微流控京尼平沉积技术用于微图形化血管肌薄层的长期培养

摘要

我们介绍一种在聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上微流控沉积图案化京尼平和纤连蛋白的方法，可延长富含血管平滑肌细胞组织的存活时间。该组织制备方法与先前的血管肌肉薄膜技术相结合，用于在与疾病相关的时程内测量血管收缩力。

摘要

血管疾病进展的慢性特征需要开发能够在与疾病相关的时间尺度上模拟生理和病理血管行为的实验技术。此前，微接触印刷技术已被用于通过细胞外基质蛋白的图案化作为组织排列的引导信号，来构建二维功能性动脉模拟结构。血管肌肉薄膜利用这些模拟结构来评估功能性收缩能力。然而，通常使用的微接触印刷制备技术会引入疏水性的PDMS基底。当组织更新其下方的细胞外基质时，新合成的蛋白质必须发生构象改变或变性，以暴露疏水性氨基酸残基，从而与疏水性PDMS表面结合附着，这会导致基质蛋白生物活性的改变、基质剥离以及组织死亡。

本文介绍了一种用于图案化交联剂化合物京尼平（genipin）的微流控沉积技术。京尼平作为图案化组织与聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底之间的中介，可使细胞在更具亲水性的表面沉积新合成的细胞外基质蛋白，并保持与PDMS基底的附着。我们还证明，细胞外基质蛋白可直接图案化沉积在京尼平涂层上，从而调控工程化组织的结构。利用该技术制备的组织在血管肌肉薄膜模型中表现出高度保真的结构排列和血管平滑肌组织的收缩功能。该技术可拓展应用于其他细胞类型，为未来研究慢性组织和器官水平的功能提供了技术框架。

引言

血管疾病，例如脑血管痉挛^1,2，高血压³，以及动脉粥样硬化⁴，进展缓慢，通常具有慢性特征，并涉及血管平滑肌细胞（VSMCs）产生功能障碍性的收缩力。我们旨在利用这些缓慢进展的血管功能障碍进行研究 体外 比以往更精细地控制实验条件的方法 体内 模型。我们此前已开发出血管肌层薄膜（vMTFs），用于测量功能性收缩力 体外 工程化心血管组织⁵但该方法仅限于相对较短时间的研究。在此，我们介绍一种基底修饰技术，可扩展我们先前的vMTF技术，以实现长期测量。

尽管内皮在整体血管功能中也至关重要，工程化的动脉层片为评估疾病进展过程中血管收缩功能的变化提供了一个有用的模型系统。为了构建一个功能性的血管疾病组织模型，必须高度保真地重现动脉层片的结构和功能，即血管的基本收缩单位。动脉层片是由弹性蛋白层分隔的、同心且周向排列的收缩型血管平滑肌细胞（VSMC）片层⁶。以往研究中，已通过将细胞外基质（ECM）蛋白微接触印刷到聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上来提供组织排列的引导信号，以模拟有序的心血管组织^5,7-10。然而，采用微接触印刷技术构建的组织在培养3至4天后可能失去完整性，限制了其在慢性研究中的应用。本实验方案通过采用一种新型微流控沉积技术替代传统的微接触印刷方法，解决了这一问题。

方案

注意：本方案的目标是构建并使用具有图1所示结构的血管肌性薄膜（vMTF），以评估血管平滑肌细胞（VSMCs）在PDMS基底上长期培养过程中的收缩功能。为了延长VSMCs的存活时间，我们采用交联剂化合物京尼平（genipin）。这些vMTF所用的基底设计基于Grosberg 等⁸提出的用于分析组织收缩力的方法。其他vMTF方法⁵也可使用，仅需对本文所述的基底制备方案进行细微调整。

1. 底物制备

1. 盖玻片清洗
   1. 将直径为25 mm的玻璃盖玻片放入盖玻片染色架中。将支架放入一个大烧杯或容器中（例如，一个空的100 - 1,000 µl 移液器吸头容器）。
   2. 向容器中加入70%乙醇，完全浸没盖玻片。超声处理至少30分钟。
   3. 将盖玻片架从乙醇溶液中取出。将支架悬挂在无菌培养罩内，使盖玻片自然晾干1-2小时（以防止颗粒物沉积在盖玻片上）。
      注意：在进行后续步骤前，盖玻片必须完全干燥。
2. 在盖玻片上制备聚(N-异丙基丙烯酰胺) (PIPAAm) 条带
   1. 使用胶带将已清洗的盖玻片边缘覆盖，仅在盖玻片中央留出一条暴露的条形区域（图1A）。根据具体应用或微流控设计调整该暴露条带的宽度。<....

结果

本研究的主要目标是延长微图形化血管平滑肌细胞在疏水性聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上的存活时间。通过整合微流控递送系统，在PDMS上沉积图案化的京尼平和纤连蛋白，实现了这一目标。 （图1）采用微流控递送方式沉积ECM蛋白，可实现基因素与纤连蛋白条带之间裸露PDMS区域的高保真通道图案转移 （图1D）贴壁细胞 （图1E） 形成融合的单层，模拟 体内 动脉薄片结构（图2），类似于以往的微接触印刷方法^5,10,16这些组织产生了具有响应性和收缩性的构建物，其应力通过vMTF技术进行测量 （图3）.

在为期两周的过程中对组织活力进行的定性评估显示，经京尼平修饰的基底上组织退化程度最小（图 2A）。组织的汇合度与细胞排列在两周内均得以维持（图 2B、2C 和 2D）。针对每个 vMTF 计算了两个关键的应力值：1）基础.......

讨论

本文介绍了一种在先前开发的vMTF技术基础上改进的实验方案，可实现更长的实验时间，更符合慢性血管疾病通路的研究需求^1,23,24。为实现这一目标，我们采用微流控沉积技术对京尼平进行微图案化处理，该物质此前已被证明可实现PDMS基底的长期功能化¹¹，从而制备出具有改善血管组织存活率的工程化动脉层片，用于MTF收缩力实验。McCain et al. 在相关的MTF模型中，开发了一种替代性的微模制明胶水凝胶基底，可用于工程化心肌组织的长期培养，持续数周²⁵。

该方案成功获得了能够模拟动脉层片结构的vMTF （图2） 和功能 （图3） 为期两周。成功完成本方案可实现疾病相关时间进程的延长培养时间，从而获得预期结果。例如， 持续长达14天的脑血管痉挛的病理效应²⁶），会出现一些常见问题。PDMS微流控装置的重复使用会导致有害损伤，可能引起装置内分支部分或完全堵塞，因此每次实验必须使用新的装置。另一个问题.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盖玻片染色架	Electron Microscopy Sciences	www.emsdiasum.com/	72239-04
显微镜盖玻片 - 25 mm	Fisher Scientific, Inc.	www.fishersci.com	12-545-102
聚(N-异丙基丙烯酰胺) (PIPAAm)	Polysciences, Inc.	www.polysciences.com/	#21458
1-丁醇	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	360465
旋涂仪	Specialty Coating Systems, Inc.	www.scscoatings.com
聚二甲基硅氧烷 (PDMS)	Ellsworth Adhesives (Dow Corning)	www.ellsworth.com	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
荧光微球	Polysciences, Inc.	www.polysciences.com/	17151
硅晶圆	Wafer World, Inc.	www.waferworld.com	2398
光刻胶	MicroChem Corp.	www.microchem.com
接触式掩模对准器	Suss MicroTec	www.suss.com
显影液	MicroChem Corp.	www.microchem.com
十三氟三氯硅烷	UCT Specialties, Inc.	www.unitedchem.com	T2492
外科活检打孔器	Integra LifeSciences Corp.	www.miltex.com	33-31AA-P/25
京尼平	Cayman Chemical	www.caymanchem.com	10010622
1× 磷酸盐缓冲液	Mediatech, Inc.	www.cellgro.com	21-031-CV
纤连蛋白	Corning, Inc.	www.corning.com	356008
青霉素/链霉素	Life Technologies, Inc.	www.lifetechnologies.com	15140-122
脐动脉平滑肌细胞	Lonza	www.lonza.com	CC-2579
Tyrode's 溶液组分	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	各种
体视显微镜	Zeiss	www.zeiss.com	4350020000000000
温控平台	Warner Instruments	www.warneronline.com	641659; 640352; 641922
内皮素-1	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	E7764-50UG
HA-1077	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	H139-10MG