Live-Imaging af ependymale Cilia i laterale ventrikler af Mouse Brain
Summary
Ved hjælp af høj opløsning kontrast differential interferens (DIC) mikroskopi er en ex vivo observation af det bankende af motile ependymale cilier beliggende inden for de mus hjerneventriklerne demonstreret ved levende billeddannelse. Teknikken tillader en optagelse af den unikke ciliær slagfrekvens og slå vinkel samt deres intracellulære calcium svingning pacing egenskaber.
Abstract
Multiciliated ependymceller linje hjertekamrene i den voksne hjerne. Unormal funktion eller struktur ependymale cilier er forbundet med forskellige neurologiske underskud. Den nuværende ex vivo levende billeddannelse af motile ependymale cilier teknik giver mulighed for en detaljeret undersøgelse af ciliære dynamik efter flere trin. Disse skridt omfatter: mus eutanasi med kuldioxid i henhold til protokoller fra University of Toledos Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC); kraniektomi efterfulgt af hjernen fjernelse og sagittale hjerne dissektion med et vibratome eller skarp kniv til at opnå meget tynde sektioner gennem hjernen laterale ventrikler, hvor ependymale cilia kan visualiseres. Inkubation af hjernens skiver i en tilpasset glasbund plade indeholdende Dulbeccos modificerede Eagles Medium (DMEM) / High-glucose ved 37 ° C i nærvær af 95% / 5% O2 / CO2-blanding er vigtigt at holde vævet i live undereksperimentet. En video af cilier slå derefter optaget med en høj opløsning kontrast differential interferens mikroskop. Videoen analyseres derefter ramme for ramme til at beregne den ciliære bankende frekvens. Dette giver mulighed for præcis klassifikation af de ependymceller i tre kategorier eller typer baseret på deres ciliære bankende frekvens og vinkel. Desuden er denne teknik muliggør anvendelse af højhastigheds-fluorescensimagografi analyse for at karakterisere de unikke intracellulære calcium svingning egenskaber ependymceller samt virkningen af farmakologiske midler på calcium svingninger og den ciliære bankende frekvens. Desuden er denne teknik er velegnet til immunfluorescens billeddannelse til ciliær struktur og ciliære proteinlokalisering undersøgelser. Dette er særlig vigtigt i sygdomsdiagnose og fænotype undersøgelser. Den væsentligste begrænsning af teknikken tilskrives faldet i levende motile cilia bevægelse som hjernevævet begynder at dø.
Introduction
Cilier er sensoriske mikrotubulus-baserede organeller, der strækker sig fra celleoverfladen til det ekstracellulære miljø. Afhængigt af deres mikrotubuli organisation, kan cilier kategoriseres i to typer – "9 + 0" eller "9 + 2". Funktionelt, baseret på deres motilitet, kan disse klassificeres som motile eller ikke-motile cilier 1. Primære cilier er et udtryk, der almindeligvis anvendes til at betegne "9 + 0" ikke-motile cilier. Disse har ni parallelle dublet mikrotubuli (betegnet med '9') og en central par mikrotubuli er fraværende i den centrale kappe (betegnet med '0'). Men nogle "9 + 0" cilier, såsom nodal cilier, som regulerer embryo laterality er bevægelige 2. På den anden side er motile cilier karakteriseret, foruden de ni parallelle mikrotubuli dubletter, ved et yderligere centralt par mikrotubuli dubletter og associeret med dynein motordrevne proteiner for at lette motilitet. Desuden er nogle "9+2 "Cilier, såsom olfaktoriske cilier er ikke-motile 3. Ependymceller beklæder hjernens ventrikler og den centrale kanal af rygmarven er kendetegnet ved motile cilier der fremdrive cerebrospinalvæsken (CSF) langs hjerneventriklerne 4.
Det overordnede mål med denne metode er at gøre det lettere at studere den bevægelige cilia dynamik og strukturelle abnormiteter. Hjernens sundhed og udvikling er stærkt afhængige af en effektiv cirkulation af CSF inden hjerneventriklerne. For eksempel, normal cerebrospinalvæskestrømmen og væskebalance kræver normal slå og funktionel ependymale cilia 5,6, hvilket igen spille kritiske roller i regulering af retningsbestemt bevægelse af neuronale celler og stamceller migration 7. Som sådan unormal ependymale cilier funktion eller struktur kan føre til unormal cerebrospinalvæskestrømmen, som er forbundet med hydrocephalus, en medicinsk tilstand, hvor der er en unormal akkumulering af CSF i ventriklerne af Bregn. Dette kan derfor medføre øget intrakranielt tryk og progressiv udvidelse af hovedet, kramper, tunnel vision, og psykisk handicap 8.
Fordelene ved denne teknik i forhold til eksisterende metoder er, at det er tilladt for første gang til at rapportere tre forskellige ependymale celletyper: I, II, og III, baseret på deres unikke ciliær slagfrekvens og slå vinkel. Disse ependymceller er lokaliseret inden for visse områder i hjernen hjertekamrene. Endvidere kan virkningerne af alder og farmakologiske midler, såsom alkohol og cilostazol på ændring af ependymale celletyper eller deres lokaliseringer påvises, hvilket ikke var muligt før denne klassificering af ependymceller. Cilostazol er en inhibitor af phosphodiesterase-3, et enzym, der nedbryder cAMP til AMP og det regulerer også intracellulært calcium 9. Ved hjælp af high-speed fluorescensimagografi analyse giver billedbehandling og kvantitativ bestemmelse af den unikke intracellulærecalcium svingning egenskaber af de ependymceller. For eksempel, både alkohol og cilostazol signifikant ændret den ependymale ciliære slagfrekvens samt de intracellulære calcium svingninger egenskaber, som igen kan føre til en ændring i den væskeerstatning cerebrospinal volumen ved ependymale cilier 10. Sammenfattende denne teknik var nøglen til at give de første beviser for tre forskellige typer af ependymceller med forskellige calcium svingning egenskaber.
I det følgende afsnit, er et detaljeret trin-for-trin oversigt over proceduren, meget opmærksom på væv forberedelse og håndtering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrevet her er en protokol til fremstilling af muse hjernevæv for både live-billeddannelse og fluorescensmikroskopi, der giver en hurtig og følsom tæt observation af ependymale cilier inden hjerneventriklerne. Denne teknik er ikke begrænset til kun de laterale ventrikel; Det kan bruges til at observere cilia i andre hjerneventrikler. Denne imaging teknik giver en live stream, der ligner bevægelsen af CSF ved ciliær bankende i en ex vivo indstilling. Desuden sætter analyse af retningsbestemt bevægelse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors would like to thank Charisse Montgomery for her editing service. A. Alomran’s work partially fulfills the requirements for a master’s degree in Pharmacology.This work is funded by The University of Toledo’s intramural startup fund for W.A.A and NIH grant (DK080640) for S.M.N.
Materials
| DMEM/HIGH GLUCOSE | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-SP | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-2395 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Fluo-2 | TEF Labs | #0200 | |
| DMSO | |||
| B27 | Gibco | 17504044 | |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1500 | |
| Anti-acetylated a-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T7451 | clone 6-11B1 |
| FITC Anti-mouse antibody | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Culture plate | VWR Vista Vision | 30-2041 | |
| Cover Slip (18×18) | VWR Vista Vision | 16004.326 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | Leica VT1200S | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM1860 | |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon | Nikon TE2000 | 60X oil |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| DAPI filter cube | Chroma Technology |
References
- AbouAlaiwi, W. A., Lo, S. T., Nauli, S. M. Primary cilia: Highly sophisticated biological sensors. Sensors. 9 (9), 7003-7020 (2009).
- Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking kif3b motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
- Satir, P., Christensen, S. T. Overview of structure and function of mammalian cilia. Annual review of physiology. 69, 377-400 (2007).
- Delbigio, M. R. The ependyma – a protective barrier between brain and cerebrospinal-fluid. Glia. 14 (1), 1-13 (1995).
- Genzen, J. R., Platel, J. C., Rubio, M. E. Bordey A. Ependymal cells along the lateral ventricle express functional p2x(7) receptors. Purinergic signalling. 5 (3), 299-307 (2009).
- Appelbe, O. K., et al. Disruption of the mouse jhy gene causes abnormal ciliary microtubule patterning and juvenile hydrocephalus. Developmental biology. 382 (1), 172-185 (2013).
- Sawamoto, K., et al. New neurons follow the flow of cerebrospinal fluid in the adult brain (New York, N.Y.). Science. 311 (5761), 629-632 (2006).
- Banizs, B., et al. Dysfunctional cilia lead to altered ependyma and choroid plexus function, and result in the formation of hydrocephalus. Development. 132 (23), 5329-5339 (2005).
- Kawanabe, Y., et al. Cilostazol prevents endothelin-induced smooth muscle constriction and proliferation. PloS one. 7 (9), e44476 (2012).
- Liu, T., Jin, X., Prasad, R. M., Sari, Y., Nauli, S. M. Three types of ependymal cells with intracellular calcium oscillation are characterized by distinct cilia beating properties. J Neurosci Res. 92 (9), 1199-1204 (2014).
- Chilvers, M. A., O’Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: Comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
- Nauli, S. M., Jin, X., AbouAlaiwi, W. A., El-Jouni, W., Su, X., Zhou, J. Non-motile primary cilia as fluid shear stress mechanosensors. Methods in enzymology. 525, 1-20 (2013).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Survivin-induced abnormal ploidy contributes to cystic kidney and aneurysm formation. Circulation. 129 (6), 660-672 (2014).
- AbouAlaiwi, W. A., et al. Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades. Circulation research. 104 (7), 860-869 (2009).
- Jin, X., et al. Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli. Cell Mol Life Sci. 71 (11), 2165-2178 (2014).
- Praetorius, H. A., Spring, K. R. Bending the mdck cell primary cilium increases intracellular calcium. The Journal of membrane biology. 184 (1), 71-79 (2001).
- Smith, C. M., Radhakrishnan, P., Sikand, K., O’Callaghan, C. The effect of ethanol and acetaldehyde on brain ependymal and respiratory ciliary beat frequency. Cilia. 2 (1), 5 (2013).
