Рекордное число каталог и номер партии реагентов до коннектинг к инструменту.
- После окончательной проверки комплекта трубок, открыть зажим пептида коктейль мешок. Откройте средний мешок и инициировать автоматическое грунтовки множества труб.
- После того, как грунтовки шаг завершен, дополнить HSA (2,5%) в буфере NaCl в резервуаре мешок (200 мл) с помощью стерильного сварщика труб. Перенести начиная сотовой продукта в мешке "Application", используя стерильную сварщика труб.
- Подключите CCS (IFN, реагенты) в соответствующей трубки с помощью адаптеров. Введите желаемое время для сбора фракцию клеточного материала, прежде чем процесса обогащения. Обзор и проверить точность всех данных / параметры введены. Начать процесс.
- Перед началом автоматической процесса обогащения клеток, удалить управления сумка качества (QCB, оригинальная фракция (Ori) содержит примерно 1,3 мл из 100 мл содержимого камеры разбавленного PBS / EDTA буфера). Уплотнение QCB, взвесить, и магазин на 4 ° C.
- Начните enrichmeNT процесс. В конце процесса, клетки-мишени будут элюировали с приблизительной объема буфера для элюции из резервуара мешок.
- Уплотнение нецелевых клеток сумка (NTCB, отрицательный доля = нег) и клетки-мишени сумка (УТС, положительная дробь = POS) и взвешивать каждый мешок. Веса будут использованы в дальнейшем для расчета количества клеток.
- Сразу же после процедуры обогащения собирают две аликвоты на фракцию для проточной цитометрии, и хранить остальную часть образцов при 4 ° С. Использование одного образца для определения аликвоту клеточной массы, а другой образец аликвоты для анализа производительности обогащение (Таблица 1).
- Снимите трубку набор из инструмента обогащения клеток. Перенести файл журнала на диск USB для использования в будущем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все реагенты должны быть подготовлены в стерильных условиях. Использование биобезопасности тип II капотом настоятельно рекомендуется. Используйте стационарный сотовый афереза продукт (не мобилизованы) изолирован от здоровогоЦМВ-серопозитивных доноров, чтобы обогатить антиген, специфические Т-клетки. Только FDA лицензию HSA должен быть использован. Буфер для клеточного препарата следует хранить при +19 ° C до +25 ° C, как более низкой или высокой температуре окружающей среды приведет к уменьшению чистоты и снижению выхода целевых клеток.
Определение 3. Граф сотовый
- Возьмем аликвоты QCB, NTCB и УТС для подсчета клеток, как показано в таблице 1. Добавить CD45-VoBlue каждой аликвоте (титр 1:11) и инкубируют в темноте в течение 10 мин при 4 ° С.
- Добавить 1,5 мл свежеприготовленного раствора для лизиса эритроцитов (1x) в исходное фракции и фракции, отрицательной 450 мкл свежеприготовленного раствора для лизиса клеток красной крови с положительным фракции, и инкубируют все фракции в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Непосредственно перед анализом добавьте пропидий йодида до конечной концентрации 1 мкг / мл (разведение 1: 100 100 мкг / мл). Используйте автоматический счетчик клеток для определения количества клеток и VIспособности. Используйте устройство счетчик клеток рекомендуется использовать программное обеспечение для анализа потока цитометрии. Определить абсолютные счетчики лейкоцитов оригинальные, отрицательных и положительных фракций.
Примечание: если число элементов жизнеспособных лейкоцитов на мл образцов, взятых для анализа клеточной массы определяется с использованием анализатора клеток рекомендуется использовать программное обеспечение. - Установите область, как показано на рисунке 2 (регион 5, жизнеспособные лейкоциты). Используйте следующую стратегию для определения стробирования подсчет клеток. Жизнеспособная лейкоцитов в оригинальном фракции показано на рисунке 2.
- Указанные регионы (Рисунок 2, 1-6) иерархически следующим образом:
1: Время ворота → 2: Отдельные клетки → 3: CD45 + клеток → 4: Лейкоциты (мусор без НДС) → 5: жизнеспособных лейкоцитов → 6: жизнеспособные лимфоциты - Повторите те же действия для определения количества клеток для негативных и позитивных фракций. Рассчитать количество клеток всей фракциис учетом коэффициента разбавитель образца и общего объема фракции (таблица 2).
4. Рассмотрение разделения производительности
- Вымойте аликвот QCB, NTCB и УТС фракции клеток с предварительно охлажденным PBS / EDTA буфера / 0,5% АВ сыворотки. Центрифуга клетки при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С и аспирата супернатант.
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл антитела флуорохрома окрашивания смеси, содержащей: CD3-FITC, CD4-APC, CD8-APC-Vio770, CD14-CD20, PerCP-PerCP, CD45-VioBlue и анти-IFN, PE-титр 1:11 () и инкубировать в темноте в течение 10 мин при 4 ° С.
- Добавить 1 мл свежеприготовленного раствора для лизиса эритроцитов (1x) и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С и аспирата супернатант. Ресуспендируют клеток в адекватном объеме PBS / EDTA буфер / 0,5% АВ сыворотки.
- Добавить пропидий йодида до конечной концентрации 1 мкг / мл непосредственно перед анализом (1: 100 dilutiна 100 мкг / мл). Выполнение проточной цитометрии, чтобы оценить чистоту образца.
- Используйте следующую стратегию стробирования для расчета CD3 + Т-клеток в жизнеспособном лейкоцитов стратегии Память для определения CD3 + Т-клеток показана на положительной фракции после процесса обогащения CCS. Указанные участки (рис 3А и 3В, 1-6) иерархически связаны которые следующим образом:
1: Время ворота → 2: Отдельные клетки → 3: CD45 + клеток → 4: Клетки (мусор без НДС) → 5: жизнеспособные лейкоциты → 6: жизнеспособные клетки CD3 + населения - Определить частоты CD4 +, CD8 + Т-клеток, после процесса обогащения CCS (Таблица 2) CD4 + IFN-gamma + и CD8 + IFN-gamma +.
- Использование стратегии стробирования для определения частоты CD4 +, CD8 +, CD4 + IFN-gamma + и CD8 + IFN-gamma + Т-клеток, показанные ниже Fили оригинал и обогащенного (захватили) положительная дробь после процесса CCS. Указанные регионы иерархически связаны и названы следующим образом:
1: Время ворота → 2: Отдельные клетки → 3: CD45 + клеток → 4: Клетки (мусор без НДС) → 5: жизнеспособные Лейкоциты → 6: жизнеспособные CD3 + клеток → 7: CD4 + клеток → 7а: CD4 + ИФН-γ + клетки (коробка) → 8: CD8 + клетки → 8а: CD8 + IFN-gamma + клеток (коробка)
ПРИМЕЧАНИЕ: Первые 6 указанные регионы иерархии ссылок такие же, как рис 3, (1-6) и последние 2 регионы показаны на рисунке 4 (6-8a).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этом исследовании, автоматизированная клеток обогащение CCS Система была предназначена для автоматизированного производства ЦМВ РР65-специфических Т-клеток. CMV-специфические Т-клетки были обогащены из трех продуктов афереза клеток. Стационарная афереза продукт собирают в течение 2 ч с ЦМВ-серопозитивных донора и генерируется 10 10 Итого ядерных клеток (ТНК). 10 9 ЧПУ активировали ЦМВ РР65 полученных пептидов (60 нмоль) в течение 4 ч, и IFN-gamma секретирующих Т-клеток выделяли с использованием CCS на автоматизированном устройстве по обогащению клеток. Оператор был необходим в начале эксперимента, чтобы загрузить все реагенты и наборы трубок. Настройка системы с начальной распаковки запуском устройства заняли приблизительно 60 до 120 мин. Обратите внимание, что машина может быть запрограммирована, чтобы начать после того, реагенты и наборы трубки загружаются в результате чего устройство для работы без присмотра (например, на ночь). Оператор был необходим еще раз после 15 часов, чтобы выполнить характеристикуконечные продукты для чистоты клеток и жизнеспособности. После обогащения клеточном супернатанте был показан на микоплазму и наличие эндотоксинов. После проверки, обработанные клетки могут вводиться непосредственно в пациентов или криоконсервации для последующего применения.
Подсчет клеток были определены следующие клетку стандартными методами подсчета с помощью формул, приведенных в таблице 2. Каждый тип подсчета клеток повторяли три раза, и результаты выражали как средние общие числа клеток со стандартным отклонением (SD). Отчеты затем анализировали с помощью анализатора клеток рекомендуется использовать программное обеспечение. Память для определения жизнеспособных лейкоцитов и лимфоцитов показано на рисунке 2. Данные по количество клеток представлены в таблице 3. Стратегия стробирования, используемый для определения IFN-gamma + Т-клеток, показан на рисунках 3 и 4. Перед обогащением, то Жизнеспособность клеток была постоянно> 95%. После enrichmenт, жизнеспособность клеток была <50%. Абсолютное кол IFN-gamma + Т-клеток оценивали перед и после процесса обогащения. Общее количество IFN-gamma + Т-клеток, прежде чем обогащение 1.14 × 10 6 ± 0,35 × 10 6 как производные от 10 9 исходного TNC, и после обогащения 3,09 × 10 5 ± 1,70 × 10 5 IFN-gamma + Т-клеток. Были 0,16 ± 0,18% IFN-γ + CD4 + Т-клетки, присутствующие до обработки, и это увеличена до 47,5 ± 34,7% после обогащения. Процент чистоты CD8 + IFN-gamma + Т-клеток перед захватом было 0,47 ± 0,1%, и увеличивается до 90,3 ± 1,7% после обогащения (табл.3 и 4). Восстановление образца в захваченном (положительный) фракции было 32,9 ± 15,7% для CD4 + Т-клеток и 31,8 ± 13,2% для CD8 + Т-клеток, основанный на измерении IFN-gamma + Т-клеток в ГНА rting населения (таблица 4). Эти данные показывают, что и CD4 + и CD8 + CMV РР65-специфические Т-клетки могут быть собраны автоматически в форме, приемлемой для их применения человеческого.
Рисунок 1. Обогащение ЦМВ-специфических Т-клеток с использованием системы CCS. (А) Несколько шагов обработки, участвующие в устройстве по обогащению клеток первого поколения обрабатываются опытными профессионалами. (Б) Большая часть этапов обработки, кроме первоначальной настройки трубки, автоматизированы во втором устройстве клеток генерации обогащения, что экономит 10 - 12 ч время обработки оператора по сравнению с устройством первого поколения. Обогащенные ЦМВ-вирус-специфических Т-клеток характеризуются проточной цитометрии анализатора клеток. > Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Память стратегии используются для определения жизнеспособных Т-клеток. Числа от 1 до 6 указывают на соответствующий домен стробирования иерархии на рисунке. (1) Настройка времени ворота (2) Удаление дублетные клетки путем построения FSC-высота против FSC-области (3) Определение CD45 + клеток, (4) Удаление остатков клеток (5) Выбор жизнеспособных лейкоцитов и (6) реальные лимфоциты коренного населения при окрашивании пропидийиодидом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
нагрузка / 52808 / 52808fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Память стратегия используется для определения CD3 + Т-клеток. Проточной цитометрии блот-анализ CD3 + Т-клетки до (3А) и после обогащения (3B) клеток показано здесь. Очень важно, чтобы определить, сколько CMV-специфический пептид активированных Т-клеток, присутствуют в образцах до и после процесса обогащения. На этой фигуре число от 1 до 6 указывают соответствующую клеточную популяцию либо по размеру или окрашенных с помощью специфических антител. (1) Установка тайм-ворота, (2) Удаление дублет клетки, (3) Выбор CD45 + клеток, (4) Удаление остатков клеток (5) Выбор жизнеспособных лейкоцитов и (6) жизнеспособных CD3 + лимфоцитов. Окрашивание пропидийиодидом была выполнена, чтобы удалить мертвые клетки./52808fig3large.jpg "Целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Память стратегия используется для определения чистоты IFN-gamma + Т-клеток. Активированные CMV-специфические Т-клетки имеют решающее значение для управления ЦМВ инфекции, поэтому IFN-gamma + Выражение на Т-клетках были использованы для стробирования. До обогащения и (б) после обогащения IFN-gamma + Т-клеток среди CD4 + и CD8 + подмножеств (A). (7/8) Процент CD4 + Т-клеток и CD8 + Т-клеток, показанные на А и В (7а. ) Процент CD4 IFN-gamma + Т-клеток + показано в квадратной коробке (а) в зоне литника и аналогично для С D8 + IFN-γ + Т-клетки в (8а). "Т" представляет% клеток в общей численности населения и "#" представляет% клеток в закрытом населения. Окрашивание йодид Пропидиум проводили до ворот отъезда мертвых клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1. Объемы фракций, используемых для окрашивания клеток стратегии.
Таблица 2. Формулы, используемые для расчета CD4 + IFN-gamma + Т-клеток после процесса обогащения. Расчет Т-клеток CD8 + IFN-gamma + выполняется аналогично.
Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой таблице.
Таблица 3. Всего количество клеток в Т-клеточных подмножеств до и после обогащения. Образец # 1 Результаты показаны здесь.
Таблица 4. Чистота и восстановление IFN-gamma + Т-клеток до и после процесса обогащения образца # 1.
Таблица 5. сортировки клеток стратегии, используемые в изоляции клинического сорта ЦМВ-антиген-специфических Т-клеток. 5
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Приемные терапия Т-клеток стала жизнеспособным вариантом для лечения В-клеточных злокачественных новообразований 4. Его терапевтический потенциал зависит от инфузии нужное количество целевой антиген-специфических Т-клеток, которые не имеют репликативной старение 2. Это может быть достигнуто путем выяснения чистой популяции антиген-специфических Т-клеток от расширенных Т-клеток в соответствии с действующими надлежащей производственной практики. Две процедуры сортировки широко используются, а именно, флуоресценции сортировка клеток (FACS) и магнитно сортировка клеток (MACS) для генерации антиген, специфические Т-клетки, как мы рассмотрели недавно 5. Преимущество использования одной стратегии над другой изложены в таблице 5. МАКС технология предлагает самую высокую чистоту обогащению клеток в дешевой и более быстрый способ по сравнению с технологией FACS. Для этого использования одноразовых колонок и реагентов для обогащения клеток полностью препятствует образец загрязнения образца делает егопроще применять в клинических условиях. Полу-автоматический аппарат по обогащению клеток является трудоемким и требует много времени так развитие автоматизированной устройства по обогащению клеток необходимо, чтобы прокормить клиническую спрос.
Автоматизированный клеток CCS обогащение устройство является универсальным инструментом для выделения клеток клинические класса, такие как гемопоэтических стволовых клеток, соматических стволовых клеток, а также Т-клеток для приемных передачи. Эта автоматизированная устройство объединяет обработку клеток, в том числе фракционирования исходного материала, мойки клеток, отделения клеток, клеточной культуры, образования и конечный продукт в одноразовой GMP-совместимый одноразового устройства. Замкнутая система снижает требования чистой комнаты и сводит к минимуму участие оператора для поддержания GMP объектов. Автоматизации сокращает время, необходимое для оператора присутствовать тем самым уменьшая расходы, связанные с этими лабораторных процедур.
Для подтверждения автоматизированного устройства по обогащению клеток, по сравнениюс полуавтоматическим устройством обогащения клеток, мы выделили ЦМВ-специфических Т клеток после инкубации ЦМВ РР65-пептидов с афереза продукта. GMP класс ЦМВ РР65-пептид коктейль (например PepTivator) является бассейн пептид, который состоит в основном из 15-членных пептидов с 11 аминокислот перекрываются, охватывающий весь последовательность белка РР65 цитомегаловируса человека. Образец выход составил ~ 0,3 х 10 6 CD3 + IFN-gamma + Т-клетки из 10 9 ТНК. Клинические исследования показали, что вливая несколько тысяч CMV-специфических Т клеток, как профилактическое лечение для пациентов (~ 360 до 4000 клеток / кг массы тела) проходит ГСК в результате защиты от ЦМВ. Например, для лечения ЦМВ в клинических испытаниях с использованием этой технологии, весом 70 кг взрослого и 30 кг ребенку, по-видимому требует только 0,26 - 3,0 х 10 5 и 1 х 10 4 - 1,2 х 10 5 клеток, соответственно, viral- специфическими Т-клетками 12-15 соавт. 13. Более высокое число жизнеспособных клеток также будет приемлемым, так как это будет связано с достаточно материала для различных вливаний. Тем не менее, более жизнеспособные клетки в целом также означает более чем другие Т-клеток (В, NK, и т.д.) клетки. Наши данные показывают, что ЦМВ-специфических Т-клеток, полученные на автоматизированной системы обогащения клеток в результате клинически привлекательных номеров ЦМВ-специфических Т-клеток, которые затем могут быть проникнуты после аллогенной ТГСК.
ЦМВ-инфекция может быть серьезной проблемой после ТГСК в результате как повышенной заболеваемости и смертности. Кроме того, ЦМВ инфекция связана с увеличением расходов, несмотря на недавний прогресс в ранней диагностике и раннем лечении с антивирусными препаратами 16. В настоящее время лечение с использованием ганцикловир и фоскарнет может привести к токсичности в медицинской хрупких получателей ГСК.Надстройка назад донорских полученных CMV-специфических Т-клеток была продемонстрирована в целях предотвращения и лечения оппортунистических инфекций у реципиентов аллогенной ТГСК от 9. Такой подход к приемному иммунотерапии применяется также, чтобы помочь восстановить иммунитет к другим патогенов, таких как вирус Эпштейна-Барр (EBV), аденовирус 8, и Aspergillus 3 путем инкубации мононуклеарных клеток (МНК) с соответствующим ему антигеном, полученные клинико класса пептид коктейль реагентов ( Материалы и настольные принадлежности в). Недавно исследователи безопасно придают сторонних патогенов специфичные Т-клетки, которые согласованы с, по меньшей мере один HLA-аллеля у реципиента, представляющего иммунодоминантный пептид 17. Автоматизированная система CCS обогащение клеток также может быть использован для создания сторонних Т-клетки для вне-шельфа приложений, которые будут полезны, когда донор ЦМВ-серонегативных или недоступен, например, в случае с донорами для аллогенной пуповинной transplantati кровина.
В заключение, мы демонстрируем полезность автоматическое устройство обогащения клеток генерировать CMV-специфических Т клеток на основе автоматизации CCS. Мы считаем, что это устройство имеет потенциал, чтобы снизить порог для клинических команды, чтобы вселить патоген-конкретным, а также опухоль-специфических Т-клеток, у пациентов с иммунодефицитом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Оба MD Anderson Cancer Center, и доктор Купер иметь финансовую заинтересованность в ZIOPHARM онкологии, Inc., и Intrexon Corporation. 7 мая 2015 года, д-р Купер был назначен главный исполнительный директор ZIOPHARM онкологии. Д-р Купер теперь приглашенный научный сотрудник MD Anderson. Д-р Купер основал и владеет InCellerate, Inc. Он имеет патенты с Sangamo BioSciences с искусственными нуклеаз. Он консультируется с Targazyme, Inc. (ранее американские стволовых клеток, Inc.), GE Healthcare, Ферринг Pharmaceuticals судьба Therapeutics, Janssen Pharmaceuticals, и Bristol-Myers Squibb. Он находится на Научно-консультативного совета французской фирмой Cellectis. Он получает гонорары от Miltenyi Biotec.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer 3 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 700-29 | |
| CliniMACS Prodigy Tubing Set TS 500 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-182 | |
| 5 L waste bag | Miltenyi Biotec GmbH | 110-004-067 | |
| CliniMACS Cytokine Capture System (IFN-gamma) | Miltenyi Biotec GmbH | 279-01 | |
| Albumin (Human) 25% | Grifols | 58516-5216-2 | |
| Luer/Spike Interconnector | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-701 | |
| 0.9 % NaCl Solution (1 L) | Miltenyi Biotec GmbH | ||
| MACS GMP PepTivator HCMV pp65 | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-109 | |
| Water for injections | Hospira, inc, Lake Forest, IL | NDC-0409-4887-10 | |
| MILLEX GV Filter Unit 0.22 μm | Millipore | SLGV033RB | |
| TexMACS GMP Medium 2 L bag | Miltenyi Biotec GmbH | 170-076-306 | |
| Transfer Bag, 150 ml (for cellular starting material) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-018-301 | |
| CryoMACS Freezing Bag 50 | Miltenyi Biotec GmbH | 200-074-400 | |
| 60 ml Syringes, sterile | BD, Laagstraat, Temse, Belgium | 309653 | |
| CMV sero positive apheresis product | Key Biologics, LLC, Memphis | ||
| Flow Cytometry Materials | Manufacturer | Catalog number | |
| AB Serum, GemCell | Gemini Bio-Products, West Sacramento, USA | 100-512 | |
| CD3-FITC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-080-401 | |
| CD4-APC | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-033 | |
| CD8-APC-Vio770 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-065 | |
| CD14-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-072 | |
| CD20-PerCP | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-077 | |
| CD45-VioBlue | Miltenyi Biotec GmbH | 130-098-136 | |
| aIFN-γ-PE, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-940 | |
| CD3-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-091-374 | |
| Propidium Iodide Solution (100 µg/ml) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-093-233 | |
| Equipment | Manufacturer | Catalog Number | |
| CliniMACS Prodigy Device | Miltenyi Biotec GmbH | 200-075-301 | |
| Software V1.0.0.RC | |||
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-343 | |
| Software 2.4 | |||
| Centrifuge 5415R | Eppendorf AG | 22331 | |
| Cellometer K2 | Nexelom Bioscience, Lawrence, MA | LB-001-0016 | |
| Sterile tubing welder SCDIIB | Terumo Medical Corp., Elkton, MA | 7811 |
References
- Syed, B. A., Evans, J. B. From the Analyst's Couch Stem Cell Therapy Market. Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 185-186 (2013).
- Maus, M. V., et al. Adoptive Immunotherapy for Cancer or Viruses. Annu Rev Immunol. 32, 189-225 (2014).
- Kumaresan, P. R., et al. Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), 10660-10665 (2014).
- Singh, H., et al. Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system. Cancer Res. 68 (8), 2961-2971 (2008).
- Kumaresan, P. R., et al. Automating the manufacture of clinically appealing designer T cells. Treatment Strategies-BMT. (1), Available from: http://www.cambridgeresearchcentre.co.uk/all-publications/blood-and-marrow-transplantation/ 55-59 (2014).
- Einsele, H., et al. Adoptive transfer of CMVpp65-peptide loaded DCs to improve CMV-specific T cell reconstitution following allogeneic stem cell transplantation. Blood. 100 (11), 214a-214a (2002).
- Blyth, E., et al. Donor-derived CMV-specific T cells reduce the requirement for CMV-directed pharmacotherapy after allogeneic stem cell transplantation. Blood. 121 (18), 3745-3758 (2013).
- Gerdemann, U., et al. Safety and clinical efficacy of rapidly-generated trivirus-directed T cells as treatment for adenovirus, EBV, and CMV infections after allogeneic hematopoietic stem cell transplant. Mol Ther. 21 (11), 2113-2121 (2013).
- Meij, P., et al. Effective treatment of refractory CMV reactivation after allogeneic stem cell transplantation with in vitro-generated CMV pp65-specific CD8+ T-cell lines. J Immunother. 35 (8), 621-628 (2012).
- Lee Buckler, J. Enal Razvi,. Rise of Cell-Based Immunotherapy : Personalized Medicine Takes Next Step Forward. Genetic Engineering & Biotechnology News. 33 (5), 12-13 (2013).
- Apel, M., et al. Integrated Clinical Scale Manufacturing System for Cellular Products Derived by Magnetic Cell Separation, Centrifugation and Cell Culture. Chem-Ing-Tech. 85 (1-2), 103-110 (2013).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-Cell Therapy of a Lung Transplanted Patient with Severe CMV Disease and Resistance to Antiviral Therapy. Am J Transplant. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Feuchtinger, T., et al. Clinical grade generation of hexon-specific T cells for adoptive T-cell transfer as a treatment of adenovirus infection after allogeneic stem cell transplantation. J Immunother. 31 (2), 199-206 (2008).
- Peggs, K. S., et al. Directly selected cytomegalovirus-reactive donor T cells confer rapid and safe systemic reconstitution of virus-specific immunity following stem cell transplantation. Clin Infect Dis. 52 (1), 49-57 (2011).
- Tischer, S., et al. Rapid generation of clinical-grade antiviral T cells: selection of suitable T-cell donors and GMP-compliant manufacturing of antiviral T cells. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 336 (2014).
- Svahn, B. M., Remberger, M., Alvin, O., Karlsson, H., Ringden, O. Increased Costs after Allogeneic Haematopoietic Sct Are Associated with Major Complications and Re-Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant. 18 (2), S339-S339 (2012).
- Leen, A. M., et al. Multicenter study of banked third-party virus-specific T cells to treat severe viral infections after hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 121 (26), 5113-5123 (2013).
