Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

כימות של מתכות כבדות ומזהמים אורגניים אחרים בפרודוקטיביות של מייקרו

Published: July 10, 2015 doi: 10.3791/52936
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Mechanical and Aerospace Engineering, Utah State University

Abstract

יש להגדיל את הביקוש לדלקים מתחדשים חוקרים חוקרים את ההיתכנות של חומר זינה חלופית, כגון מייקרו. יתרונות הגלומים כוללים תשואה גבוהה פוטנציאלית, שימוש בקרקע שאינה ראויה לעיבוד ואינטגרציה עם זרמי פסולת. הדרישות התזונתית של מערכת ייצור מייקרו בקנה מידה גדולה תדרוש הצימוד של מערכות טיפוח עם משאבי פסולת תעשייתיים, כגון פחמן דו חמצני מגז וחומרים מזינים משפכי ארובה. מזהמים אורגניים הנמצאים בפסולת אלה עלולים להוביל לפגיעים מתמשכים ביומסה microalgal להשפיע לרעה על שימוש קצה הפרודוקטיביות והגבלה. מחקר זה מתמקד בהערכה הניסיונית של ההשפעה ואת גורלם של 14 מזהמים אורגניים (כמו, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, SB, Se, Sn, V וZn) על צמיחת סלינה Nannochloropsis . מייקרו עובדו בphotobioreactors המואר ב984 מ 'μmol -2 שניות -1 ומתוחזק ב- pH 7 במ' צמיחהעדיה מזוהמת עם מזהמים אורגניים ברמות צפויות בהתבסס על הרכב שנמצא במערכות גז פליטה הפחם מסחריות. מזהמים הנמצאים ביומסה והבינוניים בסוף תקופת צמיחת 7 יום היו לכמת באופן אנליטי באמצעות ספקטרומטריית קליטה אטומית אדים קרים לHg ובאמצעות ספקטרומטר מסת פלזמה בשילוב אינדוקטיבי כל, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb, SB, Se, Sn, V וZn. תוצאות מראות נ ' סלינה היא זן רגיש לסביבה מרובה מתכת עם ירידה סטטיסטית ביומסה yieldwith ההקדמה של מזהמים אלה. הטכניקות שהוצגו כאן הן נאותות לכימות צמיחת אצות וקביעת גורלם של מזהמים אורגניים.

Introduction

בהשוואה לגידולים יבשתיים מסורתיים מייקרו הוכח להשיג תשואות בשל יעילות גבוהה יותר הגלומה המרת שמש 1,2 גבוהות יותר ביומסה ושומנים בדם. טיפוח של מייקרו בשיעורי פריון גבוהים דורש האספקה ​​של חומרים מזינים שונים, כולל מקור פחמן חיצוני. צפוי כי מתקני גידול בקנה מידה גדולה ישולבו עם זרמי פסולת תעשייתיים כגון גז פליטה תעשייתי על מנת למזער את עלויות ייצור ובו בזמן לספק תיקון סביבתי. פחמן פסולת תעשייתי הוא בדרך כלל בצורה של גזי פחמן דו חמצני ויכול להכיל חומרים מזהמים שיש פוטנציאל להשפיע באופן שלילי ייצור מייקרו. באופן ספציפי, גז פליטה נובע מפחם יהיה מגוון של מזהמים כוללים אך לא מוגבל למים מוצרי בעירה ופחמן דו חמצני, כמו גם תחמוצות גופרית וחנקן, אבק דק, מזהמים אורגניים כגון דיאוקסינים ופורנים, ונגד אי-אורגניtaminants כגון מתכות כבדות. ההשפעה של רוב המזהמים אלה כוללים inorganics עם חלק מהם ידועים כמתכות כבדות על תפוקת מייקרו לא נחקרה. חלק מאלמנטים אלו יכולים להיות חומרים מזינים בריכוזים מתאימים, אולם בריכוזים גבוהים יותר הם יכולים לייצר בעיות בתפקוד תא ואף למוות 3.

השילוב של מייקרו עם גז פליטה תעשייתי יש את הפוטנציאל להציג ישירות מזהמים אורגניים לתקשורת צמיחה. יש גז פליטה מבוססת פחם מגוון רחב של אלמנטים אורגניים (למשל, כ, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, SB, Se, Sn, V וZn) בריכוזים שונים שחלקם, בנמוך ריכוז, מייצגים חומרים מזינים לצמיחת אצות. מזהמים אורגניים יש זיקה גבוהה להיקשר למייקר ועוד יותר להיות sorbed פנימי באמצעות מובילי מזין. כמה מזהמים אורגניים (כלומר, Co, Cu, Zn וMn) הם חומרים מזינים שמהווים חלק מאנזימים כרוךד בפוטוסינתזה, נשימה ופונקציות אחרות 3,4. עם זאת, במתכות וmetalloids עודפות יכול להיות רעיל. אלמנטים אחרים, כגון Pb, Cd, Sn, SB, Se, וכמ"כ, אינם ידועים לתמיכה בתפקוד תא בכל ריכוז ומייצגים מתכות לא מזינים שיכול להשפיע באופן שלילי 3,5,6 צמיחת התרבות. הנוכחות של כל אחד ממזהמים אלה יש הפוטנציאל לייצר השפעות שליליות על תפקוד תאי מייקרו. יתר על כן, האינטראקציה של מתכות מרובות עם מייקרו מסבכת דינמיקת צמיחה ויש לו הפוטנציאל להשפיע על צמיחה.

כלכלה בקנה מידה גדולה נקשרה ישירות לתפוקה של מערכת הטיפוח 7-19. יתר על כן, מחזור בינוני במערכת מייקרו הצמיחה לשתי בריכות פתוחות מסילה (ORP) או photobioreactors (PBR) הוא קריטי שכן היא מייצגת 99.9 ו99.4% מהמסה, בהתאמה 20. הנוכחות של מזהמים אורגניים בתקשורת סופו של דבר עלולה להגביל מ 'פריון icroalgae והמחזור של תקשורת בשל הצטברות מזהם. מחקר זה נקבע באופן ניסיוני את ההשפעה של 14 מזהמים אורגניים (כמו, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, SB, Se, Sn, V וZn), בריכוזים צפויים מהאינטגרציה של מערכות מייקר טיפוח עם פחם נגזר גז פליטה, על הפרודוקטיביות של נ ' סלינה גדלה בPBRs הרכבת האווירית. המזהמים ששמשו במחקר זה הוכחו לא רק בהווה בגז מבוסס פחם ארובה אבל גז פליטה המבוססת על פסולת עירוני, גז פליטה מבוסס biosolids, שפכים עירוניים, מים מיוצרים, מי תהום ומי ים לקוי 21-23. הריכוזים המשמשים במחקר זה מבוססים על מה שניתן היה לצפות, אם מערכות גידול מייקרו שולבו עם מקור CO 2 מבוסס פחם עם יעילות ספיגה הפגינה במערכות PBR מסחריות 20. חישובים מפורטים התומכים בריכוזים של המתכות הכבדות ומזהמים אורגניים מוצגים בNapanet al. 24 טכניקות אנליטיות שמשו להבין את ההפצה של רוב המתכות ביומסה, התקשורת ואיכות הסביבה. השיטות שהוצגו אפשרו להערכת פוטנציאל פריון של מייקרו תחת לחץ מזהם אורגני וכימות של גורל הקצה שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מערכת 1. צמיחה

איור 1

איור 1. מייקרו מערכת צמיחה. () Rotometer אוויר, (ב) CO 2 rotometer, בקר pH (C) עם סולנואיד, נתונים לוגר (ד), (ה) מסנני אוויר, כותרת פיזור אוויר (F), ב- קו (G) בנק אור הניאון, (H) pH מטר, דוד מערכת (I) קירור, (J) אמבט מים, (K) חוט צמד תרמי, photobioreactor מעלית אוויר (L), (ז), (N) ללכת-בקטר מכסה המנוע, מסנני אוויר (O) לפרוק, צינור נימי אספקת האוויר (P), (ש), (R) צינור דגימה, (S) מכסה סיליקון PBR, ו( T)גם pH במכסת סיליקון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. לבנות את המערכת הבאה microalgae הניסיונית גידול (איור 1).
    1. לרכוש עשר PBRs רכבת אווירית בהיקף של כורי שפופרת זכוכית 4.5 סנטימטרים קוטר ו -80 סנטימטרים בגובה, עם קיבולת עיבוד של 1.1 ליטר עם מכסי סיליקון. לרכוש צינורות חתוכים מראש נימי זכוכית (קוטר חיצוני 5 מ"מ וקוטר 1 מ"מ פנימי) של 10 סנטימטר (3 לכל PBR) ו -85 סנטימטרים (1 לPBR) באורך.
    2. להקפיא מכסי סיליקון ב-80 ° C במקפיא. לשמן מקדח עם גליצרול ואילו מכסים קפואים תרגיל 3 חורים לארח את צינורות נימי פורקן, דגימה ואספקת הגז, וחור 1 של 17 מ"מ קוטר לארח בדיקה pH.
    3. הכנס את צינורות נימי 3 במקום עם הצינור הארוך ביותר הארכת 2 סנטימטר מהחלק התחתון של PBR. בצינור נימים האחר להוסיף Wi צינור סיליקוןth צינור נימים מחוברים לקצה האחר הארכה לנקודת דגימה רצויה. לכסות את החור למטר pH עם גודל פקק סיליקון 21 'ד.
    4. ללחלח אוויר סביבה על ידי מבעבע זה דרך מים ולספק אוויר humidified לכותרת פיזור האוויר. להעביר את הגז דרך מסנן 0.2 מיקרומטר ויעביר אותו להשעית האצות באמצעות צינור נימי זכוכית המסירה הארוך ביותר.
    5. לספק CO 2 הדחוס לתוך זרם אוויר humidified על מנת לשמור על pH ניטראלי של 7.0 ± 0.1 בהשעית התרבות. לשלוט בקצב של CO 2 משלוח עם מערכת מרקחת CO 2 אוטומטית (בקר pH) שנפתח סולנואיד מגנטי כאשר תרבות האצות מגיעה pH 7.1 ונסגר ברמת חומציות 6.9.
    6. לספק אור באמצעות 24 נורות פלורסנט T5 שתגרומנה להארה ממוצעת של מטר 984 μmol -2 שניות -1 דומות לשיא תנאים חיצוניים.
    7. לטבול את PBRs באמבט מים כדי מ 'aintain טמפרטורה קבועה של כ -25 מעלות צלזיוס. לשלוט על הטמפרטורה של המערכת על ידי שימוש בילר הסירקולציה המחודשת ויחידת בקרה אוטומטית הסירקולציה המחודשת חימום אמבט מים.
    8. צג טמפרטורה וחומציות בזמן אמת ולהקליט עם נתונים לוגר.
    9. ודא שכל הרכיבים של מערכת צמיחת מייקרו עובדים כמו שצריך, במיוחד לפני קצירת הבידוד מייקרו או הכנת מזהמים אורגניים כפי שהם יכולים לא יישמרו.

2. מעבדה ור הכנה

  1. לשטוף צלוחיות נפח, PBRs, carboys וכל מכולות, עם סבון ומים ברז. לשטוף עם מים ללא יונים (DW).
  2. חומצה לשטוף את כלי המעבדה כדי לחסל את כל עקבות של מזהמים אורגניים. ניתן לעשות זאת על ידי אחת משתי דרכים:
    1. משרים O מעבדה כלי / חומצת N ב 10% חנקן כיתה עקבות מתכת (זהירות: אל אדי נשימה, חומצה חנקתית מרוכזת יכולה לייצר שריפה חמורה ואדי רעילים, עבודה בהו קטרד באמצעות כפפות nitrile, המשקפים וחלוקים).
    2. משרים מעבדה כלי במשך 15 דקות ב -50% חומצה חנקתית כיתה עקבות מתכת.
    3. יש לשטוף את כלי המעבדה עם DW ביסודיות לפחות 3 פעמים כדי לוודא שכל החומצה מוסרת. זה קריטי, כי הם שטופים ביסודיות PBRs, במיוחד צינורות הדגימה וצינורות נימים. אם לא יעשה את זה יהיה לייצר החמצה של העיכוב הבינוני והאפשרי של צמיחה. בדוק את ה- pH של המים השטיפה לאמת את כל החומצה הוסר.
    4. לעקר PBRs, מכולות וצלוחיות ידי המעוקר ב- C ° 120 ולחץ אטמוספרי סטנדרטי עבור לפחות 30 דקות.

3. נ סלינה בינונית הכנה

  1. הכנת פתרון: חלקית למלא בקבוק נפח 1 ליטר עם DW. הכנס בר מערבבים מגנטי ולהוסיף הכימיקלים שמוצגים בטבלה 1 בזה אחר זה. ודא שכל מרכיב מתמוסס לפני התוספת של המרכיב הבא. הסר את המגנט ולמלא הבקבוק דואר לסימן נפח 1 ליטר.
רכיב הסכום להוסיף (ז) ריכוז סופי (ז / L)
H 3 BO 3 0.900 0.900
Na 2 Moo 4 · 2H 2 O 0.012 0.012
MnCl 2 · 4H 2 O 0.300 0.300
4 ZnSO · 7H 2 O 0.060 0.060
4 CuSO · 5H 2 O 0.020 0.020

טבלת 1:. פתרון מתכון כמויות סכומים הדרושים בהכנת 1 ליטר של פתרון מרוכז.

  1. הכנת פתרון ויטמין: בשלושה כרך נפרדצלוחיות umetric להוסיף הוויטמינים, כפי שמוצגים בטבלה 2. מסננים כל פתרון ויטמין דרך פילטר מזרק 0.2 מיקרומטר סטרילי למכל סטרילי. לשמר ויטמינים ב-4 ° C בחושך.
ויטמינים הכמות (מ"ג) נפח סופי (מ"ל) ריכוז ויטמין סופי (מ"ג / ליטר)
ביוטין 12.22 500 24.43
ויטמין B12 13.50 100 135.00
הידרוכלוריד תיאמין 977.63 500 1,955.27

טבלה 2:. מתכון פתרון ויטמין כמויות סכומים הדרושים להכנת solu המרוכזtion.

  1. חלקית למלא מיכל autoclavable 20 L עם DW ולהכניס בר מערבבים מגנטי. מניחים את המכל על גבי צלחת בוחש מגנטית ולהוסיף כימיקלים שמוצגים בטבלה 3 (מלבד הוויטמינים), והוסיף אותם אחד אחרי השני ואחרי כל מתמוסס באופן מלא. מלא את המכל כדי להגיע ל 20
<td> KNO 3
רכיב הסכום להוסיף עד בינוני יחידה
NaCl 350.00 ז
CaCl 2 · 2H 2 O 3.00 ז
KCl 9.60 ז
Na 2 SiO 3 · 9 שעות 2 O 1.14 ז
MgSO 4 · 7H 2 O 29.60 ז
20.40 ז
KH 2 PO 4 1.36 ז
ציטראט ברזל אמוניום 0.10 ז
פתרון 20.00 מיליליטר
פתרון ביוטין * 818.00 μl
פתרון ויטמין B12 * 296.20 μl
פתרון hydrochloride תיאמין * 521.60 μl
* הוסף למקורר תקשורת autoclaved

טבלה 3: נ ' סלינה מתכון בינוני. כמויות הם הסכומים הדרושים בהכנת 20 ליטר של מדיום עשיר בחומרים מזינים.

  1. לעקר את המדיום על ידי מעוקר למשך 30 דקות ב 120 מעלות צלזיוס ובלחץ אטמוספרי. בואו COO הבינוניl עד RT.
  2. מניחים את המכל על צלחת stirrer מגנטית. להוסיף הוויטמינים מוכנים בשלב 3.2 ולתת התערובת בינונית ביסודיות.

4. מזהמים אורגניים הכנת מניות

  1. חלקית למלא את צלוחיות נפח מצויינים בטבלה 4 עם DW ולהוסיף מלח הבודד ברשימה. מלא עם DW לנפח הסופי הנדרש ומערבבים היטב. אל לשמר מניות אלה כחלק מרכיבים לספוג לבקבוקון קירות
    זהירות: מספר מזהמים אורגניים בשימוש בפרוטוקול זה הם מסרטנים, טרטוגניות וmutagenic, ללבוש מסיכה, כפפות ומעייל מעבדה בעת טיפול במלחים.
אנליטי מקור מלח נפח של המניה להכין (L) מלח להוסיף לבקבוק60; (מלח מ"ג) ריכוז אנליטי הוסיף לתרבות (אנליטי מ"ג / ליטר)
כ NaAsO 2 0.1 14.8 7.74E-02
CD CdCl 2 0.5 13.5 1.50E-02
שיתוף CoCl 2 .6H 2 O 0.5 34.7 1.56E-02
Cr Na 2 Cr 2 O 7 · 2H 2 O 0.1 40.6 1.29E-01
Cu CuCl 2 .2H 2 O 0.1 38.3 1.30E-01
Hg HgCl 2 1.0 14.6 9.80E-03
Mn MnCl 2 .4H 2 O 0.1 58.8 1.49E-01
ניקל NiCl 2 .6H 2 O 0.1 112.0 2.51E-01
Pb PbCl 2 0.5 39.9 5.41E-02
Sb Sb 2 O 3 0.5 26.7 4.06E-02
Se Na 2 SEO 3 0.5 11.8 9.80E-03
Sn SnCl 2 .2H 2 O 0.5 3.9 3.76E-03
V V 2 O 5 0.1 22.2 1.13E-01
Zn ZnCl 2 0.1 99.9 4.36E-01

לוח 4:. הכנת מניית מזהמים אורגנית מרוכזת תוספת של 1 מיליליטר של המניה מרוכזת זה למדיום PBR 1.1 L מייצר ריכוז הסופי מוצג בטור האחרון.

  1. לעקר את המניות המזהמים אורגניות על ידי עובר את הפתרון דרך פילטר מזרק 0.2 מיקרומטר סטרילי ולאסוף התסנין בצינור סטרילי.

5. נ סלינה הבידוד ההפקה

  1. בבקבוק 500 מיליליטר Erlenmeyer להוסיף 200 מיליליטר של מדיום מוכן בשלב 3 ולאחר מכן להוסיף 3 גרם של אגר. מכסה את הבקבוק בנייר אלומיניום וחיטוי במשך 20 דקות ב 120 מעלות צלזיוס. יוצקים את הפתרון לפטרי-מנות סטרילי ולתת לו מגניב עד שמתמצק. זה אמור להסתיים להיות מכסה המנוע סטרילי או לפחות ליד להבה בסביבה נקייה כדי להפחית את הסיכון לזיהום.
  2. נ 'הפס תאי סלינה בפטרי-דיס סטריליהס מוכן בשלב 5.1 באמצעות זריעת לולאת סטרילי. מניחים את תרבויות צלחת פטרי, על שולחן מואר באורות T12 שמרו על RT. בואו מייקרו לגדול עד מושבות גלויות.
  3. העברת מושבות לסטרילי מבולבלות צלוחיות Erlenmeyer המכילות 200 מיליליטר של מדיום עשיר מזין מוכן בשלב 3 ולשמור אותם על שולחן מואר שייקר (1,000 סל"ד). בואו התרבות לגדול עד בינוני הופך ירוק.
  4. העבר את microalgae לPBR סטרילי 1.1 L. מניחים את PBR באמבט מים הבידוד המואר ב 200 מ 'μmol -2 שניות -1 עם אורות ניאון T8 ומתוחזק על 23 מעלות צלזיוס בילר הסירקולציה המחודשת ושליטת אמבט מים הסירקולציה המחודשת חימום אוטומטי. התאם את האוויר ו -2 rotometers CO 2.5 L דקות -1 ו -25 סמ"ק דקות -1, בהתאמה.
  5. אחרי שבוע של ביומסה צמיחת הפיצול לPBRs L חדש 1 .1 המכיל מדיום חדש ולתת לו לגדול עד סך של לפחות 28 גרם של ביומסה המשקל היבשהושג בין שני הכורים שניתן לקבוע באמצעות צפיפות אופטית.
  6. קציר ביומסה הבידוד על ידי צנטריפוגה ב2,054 × גרם במשך 15 דקות ב 10 מעלות צלזיוס באמצעות בקבוקי צנטריפוגות סטרילי וטכניקות סטרילי כדי למנוע זיהום. השלך את supernatant ולהמשיך ריכוז תא לפי צורך.
  7. ברגע שכל ביומסה היא centrifuged, מחדש להשעות את התאים 300 מיליליטר של מדיום סטרילי הטרי.
  8. לדלל 0.1 מיליליטר של תרבות microalgal ב 3 מיליליטר של DW ואז לדלל 0.1 מיליליטר של פתרון חדש זה ב 3 מיליליטר של DW. ודא המדגם הוא מעורב באופן יסודי. מדוד את הצפיפות האופטית (OD) של תרכיז האצות ב 750 ננומטר () באמצעות מייד ספקטרופוטומטר.
  9. השתמש משוואה (1) כדי לקבוע את הסכום של ביומסה בתרכיז.
    הערה: משוואה (1) התקבל מרגרסיה ליניארית בין לעומת מוצקים מרחפים כולל (בג '/ -1 L) לנ סלינה (R 2 = .9995). משוואת 1 פותחה עבור spectrophotometer מודל בלוח חומרים, ליצור כיול חדש אם באמצעות מודל ספקטרופוטומטר אחר.
    1. שימוש במשוואה (2) לחשב את הנפח של תרכיז אצות (בL) דרושה כדי להשיג צפיפות 4 g / L -1 תרבות בנפח של 1.1 ליטר PBR (בL).

משוואת 1

משוואה 2

  1. באמצעות שימוש בטכניקות סטרילי, להוסיף הנפח של מייקרו להתרכז נמצא בשלב 5.9 לPBR autoclaved להגיע צפיפות תרבות ראשונית של 4 גר '/ L -1. מלא PBR עם מדיום ל -1.1 ל 'חזור על פעולה זו עד 6 PBRs הם מחוסן. מניחים את PBRs באמבט המים הבידוד.
  2. בואו microalgae בPBRs לגדול במשך 8 ימים ולאחר מכן לקצור את ביומסה (על ידי צעדים חוזרים על 5.6-5.7). חזור על שלב 5.8 לחישוב הראשוניהבידוד נפח לצפיפות תרבות ראשונית של L -1 / 1 גרם.

6. כורים ניסיוניים

  1. טכניקות סטרילי באמצעות להוסיף כ 1 ליטר של המדיום מוכן בשלב 3 לכל אחד מPBRs סטרילי-שטף החומצה 12. מניחים את PBRs באמבט המים של מערכת הצמיחה הניסיונית. הפעל אוויר מניד בב 1.5 L דקות -1.
  2. לעקר מטר pH מכויל על ידי ניקוי אותו עם 70% אתנול. למדוד את ה- pH של המדיום בPBR ולהבטיח pH הוא כ 7.0; אם לא, חזור על שלב 2 כדי להסיר חומצה דלפו מהצעד שטיפת החומצה.
  3. לכייל כל בקר pH באמצעות חיץ pH 7, לחטא את הבדיקות באמצעות אתנול (70%) ולאחר מכן להכניס אותם במכסי PBRs.
  4. לכל PBR (למעט PBRs השליטה) להוסיף 1 מיליליטר של כל אחד ממזהמים אורגני המניות סטרילי מוכנות בשלב 4. תנו המזהמים ומערבב היטב בPBR. הריכוז הסופי של המזהמים אורגניים בPBRs הוא מופעn בעמודה האחרונה בטבלה 4, והריכוזים מרביים המשוערים צפויים משילוב תחנת כוח פחמית.
  5. להוסיף 14 מיליליטר של DW סטרילי לPBRs השליטה.
  6. הוסף את הבידוד microalgae המרוכז שהושג בשלב 5.11 לPBRs הניסיוני כדי להשיג צפיפות תרבות ראשונית של L -1 / 1 גרם. בואו תערובת ביומסה ביסודיות.
  7. הפעל אורות גבוהים אור אינטנסיביות (של 984 מ 'μmol -2 שניות -1) ו- pH בקרים ובלהתאים CO 2 לדקות 30 סמ"ק 1. להגביר את זרימת CO 2 לדקות 50 סמ"ק -1 מיום 3 לאחר מכן. קצב זרימה נמוך ראשוני CO 2 הוא קריטי על מנת למנוע שינויים גדולים בpH בשל עיכובים בגז / העברת נוזל ומדידת pH.
  8. למדוד ולקחת דגימות בהתאם לצורך. הקפד לסמן את מפלס המים לאחר דגימה. (זהירות: כמה מזהמים אורגניים בPBR הם מסרטנים, טרטוגניות וmutagenic; כפפות שימוש וCAPPמכולות אד בעת טיפול בדגימות).
  9. להוסיף DW סטרילי יומי לPBRs כדי לפצות על הפסדים בשל התאדות.
  10. לאחר 7 ימים של צמיחה, לקצור את ביומסה על ידי צנטריפוגה ב9936 × גרם ולשמר את שניהם, בינוני ביומסה וsupernatant, ב -80 מעלות צלזיוס.
  11. להקפיא לייבש את ביומסה על 0.1 mbar ו-50 CO ° / N. אבקת ביומסה (להשתמש במרית ביומסה אבקה בתוך צינור צנטריפוגות). לשמר ביומסה מיובשת בהקפאה ב -80 מעלות צלזיוס.

7. מיקרוגל סיוע עיכול של דוגמאות

העיכול של הדגימות ביומסה נדרש כצעד עיבוד מראש לניתוח ICP-MS.
הערה: שלבים אלה להשתמש במערכת עיכול מיקרוגל כלי סגורה בהקלה לחץ מבוקרת. (זהירות: לחצים גבוהים לפתח במהלך עיכול חומצה, לבדוק את שלמות הגוף של כלי העיכול ומגינים, ולעצב מחדש את מכסי כלי עיכול מיקרוגל לפני כל שימוש).

  1. כלי עיכול מיקרוגל לשטוף טפלון עם מים וסבון, לשטוף עם DW ולתת כלי אוויר יבש. כדי להסיר זיהום מתכות קורט בכלי לעכל חומצה כפי שמתוארת בשלבים הבאים.
  2. לעצב מחדש את מכסי כלי עיכול מיקרוגל ולסגור את הבקבוקונים בחוזקה.
  3. להוסיף 10 מיליליטר של חומצה חנקתית לכל אחד.
  4. להציג את הכלי במגן הבטיחות. ודא שאין ביומסה, מים או כל ריאגנטים נותרים על קירות מגן הבטיחות או בקירות החיצוניים של כלי העיכול כדי למנוע נזק למגן הבטיחות. כובע מגן הבטיחות עם שסתום הבטיחות לוודא האביב בבקבוקון זה לרוקן. אתר את המגן על הרוטור עם פתחי אוורור הכובע מצביעים החוצה בשורה החיצונית ופנימה בשורה הפנימית.
  5. על מספר כלי אחד, הכנס את thermowell הקרמיקה וחיישן הטמפרטורה. מדחום זה מנטר את הטמפרטורה הפנימית בפועל בבקבוקון ומשמש כפרמטר השליטה לבצע progr העיכולאני. ודא שמספר בקבוקון אחד מכיל את אותו מדגם ומגיב סכומי הבקבוקונים האחרים.
  6. הפרמטרים עיכול הקלט מוצגים בטבלה 5 ולהתחיל עיכול. כאשר התכנית הסתיימה, האוויר לקרר את הבקבוקונים עד שהם מגיעים RT.
שלב בקבוקוני שטיפה עיכול לדוגמא
טמפרטורה (° C) זמן (דקות) מקס. כוח (W) טמפרטורה (° C) זמן (דקות) מקס. כוח (W)
1 RT 190 25 1,000 RT 180 15 1,000
2 190 10 1,000 180 15 1,000
- 20 - - 20 -

לוח 5: פרמטרים המשמשים בתכנית עיכול מיקרוגל.

  1. בתוך מנדף, להכניס את כלי ההקלה לחץ על כובע מגן עם פתחי אוורור הכובע להצביע ממך. ברגע שהלחץ משתחרר פתוח הכובע (זהירות: בקבוקונים מתעכלים תמיד פתוחים בתוך מנדף מאז עיכול ביומסה באמצעות חומצה מייצרת אדים רעילים).
  2. השלך את החומצה. יש לשטוף את כלי הטפלון עם DW 3 פעמים. בואו בקבוקוני אוויר יבש.
  3. לעיכול ביומסה, להוסיף 50 מ"ג של ביומסה הקפאה מיובשת לכלי עיכול מיקרוגל. לבקרת איכות (QC) להכין את הבקבוקונים הבאים: בשני בקבוקונים שונים להוסיף או 5 מיליליטר של רמת 7 ICPMS או 5 מיליליטר של רמה סטנדרטית 7 Hg CVAAS מוכן בצעדי 9.1 ו -10.1 (הפתרון מתעכל מבקבוקון זה נקרא המעבדה מבוצרת ריק (LFB)), לעזוב נוסף (פתרון מתעכל ריק בקבוקוןמבקבוקון זה נקרא מגיב המעבדה ריקה (LRB)).
  4. לעכל בינוני, להוסיף 10 מיליליטר בינוני supernatant לייבוש כלי עיכול מיקרוגל חומצה שטפה. לבקרת איכות (QC) להכין את הבקבוקונים הבאים: בשני בקבוקונים שונים להוסיף 5 מיליליטר של רמת 7 ICPMS או סטנדרטי מתכת CVAAS מוכנה בשלב 9.1 ו10.1 (הפתרון מתעכל מבקבוקון זה נקרא LFB), למשנהו בקבוקון להוסיף 10 מיליליטר של DW (הפתרון מתעכל מבקבוקון זה נקרא LRB).
  5. לעצב מחדש את מכסי כלי עיכול מיקרוגל ולסגור את הבקבוקונים בחוזקה.
  6. להוסיף 7 מיליליטר של חומצה חנקתית כיתה מתכת עקבות מרוכזות ו -3 מיליליטר מי חמצן לכל בקבוקון. Homogenize התוכן בעדינות על ידי מתערבל הפתרון. לעכל את התוכן של הבקבוקונים ידי חזרה על שלבי 7.4-7.7 (השתמש בפרמטרי עיכול מיקרוגל לעיכול מדגם בלוח 5).
  7. להוסיף מדגם מתעכל בבקבוק נפח 25 מיליליטר, שטיפת כלי עם DW להתאוששות מוגברת. מלא את בקבוק volumetric עם DWלסימן.
  8. העברה מתעכל דגימות למכל כתרים. לשמר דגימות ב 4 מעלות צלזיוס עד ניתן להשלים ניתוח. לניתוח מחקר זה נעשה באותו היום לHg ובתוך שלושה ימים לאלמנטים האחרים.

8. בקרת איכות דוגמאות (QC)

הערה: ניתוח דגימות QC כדי להבטיח אמינות של התוצאות מדגימות ניסוי.

  1. חלקית למלא חומצה שטפה בקבוק נפח 1 ליטר עם DW. להוסיף 280 מיליליטר של חומצה חנקתית מרוכזת עקבות כיתה מתכת ומערבבים היטב (פתרון זה נקרא גם הפתרון הריק) (זהירות: תמיד להוסיף חומצה למים, לא להוסיף מים לחומצה כתגובה אקסותרמית יכולה להיות אלימה). בואו פתרון מגניב RT.
  2. בנוסף לדגימות QC מוכנות בצעדים 7.9 ו7.10, להכין את דגימות QC הבאות.
    1. לאימות כיול ההמשך (CCV): מלא צינור קלקר עם תקן כיול (להכנה לראותצעד 9.2 ו -10.1). שים את הפתרון הסטנדרטי כספית על מדף CVAAS וICPMS פתרון סטנדרטי בautosampler ICPMS.
    2. לכיול ממשיך ריק (CCB): מלא שני צינורות פוליסטירן (16 מיליליטר) עם ריק (הפתרון מוכן בשלב 8.1). מניחים דגימה אחת במעמד CVAAS ומדגם האחר בautosampler ICPMS.
    3. למטריקס מועשר במעבדה (LFM): באופן אקראי לבחור מדגם 1 מכל 12 דגימות לכל סוג של מדגם (כלומר, ביומסה או בינוני) ולהשתמש בו כדי להכין LFM. לICPMS, להוסיף 0.5 מיליליטר של ICPMS רמה סטנדרטית 7 ו -3 מיליליטר של מדגם ניסיוני מתעכל (משני ביומסה או בינוני) לצינור קלקר.
    4. מערבבים את התוכן ולמקם את הבקבוקונים בautosampler ICPMS. לCVAAS, להוסיף 2 מיליליטר רמת Hg סטנדרטי 7 ו -6 מיליליטר של מדגם ניסיוני מתעכל (משני ביומסה או בינוני) לצינור קלקר. מערבבים תוכן ובקבוקוני מקום על מדף CVAAS.
    5. לדגימות הכפולות: באופן אקראי לבחור מדגם 1 של פעםy 12 דגימות לכל סוג של מטריקס (למשל, ביומסה, בינוני, LFM או כל מטריצה ​​בדילול) ולשכפל את הבקבוקון. מניחים את הבקבוקונים חזרו בautosampler ICPMS או מדף CVAAS.
    6. לדגימות הכפולות: באופן אקראי לבחור מדגם 1 מכל 12 דגימות לכל סוג של מטריקס (למשל, ביומסה, בינוני, LFM או כל מטריצה ​​בדילול) ולשכפל את הבקבוקון. מניחים את הבקבוקונים חזרו בautosampler ICPMS או מדף CVAAS.
  3. הגדר את קריטריוני איכות נתונים למחקר. לצורך המחקר הנוכחי לשכפל את קריטריוני האיכות שנקבעו על ידי איטון, Clesceri, רייס וגרינברג 25. הפרמטרים שנקבעו לQC הם: הבדל אחוזים (% D) לCCV בתוך ± 10% 25 (עם חריג של Pb וSb, ראה דיון), התאוששות אחוזים LFB (R%) בתוך ± 70-130% 25, אחוזים LFM התאוששות (R%) בתוך 75-125% 25, והבדל אחוזים יחסי (RPD) בתוך ± 20% 25, וממשיך CAlibration הריק (CCB) מתחת לגבול דיווח שיטה (MRL) 25. ראה משוואות חישוב בשלב 9.7.

9. כימות על ידי מצמידים אינדוקטיבי פלזמה ספקטרומטריית מסה (ICPMS)

  1. ביום של ניתוח, להעביר כ 5 מיליליטר של מדגם מתעכל לצינורות קלקר ולמקם אותם בautosampler ICPMS. להוסיף כ 15 מיליליטר של דגימות מתעכלים לצינורות קלקר ולמקם אותם במעמד CVAAS.
  2. באותו היום של ניתוח להכין את הסטנדרטים הכיול. להוסיף ICPMS רכש פתרון סטנדרטי ולמלא עם ריק (פתרון מוכן בשלב 8.1) כפי שמתוארים בטבלה 6 (ראה תיאור סטנדרטי פתרון בחומר טבלה) לצלוחיות נפח-שטף חומצה.
פרמטר רמת 1 רמה 2 רמה 3 רמה 4 רמה 5 רמה 6 רמה 7
סטנדרטי שנרכש ליתווסף (מיליליטר) - - - - - - 10.0
רמת 7 שתתווסף (מיליליטר) 0.0 1.0 2.5 5.0 20.0 25.0 -
* סופי נפח (מיליליטר) - 50.0 50.0 50.0 100.0 50.0 100.0
ריכוז סופי (מיקרוגרם / ליטר)
75 כ 0.0 2.0 5.0 10.0 20.0 50.0 100.0
111 Cd 0.0 1.0 2.5 5.0 10.0 25.0 50.0
59 Co 0.0 10.0 25.0 50.0 100.0 250.0 500.0
52 Cr 0.0 2.0 5.0 10.0 20.0 50.0 100.0
63 Cu 0.0 5.0 12.5 25.0 50.0 125.0 250.0
55 Mn 0.0 3.0 7.5 15.0 30.0 75.0 150.0
60 ניקל 0.0 8.0 20.0 40.0 80.0 200.0 400.0
208 Pb 0.0 1.0 2.5 5.0 10.0 25.0 50.0
121 Sb 0.0 12.0 30.0 60.0 120.0 300.0 600.0
51 V 0.0 10.0 25.0 50.0 100.0 250.0 500.0
66 Zn 4.0 10.0 20.0 40.0 100.0 200.0
* להשיג ספר זה על ידי הוספת הפתרון מוכן בשלב 8.1

לוח 6: ריכוז של סטנדרטים כיול רמות 1 עד 7..

  1. הסר את הקונוסים מICPMS וsonicate דקות 1 בDW. ייבש את האצטרובלים ולהחזיר אותם במכשיר.
  2. הפעל את Chiller המים, גזים (Ar, H 2, הוא), ICPMS, קווי תקע לתקן פנימי, ולמלא את מיכל שטיפה האוטומטי סמפלר (DW, 10% חומצה חנקתית, 1% חומצה חנקתית + 0.5% חומצה הידרוכלורית) .
  3. פתח את תוכנת תחנת העבודה Masshunter ולהדליק את הפלזמה, מנגינת ICPMS ולטעון את השיטה להגדיר פרמטרים בטבלה 7.
לוח 7: תנאי הפעלה ICPMS.

  1. הנח סטנדרטי כיול, דגימות QC ודגימות ניסוי בautosampler. בתוכנת ICPMS להוסיף את רצף הניתוח ולנתח דגימות. לשאוב הדגימה בתוך המכשיר לפלזמה שבו האלמנטים מיוננים. אז ואקום ייסוג היונים לדלפק. היונים יפרידו בהתאם למשקל האטומי שלהם מהקל אל הכבד.
    זהירות: איסוף פסולת ICPMS בבלימה מסוכנת ולטפל כראוי לרשות.
  2. ודא שערך מקדם מתאם (R) לעקומת הכיול עבור כל מתכת או מתכות למחצה הוא גדול יותר מ.995 24.
  3. במהלך ניתוח מדגם, לחשב% R,% D וRPD כמתואר במשוואות 3-6 26 ולהשוות את התוצאות לקריטריוני איכות נתוני פרויקט ב8.3.
    1. לחשב התאוששות אחוזים (% R) כדי לקבוע הפסדים / צובר מבלה המעבדה המבוצרתnk (LFB) ומטריצת הפרעות ממטריצה ​​מועשרת במעבדה (LFM).

משוואה 3

משוואה 4

  1. לחשב הבדל אחוזים (% D) כדי לקבוע שינויי ביצועי מכשיר עם זמן בעת ​​הפעלת דגימות CCV.

משוואה 5

  1. לחשב הבדל ביחס אחוזים (RPD) כדי לקבוע שינויים בשיטת דיוק עם זמן בעת ​​הפעלת דגימות ניסוי.

משוואה 6

  1. כדי להפחית הפרעות מטריצה ​​(R% מחוץ לטווח מקובל), לדלל את הדגימות למחקר% עניים ליחס 1: 3 (לדוגמא: DW).
  1. הכן סטנדרטים כיול באותו היום של ניתוח. לדלל סטנדרטי כספית שנרכש על ידי הוספת 1 מיליליטר של תמיסה סטנדרטית כספית שנרכשה בבקבוק נפח 100 מ"ל ולמלא עם הפתרון מוכן בשלב 8.1.
    1. להוסיף 2.5 מיליליטר של פתרון זה לתוך בקבוק נפח 100 מיליליטר ולמלא עם הפתרון מוכן בשלב 8.1 (פתרון חדש זה הוא רמה 7 סטנדרטי כספית). להוסיף סטנדרטי Hg רמת 7 מדוללים לצלוחיות נפח ולמלא עם ריק (פתרון מוכן בשלב 8.1.) כפי שמתואר בטבלה 8 (ראה תיאור רכש כספית סטנדרטי פתרון בחומר טבלה).
פרמטרים ערכים
סטנדרטים פנימיים 72 Ge, 115 ב
כוח RF 1500 W
זרימת גז שיעור פלזמה 14.98
קצב זרימת גז nebulizer / Min 1.1 L (גז מוביל ודילול בשילוב - 0.6 + 0.5 L / min)
קונוס דגימה ניקל לעדשת x
קונוס הרחפן ניקל
שיעור ספיגת מדגם 0.3 RPS
משאבת nebulizer 0.1 RPS
S / C טמפרטורה 2 מעלות צלזיוס
מצב סריקה להתעכב זמן 1 שניות, מספר לשכפל 3
זרימת גז 2 H N /
הוא זרימת גז 4.3 מיליליטר / דקה
פרמטר רמת 1 רמה 2 רמה 3 רמה 4 רמה 5 רמה 6
סטנדרטי L7 כספית שיתווסף (מיליליטר) 0 1 2.5 5 20 25
* סופי נפח (מיליליטר) - 50 50 50 100 50
ריכוז סופי (מיקרוגרם / ליטר) 0 0.5 1.25 2.5 5 12.5
* להשיג ספר זה על ידי הוספת הפתרון מוכן בשלב 8.1

לוח 8: ריכוז של תקן כיול כספית רמות 1 עד 6..

  1. פתח את גז Ar ושסתום אוויר, להפעיל את ההתעסקות האטומיתtion ספקטרופוטומטר והזרקת זרימת ספקטרוסקופיה האטומית (FIAS). פתח את תוכנת CVAAS Winlab, להדליק את המנורה כספית ולתת לו להתחמם עד פרמטר האנרגיה של התוכנה מגיע 79. טען את התכנית לניתוח כספית עם הפרמטרים בלוח 9. התאם את נתיב האור במכשיר לתת העברה המרבית.
פרמטרים ערכים
גז מוביל ארגון, 100 מיליליטר / דקה
מנורה מנורה הפריקה electrodeless כספית, התקנה ב185 mA
אורך גל 253.7 nm
חריץ 0.7 ננומטר
טמפרטורת תא 100 מעלות צלזיוס
נפח דגימה 500 μl
מוביל 3% HCl, 9.23 מיליליטר / דקה
Reductant 10% SnCl 2, 5.31 מיליליטר / דקה
מדידה גובה שיא
קראו משכפל 3

לוח 9: תנאי הפעלה CVAAS.

  1. חבר את הקו לפתרון המוביל עשויים 3% חומצה הידרוכלורית כיתה עקבות מתכת.
  2. חבר את הקו לפתרון סוכן צמצום עשוי 10% כלוריד בְּדִילִי (מתאים לניתוח Hg) בחומצה הידרוכלורית 3% כיתה עקבות מתכת. הכן את הפתרון הזה באותו היום של ניתוח כפי שהוא נוטה חמצון אטמוספרי (זהירות: כלוריד בְּדִילִי הוא מאוד מסוכן, להשתמש ללבוש מגן בעת ​​עבודה עם אותו לאסוף את פסולת CVAAS בבלימה מסוכנת ולהיפטר כראוי.).
  3. מניחים את הסטנדרטים כספית, דגימות QC ודגימות ניסוי במעמד CVAAS וקלט הרצף בתוכנת CVAAS Winlab. הפעל סטנדרטים וליצור משוואת הכיול.
  4. הפעלת QC סםPles ודגימות ניסוי. CVAAS שואב כ 5 מיליליטר של דגימה לתוך המכשיר, מפחית את ההווה כספית במדגם לHg יסודות (Hg 0) גז ומטהר את הגז מפתרון עם גז (Ar) מוביל במערכת סגורה. האדים כספית עוברים דרך תא בנתיב אור המנורה כספית. גלאי קובע את האור נספג ב253.7 nm וקושרת אותו לריכוז. (זהירות: האדים כספית רעילים, להבטיח קולט אדים מכשיר נמצא במקום).
  5. לחשב% R,% D וRPD בשלב 9.7 במהלך הניתוח ולהשוות את התוצאות לקריטריוני איכות נתוני פרויקט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תשואות ביומסה

ייצור של נ ' סלינה גדלה במערכת PBR שימשה במחקר זה מז 1 / L -1 ל -8.5 ± 0.19 g / L -1 (N = 12) לכורי שליטה ו± 4.0 L / 0.3 G -1 (N = 12) ל רב-מתכת מזוהמת ב -7 ימים. הניסויים מיוצרים נתונים הדיר פני כורי שלושה עותקים וקבוצות מרובות. איור 2 א מציג את צפיפות התרבות הממוצעת עם סטיית תקן קטן מאוד המבוסס על דגימה משלוש PBRs העצמאי. כדי להבטיח תוצאה זו לא הייתה תוצאה מבודדת, עוד שלוש קבוצות גדלו עם תוצאות דומות. התוצאות המשולבות לכל ארבעת קבוצות מוצגות באיור 2. למרות שונות ביולוגיות קיימים, מחקר זה מראה שיש השפעה שלילית עקבית של מזהמים אורגניים לנ ייצור סלינה. התשואות ביומסה בPBRs המזהם נחשף היו שונות מבחינה סטטיסטית לPBRs השליטה מיום 2 ואילך (ANOVA, p <0.05).

הערכת בקרת האיכות של כימות זיהום אורגניות

השנים-עשר של האלמנטים ארבעה עשר ניתחו באופן מלא היו ההשבה לאחר העיכול כפי שמוצגים על ידי R% LFB עם% R ליד 100%, מה שמצביע אין הפסדים, אין רווחים ולא זיהום צולב של analytes במהלך עיכול (לוח 10). במהלך ניתוח כמותי של D% דגימות וRPD נוטרו בכל הניתוח והממוצע של התוצאות מוצגים בלוח 10. כ, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, SB, V וZn עברו D% וRPD, לעומת זאת D% לPb וSb ירד בהדרגה במהלך הניתוח. D% למרכיבים אלה השתפרו לאחר ניקוי קונוס, לעומת זאת, ניקוי קונוס קבוע הוא לא מעשי, ולכן מטרות איכות נתונים לPb וSb הופחתו. CCB לכל analytes היה גם מתחת לMRL. אפקטי מטריקס הוערכו על ידי ניתוח דגימות LFM וקבלת% R. While Co, Hg, V וSb עברו את קריטריוני נתונים QC, זה לא היה עבר על ידי כ, Cd, Cr, Cu, Mn, Ni, Pb ו Zn כאשר דגימות ביומסה מתעכלים נותחו, וכתוצאה מכך R% מתחת למטרות QC. דילול מטריקס בDW ליחס של 1: 3 (מומס: ממסים) הביא% R שעבר קריטריוני איכות הנתונים. אפקטי מטריקס גם נצפו במהלך ניתוח supernatant מתעכל וטופלו על ידי אותו יחס הדילול (לוח 10) לוודא הדילול לא התפשר גבול הגילוי של המכשיר. בעיות עם זיהוי של Se וSn נצפו המבוססות על קריאה לא יציבה ונושא זיהום, בהתאמה. הקריאה לא יציבה לSe מיוחסת למלחים במטריצה ​​27. זיהום Sn היה נעוצים חומצה משמשת בשלב העיכול.

אנליטי R CCV LFB LFM לדגימות ביומסה LFM לדגימות supernatant
% D % R יחס דילול % R RPD יחס דילול % R RPD
QC מגביל 25 .9950 ± 10 70-130 - 75-125 ± 20 - 75-125 ± 20
כ .9998 1.8 101.0 1: 3 100.4 5.2 1: 3 92.5 -0.5
CD 1.0000 1.4 102.6 1: 3 103.5 4.6 אין 92.3 0.6
שיתוף .9997 1.7 98.8 אין 95.2 -1.4 אין 96.5 -1.5
Cr .9999 1.5 99.8 1: 3 96.5 1.8 1: 3 90.1 -0.8
Cu .9999 2.9 98.2 1: 3 101.4 4.8 1: 3 94.4 -0.5
Hg .9983 -1.7 103.0 אין 98.7 1.5 אין 98.0 0.3
Mn .9998 2.9 97.6 1: 3 83.2 1.8 1: 3 95.4 -1.7
ניקל .9999 103.5 1: 3 98.5 2.1 אין 93.3 -0.9
V .9998 2.5 97.2 אין 95.5 -1.5 אין 101.2 -1.9
Pb .9998 12.6 105.2 1: 3 88.9 0.0 אין 93.5 -0.5
Sb .9998 1.1 105.7 אין 101.8 -9.6 אין 90.8 -1.2
Zn .9997 5.2 120.8 1: 3 90.7 1.4 אין 89.2 -1.9

לוח 10: סיכום התוצאות של דגימות בקרת איכות. R = שיתוףמקדם rrelation,% D: הבדל אחוזים,% R: התאוששות אחוזים, RPD = הבדלי אחוזים ביחס, יחס דילול מתייחס למומסים: יחס ממס.

ריכוזי מזהמים אורגניים

מתכות כבדות ומזהמים אורגניים נמצאו בשני בינוני ביומסה וsupernatant. הריכוזים שנמצאו ביומסה לאלמנטים 12 ניתחו מוצגים באיור 3. ריכוזים ביומסה נקטפו מן PBRs שלושה עותקים (N = 3) ביצווה מס '1 מציג שגיאה קטנה מאוד סטנדרטית (איור 3 א). שילוב נתונים מPBRs שלושה עותקים מ4 קבוצות מציג באופן עקבי כי מזהמים אורגניים נמצאים ביומסה (N = 12). הריכוזים שנמצאו במדיום supernatant מוצגים באיור 4. תוצאות מראות PBRs שלושה עותקים (N = 3) ל# אצווה 1 גם יש שגיאה קטנה סטנדרטית (איור 4 א) ומראה שרוב המזהמים מעדיפים אותרו בl יומסהeading לריכוזים נמוכים מאוד בsupernatant עם כמה ריכוזי מדגם קרובים לMRL של המכשיר. תוצאות מכל ארבע קבוצות מוצגות באיור 4.

איור 2
איור 2. ריכוז C ulture על פני תקופת הטיפוח לPBRs מזוהם ושליטה. () צפיפות תרבות ביצוו מס '1, תוצאות מN = 3 PBRs. צפיפות התרבות (ב ') ב -4 קבוצות, תוצאות מN = 12 PBRs. חוגים ריקים מייצגים מזוהמים ביומסה, עיגולים מלאים מייצגים את השליטה.

איור 3
ריכוז איור 3. של מזהמים אורגניים ביומסה. () ריכוז ב# אצווה 1, תוצאות מN = 1 PBR עבור Zn וN = 3 PBRs לכל analytes האחר, ריכוז (ב ') מ4 קבוצות, תוצאות מN = 4 PBRs לZn וN = 12 PBRs לכל analytes האחר. ריכוזים ממוצעים מיוצגים על ידי עיגולים שחורים מלא, נקודות נתונים אישיות מיוצגות על ידי עיגולים מלאים אפורים. ברים שגיאה מייצגים ± אחד שגיאה סטנדרטית מהממוצע.

איור 4
ריכוז איור 4. מזהמים אורגניים בsupernatant. ריכוז () בתצוו מס '1, תוצאות מN = 3 PBRs, ריכוז (ב') מ4 קבוצות, תוצאות מN = 12 PBRs. ריכוזים ממוצעים מיוצגים על ידי עיגולים שחורים מלא, נקודות נתונים אישיות מיוצגות על ידי עיגולים מלאים אפורים. ברים שגיאה מייצגים ± אחד שגיאה סטנדרטית מהממוצע.

>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

נ 'מייקרו המלוח סלינה ניתן לגדל בהצלחה במערכת הצמיחה נועדה עם תוצאות הדיר ותשואות גבוהות ביומסה. רכבת אווירית ערבוב אפשרה לתרבות מושעה מעורבת היטב עם יישוב או biofouling מינימאליים על פני תקופות צמיחה של 7 ימים. השתנות האור מינימליות על פני בנק אור הניאון מוצגות גם לא לייצר הבדלים בולטים בצמיחה.

המחקר מראה מתכת כבדה מזוהם תקשורת בנציג ריכוזים של אינטגרציה עם גז פליטה פחם לרעה צמיחה ביומסה משפיע. הדירות במחקר מדגישה את השפעת המערכת רבת-מתכת יש בפריון. יש שלבים שונים בתהליך הפוטנציאל להשפיע לרעה צמיחה ולזהם את המערכת דורשת הכנה ניסיונית חרוצה. קביעת pH של המדיום לפני תחילת הניסוי היא צעד QC המאפשר לאימות שהמדיום הוא לא acidified (למשל, resulting מPBR לא תקין שטיפה לאחר השריה חומצה). בינוני acidified ישפיע צמיחת אצות ולשנות את הזמינות הביולוגית תזונתית (למשל, שינויים בהתפצלות התפצלות פחמן ומתכות אורגניות) ובכך משפיעים על יחסי הגומלין בין אצות אתרים, חומרים מזינים ומתכות מחייבים. ההכנה המדוקדקת של ציוד המעבדה למחקרים אלה נדרשה כך שמאזן מסה מדויק של המתכות הציגו יכול להתבצע. יש צעדים אחרים בתהליך הפוטנציאל להציג נעדרים מתכות המדגישות את הצורך בשימוש בממסי כיתה הנכונים וכימיקלים. QC הנכון בתהליך יכול למעשה לזהות את ההקדמה של מזהמי מתכת כבדים.

תוצאות מראות מזהמים הציגו מופצים בין ביומסה (איור 3), תקשורת (איור 4) והסביבה. אורגני מזהמים נמצא בנ נקטף סלינה מצביעה על כך שמייקרו זה יהיה לשלב בידואר כמה מהמזהמים אורגניים הנמצאים בגז פליטה. הטמעה זו יכולה להיות תוצאה של ספיחה על קירות תא עקב טעון אתרי קישור, קליטה בתוך התא בשל פעילות המטבולית, ומשקעים של קומפלקסים שנוצרו עם אלמנטים נוכחים במדיום 28. מבחינה ויזואלית הכורים עם מזהמים אורגניים לאחר כמה ימים הופיעו בצבע צהוב בהשוואה לצבע הירוק הכהה של כורי השליטה. מזוהם ביומסה נקטף לא הייתה שונה מבחינה ויזואלית מביומסה ללא זיהום לאחר היווצרות גלולה לאחר קציר על ידי צנטריפוגה. הבדל הצבע החזותי לפני הקציר מיוחס לביומסה צפיפות נמוכה והדגיש מייקרו. יש לי מזהמים לא הוסרו ביומסה הפוטנציאל לצבור בתקשורת כפי שמודגמים באיור 4. צבירה בתקשורת מייצגת פוטנציאל להגביל בקנה מידה כמו מחזור התקשורת מייצג צורך בכדאיות כלכלית. ההגבלה תהיה מוכתבתעל ידי הסובלנות למזהמי מתכת כבדות אשר יהיו מינים ספציפיים. התוצאות של מחקר זה מדגישים את הצורך להבין טוב יותר את ההשפעות שליליות האפשריות על שילוב מערכות גידול מייקרו עם מקורות פחמן פסולת, במיוחד גז פליטה מבוססת פחם. התוצאות ממחקר זה מדגיש את הצורך להבין את השלכות הפרודוקטיביות של מזהמים אחרים הצפויים להיות נוכח בגז פליטה כגון תחמוצות גופרית וחנקן, אבק דק, ומזהמים אורגניים כגון דיאוקסינים dibenzo polychlorinated וdibenzo פורנים. הערכות תה ורע"א קודמות הניחו אינטגרציה חלקה מבלי לקחת בחשבון את ההשפעות של מזהמים כגון מתכות כבדות ומזהמים אורגניים בפריון. באופן כללי את התוצאות מעבודה זו מדגישות את ההשפעה של מערכת רבת-מתכת על הפרודוקטיביות וניתן להשתמש בם כדי להבין את הפוטנציאל של מייקרו לbioremediate מזהמים.

המתודולוגיה המוצגת אפשרה להמחקר דואר של מזהמים אורגניים עם תוצאות הדיר למייקרו. כמה מזהמים אורגניים המשמשים בניסוי זה נמצאים באופן מסורתי במערכות גידול בריכוזים נמוכים, אבל אין לי אחרים פונקציה ידועה בתא. כתוצאה מכך תערובת מרכיב רב של כ, Cd, Co, Cr, Cu, Hg, Mn, Ni, Pb, SB, Se, Sn, V וZn בריכוז מוצגת בטבלה 4 צמיחת עכבות. כימות הסכום של מזהמים ביומסה יכול להוכיח מאתגר במערכות רבת-מתכת. לעתים קרובות, דגימות עם תכולה גבוהה של חומרים אורגניים ומלחים יכולות לייצר הפרעות מטריצה, הפרעות polyatomic, הפרעות פיזיות ומלח לבנות בקונוסים שסופו של דבר מוביל לקריאות ואובדן הדיוק אנליטיים 29,30 לא מדויקים. דגימות בקרת איכות לרוץ יחד עם דגימות הניסוי עזרו לקבוע את הדיוק ודיוק של הקריאה. מדידה של analytes באמצעות הפרוטוקולים שפותחו עבור מחקר זה הוכיחה להיותccurate ומדויק בייצור החלמה מקובלת שנמצאות בביצועים המקובלים לסוג זה של 25,29 מחקר. עיכול של דגימות על ידי תנור מיקרוגל היה הראה יעיל לנ סלינה כדגימות מתעכלים היו ברורות ללא נוכחות של פסולת תא או חלקי immiscible. המטריצה ​​המשמשת בניסויים זה (ביומסה אצות ומי ים מלאכותי) המיוצרת על הפרעות מטריצה ​​שלהתגבר על ידי דילול מטריצה. עם זאת, גודל מדגם ביומסה גבוהה יותר מאלה המשמשים בניסוי זה עלול להוביל להפרעות מטריצה, ולכן QC יש לנתח לכל תרחיש ספציפי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Sodium chloride Fisher Scientific S271-3
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific C79-500
Potassium chloride Fisher Scientific P217-500
Sodium meta silicate nonahydrate  Fisher Scientific S408-500
Magnesium sulfate heptahydrate  Fisher Scientific M63-500
Potassium nitrate EMD Chemical PX1520-5
Potassium phosphate monobasic  Fisher Scientific P285-500
Ammonium ferric citrate Fisher Scientific I72-500
Boric acid Fisher Scientific A73-500
Sodium molybdate, dihydrate EMD Chemical SX0650-2
Manganese chloride tetrahydrate Fisher Scientific M87-500
Zinc sulfate heptahydrate Fisher Scientific Z68-500
Cupric sulfate pentahydrate Fisher Scientific C489-500
Biotin  Acros Organics 230090010
Thiamine  Acros Organics 148990100
Vitamin B12  Acros Organics 405920010
Copper (II) chloride dihydrate  Sigma-Aldrich 221783-100G Irritant, Dangerous to the Environment
Lead (II) chloride  Sigma-Aldrich 268690-250G Toxic, Dangerous to the Environment
Sodium dichromate dihydrate  Sigma-Aldrich 398063-100G Oxidizing, Highly Toxic, Dangerous to the Environment
Cobalt (II) chloride hexahydrate  Sigma-Aldrich 255599-100G Toxic, Dangerous to the Environment
Nickel (II) chloride hexahydrate  Sigma-Aldrich 223387-500G Toxic, Dangerous to the Environment
Sodium (meta) arsenite  Sigma-Aldrich 71287 Toxic, Dangerous to the Environment
Cadmium chloride  Sigma-Aldrich 202908-10G Highly Toxic, Dangerous to the Environment
Mercury (II) chloride  Sigma-Aldrich 215465-100G Toxic, Dangerous to the Environment
Tin (II) chloride dihydrate Fisher Scientific T142-500 Corrosive. Suitable for Hg analysis. Very hazardous.
Manganese chloride tetrahydrate Fisher Scientific M87-500
Vanadium (V) oxide Acros Organics 206422500 Dangerous to the Environment
Carbon dioxide  Air Liquide I2301S-1 Compressed
Hydrogen peroxide H325-500 Fisher Scientific 30% in water
ICP-MS standard ICP-MS-6020 High Purity Standards
Mercury standard CGHG1-1 Inorganic Ventures 1000±6 µg/mL in 5% nitric acid
Argon Air Liquide Compressed
Helium Air Liquide Compressed, ultra high purity
Hydrogen Air Liquide Compressed, ultra high purity
Nitric acid Fisher Scientific A509-P212 67-70% nitric acid, trace metal grade. Caution: manipulate under fume hood.
Hydrochloric acid Fisher Scientific A508-P212 35% hydrochloric acid, trace metal grade. Caution: manipulate under fume hood.
Equipment
Scientific prevacuum sterilizer Steris 31626A SV-120
Centrifuge Thermo Fisher 46910 RC-6 Plus
Spectrophotometer Shimadzu 1867 UV-1800
pH controller Hanna BL981411 X4
Rotometer, X5 Dwyer RMA-151-SSV T31Y
Rotometer, X5 Dwyer RMA-26-SSV T35Y
Water bath circulator Fisher Scientific 13-873-45A
Compact chiller VWR 13270-120
Freeze dryer Labconco 7752020
Stir plate Fisher Scientific 11-100-49S
pH lab electrode Phidgets Inc 3550
Inductively coupled plasma mass spectrometer Agilent Technologies 7700 Series ICP-MS Attached to autosampler CETAC ASX-520
FIAS 100 Perkin Elmer Instruments B0506520
Atomic absorption spectrometer Perkin Elmer Instruments AAnalyst 800
Cell heater (quartz) Perkin Elmer Instruments B3120397
Microwave Milestone Programmable, maximum power 1,200 W
Microwave rotor Milestone Rotor with 24-75 ml Teflon vessels for closed-vessel microwave assisted digestion.
Materials
0.2 μm syringe filter Whatman 6713-0425
0.2 μm syringe filter Whatman 6713-1650
0.45 μm syringe filter Thermo Fisher F2500-3
Polystyrene tubes Evergreen 222-2094-050 17 x 100 mm w/cap, 16 ml, polysteryne
Octogonal magnetic stir bars Fisher scientific 14-513-60 Magnets encased in PTFE fluoropolymer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dismukes, G. C., Carrieri, D., Bennette, N., Ananyev, G. M., Posewitz, M. C. Aquatic phototrophs: efficient alternatives to land-based crops for biofuels. Curr Opin Biotechnol. 19 (3), 235-240 (2008).
  2. Moody, J. W., McGinty, C. M., Quinn, J. C. Global evaluation of biofuel potential from microalgae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8691-8696 (2014).
  3. Pinto, E., et al. Heavy metal-induced oxidative stress in algae. J Phycol. 39 (6), 1008-1018 (2003).
  4. Gupta, A., Lutsenko, S. Evolution of copper transporting ATPases in eukaryotic organisms. Curr Genomics. 13 (2), 124-133 (2012).
  5. Perales-Vela, H. V., Peña-Castro, J. M., Cañizares-Villanueva, R. O. Heavy metal detoxification in eukaryotic microalgae. Chemosphere. 64 (1), 1-10 (2006).
  6. Sandau, E., Sandau, P., Pulz, O. Heavy metal sorption by microalgae. Acta Biotechnol. 16 (4), 227-235 (1996).
  7. Amer, L., Adhikari, B., Pellegrino, J. Technoeconomic analysis of five microalgae-to-biofuels processes of varying complexity. Bioresour Technol. 102 (20), 9350-9359 (2011).
  8. Benemann, J. R., Goebel, R. P., Weissman, J. C., Augenstein, D. C. Microalgae as a source of liquid fuels. Final Technical Report, US Department of Energy, Office of Research. , (1982).
  9. Benemann, J. R., Oswald, W. J. Report No. DOE/PC/93204--T5 Other: ON: DE97052880; TRN: TRN. Systems and economic analysis of microalgae ponds for conversion of CO2 to biomass. , (1996).
  10. Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol Adv. 25 (3), 294-306 (2007).
  11. Davis, R., Aden, A., Pienkos, P. T. Techno-economic analysis of autotrophic microalgae for fuel production. Applied Energy. 88 (10), 3524-3531 (2011).
  12. Jones, S., et al. Process design and economics for the conversion of algal biomass to hydrocarbons: whole algae hydrothermal liquefaction and upgrading. U.S. Department of Energy Bioenergy Technologies Office. , (2014).
  13. Lundquist, T. J., Woertz, I. C., Quinn, N. W. T., Benemann, J. R. A realistic technology and engineering assessment of algae biofuel production. Energy Biosciences Institute. , Berkeley, CA. (2010).
  14. Nagarajan, S., Chou, S. K., Cao, S., Wu, C., Zhou, Z. An updated comprehensive techno-economic analysis of algae biodiesel. Bioresour Technol. 145, 150-156 (2011).
  15. Pienkos, P. T., Darzins, A. The promise and challenges of microalgal-derived biofuels. Biofuels Bioproducts & Biorefining-Biofpr. 3, 431-440 (2009).
  16. Richardson, J. W., Johnson, M. D., Outlaw, J. L. Economic comparison of open pond raceways to photo bio-reactors for profitable production of algae for transportation fuels in the Southwest. Algal Research. 1 (1), 93-100 (2012).
  17. Rogers, J. N., et al. A critical analysis of paddlewheel-driven raceway ponds for algal biofuel production at commercial scales. Algal Research. 4, 76-88 (1016).
  18. Sun, A., et al. Comparative cost analysis of algal oil production for biofuels. Energy. 36 (8), 5169-5179 (2011).
  19. Thilakaratne, R., Wright, M. M., Brown, R. C. A techno-economic analysis of microalgae remnant catalytic pyrolysis and upgrading to fuels. Fuel. 128, 104-112 (2014).
  20. Quinn, J. C., et al. Nannochloropsis production metrics in a scalable outdoor photobioreactor for commercial applications. Bioresour Technol. 117, 164-171 (2012).
  21. Borkenstein, C., Knoblechner, J., Frühwirth, H., Schagerl, M. Cultivation of Chlorella emersonii with flue gas derived from a cement plant. J Appl Phycol. 23 (1), 131-135 (2010).
  22. Douskova, I., et al. Simultaneous flue gas bioremediation and reduction of microalgal biomass production costs. Appl Microbiol Biotechnol. 82 (1), 179-185 (2009).
  23. Israel, A., Gavrieli, J., Glazer, A., Friedlander, M. Utilization of flue gas from a power plant for tank cultivation of the red seaweed Gracilaria cornea. Aquaculture. 249 (1-4), 311-316 (2012).
  24. Napan, K., Teng, L., Quinn, J. C., Wood, B. Impact of Heavy Metals from Flue Gas Integration with Microalgae Production. , Algal Research. (2015).
  25. Eaton, A. D., Clesceri, L. S., Rice, E. W., Greenberg, A. E. 3125B. Inductively coupled plasma/mass spectrometry (ICP/MS) method. Standard methods for the examination of water and wastewater. , (2005).
  26. Eaton, A. D., Clesceri, L. S., Rice, E. W., Greenberg, A. E. Standard methods for the examination of water and wastewater. , APHA-AWWA-WEF. (2005).
  27. Matrix effects in the ICP-MS analysis of selenium in saline water samples. Smith, M., Compton, J. S. Proceedings of the 2004 Water Institute of Southern Africa Biennial Conference, Cape Town, South Africa, , (2004).
  28. Mehta, S. K., Gaur, J. P. Use of algae for removing heavy metal ions from wastewater: progress and prospects. Crit Rev Biotechnol. 25 (3), 113-152 (2005).
  29. EPA, U. Method: 200.8: Determination of trace elements in waters and wastes by inductively coupled plasma - mass spectrometry. , (1994).
  30. Eaton, A. D., Clesceri, L. S., Rice, E. W., Greenberg, A. E. 3120B. Inductively coupled plasma (ICP) method. Standard methods for the examination of water and wastewater. , (2005).

Tags

מדעי הסביבה גיליון 101 אצות מתכות כבדות, Photobioreactor גז פליטה ספקטרומטריית מסת פלזמה בשילוב אינדוקטיבי ICPMS ספקטרומטריית קליטה אטומית אדים קרים CVAAS
כימות של מתכות כבדות ומזהמים אורגניים אחרים בפרודוקטיביות של מייקרו
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Napan, K., Hess, D., McNeil, B.,… More

Napan, K., Hess, D., McNeil, B., Quinn, J. C. Quantification of Heavy Metals and Other Inorganic Contaminants on the Productivity of Microalgae. J. Vis. Exp. (101), e52936, doi:10.3791/52936 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter