Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Microfluïdische Genipin Deposition Techniek voor Extended Cultuur van micropatterned Vascular Gespierd Thin Films

Published: June 26, 2015 doi: 10.3791/52971
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota

Introduction

Vasculaire ziekten, zoals cerebrale vasospasmen 1,2, 3 hypertensie en atherosclerose 4, langzaam ontwikkelen, zijn gewoonlijk chronisch van aard en omvatten disfunctionele kracht generatie door vasculaire gladde spiercellen (VSMC's). Wij streven ernaar om deze langzaam vordert vasculaire disfuncties met in vitro methoden met fijnere controle van de experimentele omstandigheden dan in in vivo modellen te bestuderen. We hebben eerder ontwikkelde vasculaire gespierde dunne films (vMTFs) voor het meten van functionele contractiliteit van in vitro gemanipuleerde cardiovasculaire weefsels 5, maar deze methode is beperkt tot een relatief korte termijn studies. Hier presenteren we een substraat modificatie techniek die onze vorige vMTF techniek breidt voor langdurige metingen.

Terwijl het endotheel is ook kritisch in algemene vasculaire functie ontworpen arteriële lamellen een bruikbaar model systeem voor het vastleggen van veranderingen in vasculairecontractiliteit tijdens progressie van de ziekte. Een functionele vaatziekte weefselmodel zowel de structuur en functie van de arteriële lamel ingenieur, de basis contractiele apparaat van het vaartuig moet worden recapituleerde een hoge getrouwheid. Arteriële lamellen concentrisch omtrek uitgelijnde vellen contractiele VSMC gescheiden vellen van elastine 6. Microcontact printen van extracellulaire matrix (ECM) eiwitten op polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten is eerder gebruikt als leidraad signalen voor weefselorganisatie nabootsen uitgelijnd cardiovasculair weefsel 5,7-10. Echter, weefsels gevormd via microcontact afdrukken kan integriteit verliezen na 3-4 dagen kweken beperking van hun toepasbaarheid bij chronische studies. Dit protocol voorziet in een oplossing voor dit probleem door het vervangen van de vorige microcontact druktechnieken met een nieuwe microfluïdische depositie techniek.

Genchi et al. Gemodificeerde PDMS substraten met genipin en found langdurige levensvatbaarheid van myocytes tot een maand in de cultuur 11. Hier gebruiken we een soortgelijke benadering van cultuur van patroon vasculaire gladde spiercellen te breiden op PDMS. Genipin, natuurlijke hydrolytische afgeleide van de gardenia fruit, een gewenste kandidaat voor modificatie substraat vanwege de relatief lage toxiciteit in vergelijking met soortgelijke verknopingsmiddelen en het toenemende gebruik als een biomateriaal in het gebied van weefselherstel 12,13 en ECM modificatie 14, 15. In dit protocol wordt fibronectine gebruikt als een cel begeleiding cue, net als in voorgaande microcontactprinten methoden; echter genipin afgezet op PDMS substraten voorafgaand aan fibronectine patronen. Dus, zoals cellen afbreken van de matrix patroon, nieuw gesynthetiseerde ECM van aangesloten VSMC kan binden aan het PDMS-genipin beklede substraat.

Dit protocol maakt gebruik van een microfluïdische afleverinrichting voor tweefasige genipin en ECM afzetting. Het ontwerp van de microfluïdische apparaat bootst microcontact drukpatronen ontworpen voor arteriële lamellen in eerdere studies 16. Zo verwachten we dat dit protocol om arteriële lamellen bootst dat succes herhalen de zeer uitgelijnd in vivo structuur en de contractiele functie van de arteriële lamellen opleveren. We hebben ook weefsel contractiliteit te evalueren om te bevestigen dat genipin een geschikt substraat modificatie compound voor langdurige in vitro vasculaire ziektemodellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: Het doel van dit protocol is het construeren en gebruiken van een vasculair musculaire dunne film (vMTF) met de in figuur 1 getoonde contractiliteit beoordelen tijdens langdurige kweek van vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) met PDMS substraten structuur. Om VSMC levensvatbaarheid te verlengen, maken we gebruik van de crosslinker verbinding genipin. De substraten voor deze vMTFs ontworpen om weefsel contractiliteit te analyseren ontwikkeld door Grosberg et al. 8 vMTF andere werkwijzen 5 mei eveneens worden gebruikt, met subtiele veranderingen in de gepresenteerde substraat fabricage protocol.

1. Ondergrond Fabrication

  1. Coverslip Cleaning
    1. Plaats 25 mm diameter glas dekglaasjes in een dekglaasje vlekken rack. Plaats het rek in een grote beker of container (bijvoorbeeld een lege 100 -. 1000 ul pipet tip container).
    2. Voeg 70% ethanol om de houder volledig te dompelen dekglaasjes. Sonificeer ze gedurende minstens 30 min. </ Li>
    3. Verwijder de dekglaasje rek uit de ethanol-oplossing. Laat de dekglaasjes aan de lucht drogen door opknoping het rek in een steriele cultuur kap (om deeltjes accumulatie op dekglaasjes te voorkomen) voor 1- 2 uur.
      Opmerking: De dekglaasjes moet volledig droog zijn voordat de volgende stappen.
  2. Poly (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Strip Isolatie op Coverslip
    1. Met plakband, tape van de zijkanten van een gereinigde dekglaasje, waardoor een blootgestelde strook gecentreerd op het dekglaasje (figuur 1A). Wijzig de breedte van deze blootgesteld strip op basis van toepassing en / of microfluïdische ontwerp.
    2. Markeer de randen van de tape strips op de dekglaasje met behulp van een laboratorium marker voor latere referentie (Figuur 1A).
    3. Knip rond de omtrek van het dekglaasje vrijgeven de schaal (figuur 1A, rode stippellijn).
  3. Poly (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Coating
    1. Met behulp van een analytische balans, weegt 1 g van PIPAAM poeder. Gebruik geen niet-gepolymeriseerde N-iso-propylacrylamide, dat is een kankerverwekkende stof.
    2. Breng de PIPAAm een ​​50 ml centrifugebuis. Voeg 10 ml 1-butanol in een chemische kap een 10% g / v te verkrijgen. LET OP: Het vlampunt van 1-butanol is 37 o C. Bewaar de verkregen oplossing in een brandbaar kast en vermijd verwarming.
    3. Laat de PIPAAm te ontbinden gedurende 10 min. Als poeder is nog steeds zichtbaar, meng de oplossing met behulp van een vortex-mixer tot alle poeder is opgelost.
      Opmerking: De volgende stappen vereisen het gebruik van een spin coater. Voor elk dekglaasje:
    4. Plaats de afgeplakte dekglaasje op de spin coater boorkop met een pincet.
    5. Breng 150 pi PIPAAm oplossing op het dekglaasje door het plaatsen van druppels langs het blootgestelde glas in het midden van het dekglaasje. Zorgen voor volledige dekking van het blootgestelde gebied.
    6. Spin jas PIPAAm met het volgende recept:
      1. Ramp 10 sec tot 3.000 tpm. Dwell voor 5 sec.
      2. Ramp 10 sec naar 6,000 rpm. Dwell voor 60 sec.
      3. Ramp 10 sec tot 3.000 tpm. Dwell voor 5 sec.
    7. Plaats het dekglaasje in een overdekte petrischaal met de PIPAAm naar boven. Laat drogen gedurende ten minste 15 min.
    8. Verwijder voorzichtig de tape uit alle dekglaasjes, waardoor het volledige dekglaasje belicht met een dun laagje PIPAAm coating in een centrum strip.
  4. PDMS Coating
    1. Meng en ontgas 15 g van PDMS in een 10: 1 base: crosslinker ratio. Voeg 7-8 druppels gesoniceerd 0,2 urn fluorescente microkraaltjes voor het mengen. Bedek de kop PDMS met aluminiumfolie wanneer niet in gebruik om stof en andere deeltjes te voorkomen dat besmetting van de PDMS.
      Opmerking: De volgende stappen vereisen het gebruik van een spin coater. Voor elk dekglaasje:
    2. Plaats een PIPAAm-gecoate dekglaasje op de spin coater boorkop met een pincet.
    3. Breng PDMS op het dekglaasje, die ten minste één derde van het dekglaasje gebied.
    4. Spin jas met behulp van de volgende recipe:
      1. Ramp 5 sec bij 500 rpm. Dwell 5 sec.
      2. Ramp 5 sec tot 1.000 tpm. Dwell 5 sec.
      3. Ramp 10 sec tot 3.000 tpm. Dwell 10 sec.
      4. Ramp 10 sec bij 4000 rpm. Dwell 60 sec.
      5. Ramp 10 sec bij 2000 rpm. Dwell 15 sec.
      6. Ramp 10 sec bij 1000 rpm. Dwell 10 sec.
      7. Ramp 5 sec bij 500 rpm. Dwell 5 sec.
    5. Plaats het dekglaasje in een overdekte petrischaal met de PDMS naar boven. Noteer de tijd dat het dekglaasje werd spin-gecoat. Houd de tijd bij elk dekglaasje gedurende het experiment om later bij de bepaling van de PDMS substraatdikte.
    6. Zet de petrischaal met de dekglaasjes in een 90 ° C oven gedurende ten minste 1,5 uur om een ​​goede PDMS uitharding te verzekeren. Als een oven beschikbaar is, laat de dekglaasjes uitharden ten minste 48 uur bij KT.
    7. Verwijder de dekglaasjes van de oven en bewaar ze in een donkere lade totdat klaar voor gebruik.
    8. Braaklegging elke vierde dekglaasje fof latere meting van substraatdikte, als functie van tijd spincoating met een profilometer.

2. Microfluïdische Patroonvorming voor engineering Tissues

  1. Fabricage van microfluïdische apparaten
    1. Ontwerp van Tissue Microfluidic fotomasker
      1. Gebruik een geschikte computer-aided design programma om microfluïdische patronen ontwerpen. Voor arteriële lamellen uit menselijke navelstreng slagader vasculaire gladde spiercellen, gebruikt een afwisselend patroon van 10 urn kanalen met 10 urn wanden.
      2. Gebruik binair channel vertakken indien mogelijk 17, maar andere vertakking modellen kan worden gebruikt. Verlaag de breedte en de lengte van de kanalen voor elke vertakking iteratie totdat de nagestreefde weefsel patroon spatiëring (muren en kanalen, Figuur 1B).
      3. Ontwerp van de inrichting tot één inlaat voor oppervlaktebehandelingsoplossing plaatsing en één uitlaat voor aanleggen van vacuüm hebben.
      4. Fabricate een fotomasker met de microfluïdische ontwerp (s), zoals eerder beschreven 18.
    2. Fotolithografische Wafer Fabrication
      Opmerking: Voer fotolithografie in een geschikte cleanroom of een soortgelijke voorziening. Silicium wafers te maken met patronen voor zachte lithografische fabricage van weefsel microfluïdische apparaten (~ 20 - 25 micrometer kanaal hoogte) met behulp van fotolithografie:
      1. Schoon een siliciumwafer in aceton, methanol en isopropylalcohol gedurende 1 min elk. Droog de wafer met een stikstof pistool.
      2. Prebake de wafer op een hete plaat gedurende 5 min bij 115 ° C om overtollig vocht te verwijderen.
      3. Spin de vacht van de wafer met de SU-8 3025 fotolak met behulp van de volgende recept te geven over 20 - 25 micrometer in de hoogte:
        1. Ramp 5 sec bij 500 rpm. Dwell 5 sec.
        2. Ramp 15 sec bij 4000 rpm. Dwell 15 sec.
      4. Soft bak de wafer op een hete plaat bij 95 ° C gedurende 15 min.
      5. Plaats een fotomasker en bloot tHij wafeltje voor 16 sec met een stofzuiger contact programma op een contact masker aligner.
      6. Hard bak de wafer op een hete plaat bij 95 ° C gedurende 4 min.
      7. Ontwikkelen van de wafel voor 6 min in de ontwikkelaar. Vervolgens was de wafer tweemaal voor 2 sec in verse ontwikkelaar en spoel de wafer met isopropylalcohol.
      8. Silanate het patroon wafer O / N door het plaatsen van 2 - 3 druppels tridecafluoro-trichloorsilaan in een lege schaal binnen een vacuümexsiccator. Prop de wafer met behulp petrischalen zodat zowel de onder- en bovenzijde van de wafer worden blootgesteld.
        LET OP: Tridecafluro-trichloorsilaan is een brandbare en corrosieve vloeistof. Persoonlijk beschermende uitrusting en plaatselijke afzuiging is noodzakelijk voor gebruik.
    3. Tissue microfluïdische apparaat Fabrication
      1. Plaats een gesilaneerd, patroon wafer feature-kant naar boven in een petrischaal.
      2. Meng en ontgas 100 g PDMS met een 10: 1 base: crosslinker ratio. Giet de PDMS in de schaal, volledig en gelijkmatig over de wafer.
      3. De schaal in een vacuüm exsiccator totdat alle luchtbellen worden verwijderd uit het uitgeharde PDMS, ongeveer 30 min. Hard de PDMS in de schaal bij 90 ° C gedurende ten minste 1,5 uur. De tijd en temperatuur kunnen worden ingesteld op geleide van richtlijnen productie tot volledig uitharden bezitten.
      4. Zodra de PDMS is uitgehard, knip de PDMS rond de wafer met een scheermesje en het PDMS bedekte wafer uit het schaaltje voorzichtig los. Overtollig PDMS wafer onder langzaam afpellen PDMS vanaf de bovenkant van wafer.
      5. Plaats de PDMS disk functie-kant naar boven in een schone schaal en bewaar de wafel uit de buurt van licht na gebruik.
      6. Knip de overtollige PDMS van rond de patronen met behulp van een scheermesje. Cut apparaten in rechthoekige vormen (figuur 1C) te verlichten peeling van toestel van substraten in latere stappen. Precieze sneden zijn niet noodzakelijk, mits voldoende ruimte bestaat voor de inlaat, uitlaat en weefsels afwijkingshoek (figuur 1C).
      7. Stempelinlaat- en uitlaatgaten (figuur 1C) met een 1 mm biopsie punch.
  2. Microfluïdische apparaat Deposition
    Opmerking: In dit protocol wordt microfluidic levering gebruikt patroonmatig genipin, de belangrijkste verknopingsmiddel voor langdurige weefselkweek, en fibronectine deponeren. Stappen voorafgaand aan penicilline / streptomycine sterilisatie (2.2.3) hoeft niet plaats te vinden in steriele omstandigheden, maar het beperken van vervuiling en stof collectie wordt aangemoedigd het hele protocol. Alle stappen die zich voordoen na dekglaasje sterilisatie met penicilline / streptomycine (2.2.3) moet een steriele techniek te gebruiken. Opmerking: Dit gedeelte van het protocol moet worden gestart op een dag voorafgaand aan de cel zaaien.
    1. Ondergrond en microfluïdische apparaat Voorbereiding
      1. Sonificeer de microfluïdische inrichtingen in 70% ethanol gedurende tenminste 30 minuten.
      2. Droog de gesoniceerde microfluïdische apparaten met behulp van perslucht of stikstof, en plaats ze in een petrischaal with kanaal heeft face-up om onnodige slijtage van de functies te voorkomen.
      3. Plaats maximaal 10 vMTF substraat dekglaasjes in een UVO schonere (cover verwijderd op schotel, zodat het oppervlak gefunctionaliseerd) voor 8 min.
      4. Verwijder de UVO behandelde dekglaasjes en plaats de microfluïdische inrichtingen functie naar beneden op elke slip één voor één (oriëntatie moet overeenkomstig figuur 1C zijn). Druk stevig op de apparaten om een ​​goede afdichting op de PDMS-gecoate dekglaasjes garanderen.
    2. Afzetting van Genipin en fibronectine
      1. Bereid een 5 mg / ml genipin door toevoeging van 1 ml steriel DDH 2 O een container 5 mg gelyofiliseerd genipin. Meng de oplossing met behulp van een vortex-mixer. Apart zetten bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 min.
        Opmerking: Het poeder is moeilijk oplosbaar bij kamertemperatuur, dus herhaalde mengen gedurende ten minste even vaak noodzakelijk.
      2. Snel, een druppel van 70% ethanol bij de inlaat van elk apparaat voor toestel priming. Opmerking: De ethanol moet lont door de apparaten.
      3. Na 5-10 min voorzichtig zuigen de overmaat ethanol aan de inlaat, onmiddellijk vervangen met 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij de inlaat. Vanaf dit punt, moet u niet toestaan ​​inlaat volledig droog is om de invoering van de lucht om het apparaat te voorkomen worden.
      4. Leg een vacuüm aspirator tip aan de uitlaat van elk apparaat. Trek 1X PBS door de apparaten te spoelen ethanol weg. Laat een kleine hoeveelheid 1X PBS aan de inlaat. Opmerking: Als inlaat verschijnt bijna droog is, voeg meer 1X PBS.
      5. Zuigen overtollige 1X PBS zodat slechts een kleine hoeveelheid blijft de inlaat voor het aanbrengen van genipin oplossing.
      6. Plaats 60 gl van 5 mg / ml genipin oplossing bij elke inlaat (figuur 1D). Teken de genipin oplossing door de apparaten door het plaatsen van een vacuüm aspirator tip aan de uitlaat (figuur 1D). Zorg niet alle oplossing trekken door, waardoor een kleine hoeveelheid oplossing in de inlaat.
      7. Place druppels (ongeveer dime-sized) 1X PBS bij zowel de inlaat als uitlaat bevochtiging behouden tijdens de incubatie. Beweeg het schaaltje met apparaten op een bevochtigde incubator oven of (steriele omgeving is niet noodzakelijk) ingesteld op 37 ° C en incubeer gedurende 4 uur. Het gerecht hoeft niet te worden afgedekt.
      8. Tijdens incubatie hersuspenderen fibronectine tot een concentratie van 50 ug / ml in steriele DDH 2 O op ijs gedurende ten minste 30 min voor aanbrengen op microfluïdische apparaat.
      9. Na de incubatie van genipin, zuigen alle resterende 1X PBS aan de inrichting outlets. Doorgaan met een vacuüm aspirator van toepassing op elk apparaat stopcontact trekken door de resterende 1X PBS bij de inlaat.
      10. Plaats 100 gl 50 ug / ml fibronectine oplossing bij elke inlaat, het toevoegen van een minimale hoeveelheid 1X PBS bij inlaat (figuur 1D).
      11. Teken de fibronectine oplossing door de apparaten met behulp van een vacuüm aspirator tip aan de uitlaat (
      12. Verplaats de onbedekte schaaltje met de apparaten een oven of incubator ingesteld op 37 ° C en incubeer 24 uur. Opmerking: De fibronectine stap bevat geen bevochtiging van de inlaat en uitlaat met 1X PBS vereisen. De resterende pool van fibronectine aan de inlaat uitdroogt. Dit is te verwachten.
    3. Sterilisatie en voorbereiding voor mobiele zaaien
      1. Bereid een oplossing van penicilline / streptomycine voor sterilisatie van patroon vMTF dekglaasjes. Voeg 5 ml penicilline / streptomycine (10.000 eenheden / ml, 10000 ug / ml) met 500 ml steriel 1X PBS.
      2. Plaats het schaaltje met de apparaten in een steriele bioveiligheid kap.
      3. Verwijder voorzichtig de apparaten van de dekglaasjes door langzaam pellen het apparaat op een hoek, terwijl lichtjes grijpen de dekglaasje in de andere hand.Opmerking: Deze stap vereist oefening om dekglaasje schade bij het verwijderen te verminderen. Een alternatief is het gebruik van een spuit te injecteren 1X PBS aan de inlaat en / of uitlaat te helpen bij ontkoppelen.
      4. Plaats de dekglaasjes in steriele zes putjes. Voeg minstens 5 ml penicilline / streptomycine-oplossing aan elk putje. De schaaltjes worden in een steriele incubator bij 37 ° C gedurende ten minste 30 min.
      5. Na sterilisatie, zuigen de penicilline / streptomycine oplossing, en het zaad van de dekglaasjes met gekweekte menselijke navelstreng slagader vasculaire gladde spieren cells19 (figuur 1D). Het zaaien concentratie VSMC is ~ 80.000 cellen per cm2. Om het aantal cellen dat nodig is voor elk monster mogelijk te houden, een verloopstuk voor het zaaien verklein. Een voorbeeld van een verloopstuk is uitgesneden top van een 15 ml conische buis bevestigd aan het dekglaasje met steriele vacuüm vet voorafgaand aan het enten.
      6. Incubeer de geënte dekglaasjes in een steriele incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 (Figuur 2A-B).
    4. Langdurige vMTF Tissue Culture
      1. Een dag na het zaaien, verwijder de cel medium en verloopstukken. Spoel de weefsels met 1X PBS. Voeg 4 ml serumvrij celmedium een contractiele fenotype te induceren in de VSMCs 20.
      2. Herhaal de 1X PBS spoeling en toevoeging van vers serumvrij medium om de dag als gewenst voor langetermijnkweek.

Figuur 1
Figuur 1. Microfluïdische Protein Delivery Device. (A) afgeplakt dekglaasje voor PIPAAm coating. Rood gestippelde cirkel: snijden pad naar dekglaasje los (B) Vertegenwoordiger AutoCAD tekening van weefsel microfluïdische maskerpatroon.. Inzet: Detail van binaire vertakking naar AlternAting 10 micrometer x 10 micrometer weefsel patroon. (C) Plaatsing van microfluïdische apparaat op een dekglaasje substraat met inlaat en uitlaat (D) Schematische voorstelling van microfluïdische eiwit patronen en levering aangegeven.. Van links naar rechts: scanning elektronenmicroscoop beeld van microfluïdische kanalen (schaal bar: 50 micrometer); Gedetailleerde schema van de methode voor het eiwit afzetting; Immunohistochemie gekleurd fibronectine (schaal bar: 50 micrometer); Cell enten met vasculaire gladde spiercellen. (E) Schematische voorstelling van gefabriceerde weefsel. 1 st inzet: Detail van de gelaagde constructie. 2e inzet: Detail van genipin modificatie van PDMS substraat na microfluïdische afzetting. © IOP Publishing. Verveelvoudigd en / of aangepast met toestemming. Alle rechten voorbehouden. 19 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Weefsel functie analyse met vMTF contractiliteit Assay

Opmerking: De MTF samentrekbaarheid test hier gepresenteerde is gemodelleerd naar de ontwikkelde techniek in Grosberg et al 8.

  1. vMTF Contractiliteit Experiment
    1. Plaats een weefselmonster in een 100 mm schaal. Voeg steriel 1X Tyrode solution8 bij pH 7,4 opgewarmd tot 37 ° C aan de steekproef.
    2. Gebruik een scheermesje om meerdere parallelle bezuinigingen loodrecht op de PIPAAm rand te maken. Bezuinigen op een wijze die groter weefselsecties die als vMTFs (met een breedte ~ 2 mm) afgewisseld met dunne strips (figuur 3A, zijsneden) oplevert. Om schone sneden te maken, plaats een scheermesje in contact met het monster en stevig te slepen naar de kant.
    3. Draai de schotel 90 ° en maak twee rechte, evenwijdige sneden in het midden van het weefsel, parallel aan de strook PIPAAm (figuur 3A, eindsneden). Verwijder en gooi de losse strook van weefsel tussen deze cuts en de dunne stroken tussen vMTFs (gesneden in de vorige stap) om te voorkomen aangrenzende films in aanraking komen.
    4. Laat het monster rusten bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, of tot alle PIPAAm is opgelost. Let op: Als PIPAAm blijft in de toekomst stappen, kan het monster worden teruggegeven aan de snij-schotel om de resterende PIPAAm ontbinden. Een zachte schrapen van de onderzijde van vMTF kan helpen bij PIPAAm verwijderen, indien nodig.
    5. Plaats een kleine dot van vacuüm vet in een schone 35 mm petrischaal. Voeg 5 ml verse, steriele 1X Tyrode-oplossing bij 37 ° C. Breng het dekglaasje met gesneden films van 100 mm schotel naar de 35 mm schaal en druk op vacuüm vet om beweging van het dekglaasje te voorkomen.
    6. De schaal in een thermisch geïsoleerde platform op de stereomicroscoop podium.
    7. Capture time-lapse uitgezonden en fluorescerend licht beelden op de gewenste tijdstippen (bv., 30 sec) gedurende de behandeling test.
    8. In serie vMTFs behandelen met 50 nM endotheline-1 gedurende 20 min (geïnduceerde contractie) en 100 uM HA-1077 gedurende 30 min (tissue ontspanning). Voeg geconcentreerde oplossingen van elke behandeling de beproevingsgegevens schotel met 5 ml steriel 1X Tyrode-oplossing op bepaalde tijdstippen, waarbij de gewenste behandeling concentratie in het volume van 5 ml. Zorg behandeling toevoegingen tijdens het interval tussen het time-lapse overnames om te voorkomen dat het vastleggen van pipet in beelden.
  2. vMTF Contractiliteit Analyse
    1. Met behulp van coverslips gereserveerd in 1.4.8, meten PDMS substraatdikte met een profilometer21. Maak een dikte versus spin-tijd curve voor elke set van dekglaasjes. Gebruik deze curve te schatten de vMTF dikte voor elke dekglaasje gebruikt in een contractiliteit experiment.
    2. Meet de vMTF uitsteeksel lengten voor elk tijdstip gedurende het experiment, en bereken de bijbehorende kromtestraal (figuur 3B) via eerder gerapporteerde methoden 8.
    3. Bereken vMTF stress op elk moment point met vorige vMTF methoden 5.
      Opmerking: Gebruik de geschatte vMTF dikte berekend uit 3.2.1. Meet VSMC thickness via confocale beelden, zoals eerder gemeld 9. Verkrijgen PDMS Young's modulus van bedrijfsgegevens sheets.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het primaire doel van dit werk was om de levensvatbaarheid van micropatterned VSMCs op hydrofobe PDMS substraten uit te breiden. Dit werd bewerkstelligd door het opnemen van een microfluïdische afgiftesysteem patroonmatig genipin en fibronectine aan PDMS (figuur 1) te deponeren. Depositie van ECM eiwitten met behulp van microfluïdische aflevering leverde high fidelity overdracht van het kanaal patroon met blote PDMS tussen de lijnen van genipin en fibronectine (figuur 1D). De gehechte cellen (figuur 1E) vormen confluente monolagen nabootsen van de in vivo structuur van arteriële lamellen (figuur 2), vergelijkbaar met eerdere microcontact druktechnieken 5,10,16. Deze weefsels leverden reageert, contractiele constructen, wiens spanning werd gemeten met behulp vMTF techniek (figuur 3).

Kwalitatieve beoordeling van de levensvatbaarheid van het weefsel in de loop van twee weken toonde minimale achteruitgang op genipin-wijzied substraten (figuur 2A). Tissue samenvloeiing en uitlijning werden gehandhaafd over twee weken (Figuur 2B, 2C en 2D). Twee belangrijke stress-waarden werden berekend voor elke vMTF:. 1) basale toon en 2) geïnduceerde contractiliteit (figuur 3C en 3D) Basale toon is de stress onderhouden door gestimuleerde VSMCs bij evenwicht. Geïnduceerde contractiliteit is de extra stress veroorzaakt door stimulatie met endotheline-1. Zowel de basale toon en geïnduceerde contractiliteit toonde consistent gedrag over de twee weken de tijd natuurlijk, demonstreren vasoactieve weefsels in (figuur 3E en 3F). De lichte daling van de contractiliteit weefsel aan het einde van de test is het directe gevolg van het verminderde aantal cellen waaruit de weefsels, omdat serum uitgehongerde VSMC niet prolifereren 19. De toevoeging van een minimale basale niveau van serum kweekmedium kan dit resulteren in toekomstige werkzaamheden verlichten.

Figuur 2. Weefsels levensvatbaar blijven en succesvol Mimic in vivo arteriële Lamellar Structuur voor twee weken op Genipin gemodificeerde Substrates (A) Vertegenwoordiger fase contrast beelden van de weefsels in het offer tijdstippen in de loop van twee weken (schaal bar: 200 pm).. (B) Vertegenwoordiger immunohistochemie beelden van weefsels gefabriceerd op op dag 1 vaste-genipin gemodificeerde substraten, Dag 4, en dag 10 na serum uithongering (groen: f-actine filamenten, blauw: kernen (aangetoond dat de aanwezigheid van de cellen te vestigen), schaal bar .: 100 micrometer) (C) Procent samenloop gemeten door f-actine dekking (error bars: standaard error, n = 3-7) (D) Tissue uitlijning gemeten door f-actine oriëntatie orde parameter (OOP) 22 (fout bars. : standaard error, n = 3-7). © IOP Publishing. Verveelvoudigd en / of aangepast met toestemming. Alle rechten voorbehouden. Alle rechten voorbehouden. 19 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Tissue Contractiliteit wordt gehandhaafd in de loop van twee weken. (A) Vertegenwoordiger vMTF snijden regeling. (B) Schematische voorstelling van gesneden vMTF. Na afkoelen onder 32 ° C, PIPAAm oplost vrijgeven vMTF. Stress in de actieve cellaag veroorzaakt dat de passieve PDMS-laag te buigen. Meting van uitsteeklengte kan worden omgezet in een kromtestraal volgens in Grosberg et al. 8 afrondingsstraal wordt gebruikt om de gemiddelde doorsnede spanning te berekenen in het weefsel. (C) Sequential verzonden light beelden van representatieve contractiliteit assay (schaal bar: 1 mm). Tissues bereiken evenwicht, worden gestimuleerd met endotheline-1, vervolgens behandeld met HA-1077 naar volledige ontspanning mogelijk te maken. Onder:. Schema van zijaanzicht van geïdealiseerde weefsel gedurende het verloop van de assay (D) Representatieve spanningskromme voor de contractiliteit assay. Twee belangrijke stress-waarden worden berekend. Basale toon is het verschil tussen de evenwichtstoestand spanningstoestand en de ontspannen spanningstoestand. Geïnduceerde contractiliteit is de verandering in spanning van de evenwichtstoestand voor de endotheline-1 gestimuleerde toestand (E) Basal toon (foutbalken: standaardfout, n = 5 - 12) (F) Geïnduceerde contractiliteit (foutbalken:.. Standaardfout, n = 5 - 12). © IOP Publishing. Verveelvoudigd en / of aangepast met toestemming. Alle rechten voorbehouden. 19 Klik hier om een grotere versie te bekijkendit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier presenteren we een protocol dat gebaseerd is op eerder ontwikkelde vMTF technologie, waardoor langere experiment keer meer kenmerkend vasculaire chronische ziekteprocessen 1,23,24. Hiervoor micropatroon we genipin, die vooraf is aangetoond dat langdurige functionalisering van PDMS substraten 11 indienen waarbij een microfluidic depositietechniek op gemanipuleerde arteriële lamellen met verbeterde vasculair levensvatbaarheid van weefsel voor gebruik in MTF contractiliteitsstudies verkregen. McCain et al. ontwikkelde een alternatief micromolded gelatine hydrogel substraat voor uitgebreide cultuur van gemanipuleerde hartweefsels voor een aantal weken in een verwante MTF model 25.

Dit protocol leverde vMTFs die succesvol nagebootst arteriële lamel structuur (figuur 2) en functie (figuur 3) in de loop van twee weken. Terwijl de succesvolle afronding van de gepresenteerde protocol levert de gewenste result van cultuur maal verlengd voor de ziekte-relevante tijdsverloop (bijvoorbeeld de pathologische gevolgen van cerebrale vasospasme aanhoudende voor maximaal 14 dagen 26), een aantal veel voorkomende valkuilen ontstaan. Herhaaldelijk gebruik van PDMS microfluïdische inrichtingen leidt tot schadelijke schade die kan leiden tot gedeeltelijke of volledige blokkade van takken in de inrichting. Derhalve moeten nieuwe inrichtingen worden gebruikt voor elk experiment. Een ander probleem, terwijl het niet zo vaak voor, is onverwacht en inconsistent delaminatie van de weefsels. Deze gevallen leken willekeurige aard en zeldzaam voorkomen worden. Door observatie, weefsels vormen een aarts- of lumen-achtige structuur voordat delamineren. Wij observeerden ook dit gedrag in weefsels vervaardigd onder microcontact druktechnieken. Derhalve zijn wij van mening deze kwestie aan hetzij over- zaaien of fenotypische switch in de gekweekte VSMC die resulteert in abnormaal gedrag en niet een direct gevolg van de fabricagemethoden hier gepresenteerd worden.

De huidige MicrofluïdieksysteemIC ontwerp vereist lineaire stromingspatronen en als zodanig beperkt tot weefsels alignment in één hoofdrichting. Toepassing op weefsel vereisen meer complexe patronen, zoals het "brick wall" patroon van ventriculaire myocardiale structuur 27 zal uitgebreider microfluidic ontwerp vereist. We hebben niet gezaaid-genipin gemodificeerde substraten met andere celtypen. Echter, Genchi et al. toonde verlengde levensvatbaarheid van isotrope skeletspier on-genipin gemodificeerde PDMS 11. Zo voelen we ons vertrouwen in dat een minimaal gewijzigde versie van dit protocol is wijdverspreid toepasbaarheid op andere orgaansystemen in de toekomstige ontwikkeling van het orgel-on-a-chip technologie.

De stress berekeningswijze vMTFs basis van eerdere methoden 8 wordt begrensd door de relatieve contractiliteit in de weefsels en overeenkomstige snijlengte van de dunne films. Als te lang gesneden, zal films krullen op zichzelf. Als gesneden te kort, zullen films nietnd. Beide gevallen voorkomt goede analyse van contractiele eigenschappen toe te schrijven aan het model beperkingen. Juiste cut lengte moet worden verfijnd door middel van herhaalde experimenten. Implementatie van een lasergravure systeem, in Agarwal et al., Kunnen verbeteren reproduceerbaarheid en de kwaliteit van MTF snijden 28.

Het vermogen om beter recapituleren natieve weefsel structuur en functie in een strak gecontroleerde, onafhankelijk experimenteel systeem is een belangrijke achtervolging op het gebied van biotechnologie. Dit streven heeft geleid tot de ontwikkeling van verschillende in vitro weefsel nabootst en multifunctioneel, maar vereenvoudigd model organen-on-a-chip, het bevorderen van het begrip van fundamentele fysiologische en pathologische gedrag van orgaansystemen 29,30. Met behulp van afzetting van genipin op PDMS substraten, hebben we verlengde levensvatbaarheid en het onderhoud van vasculaire gladde spierfunctie cel aangetoond meer dan twee weken. Dit is een aanzienlijke verbetering ten opzichte van eerdere fabricage techniques, wat kan leiden tot delaminatie van weefsels en celdood na 4-7 dagen in kweek 19, en kunnen de ontwikkeling van robuustere slagader-on-a-chip methode steun. Vanwege de chronische aard van de meeste vaatziekten, deze vooruitgang het kader voor verschillende toekomstige onderzoeken naar de contractiele mechanismen betrokken bij specifieke vasculaire pathologieën.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip staining rack Electron Microscopy Sciences www.emsdiasum.com/ 72239-04
Microscope cover glass - 25 mm Fisher Scientific, Inc. www.fishersci.com 12-545-102
Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ #21458
1-butanol Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com 360465
Spincoater Specialty Coating Systems, Inc. www.scscoatings.com
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives (Dow Corning) www.ellsworth.com 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Fluorescent microbeads Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ 17151
Silicon wafers Wafer World, Inc. www.waferworld.com 2398
Photoresist  MicroChem Corp. www.microchem.com
Contact mask aligner Suss MicroTec www.suss.com
Developer MicroChem Corp. www.microchem.com
Tridecafluro-trichlorosilane UCT Specialties, Inc. www.unitedchem.com T2492
Surgical biopsy punch Integra LifeSciences Corp. www.miltex.com 33-31AA-P/25
Genipin Cayman Chemical www.caymanchem.com 10010622
1X phosphate buffered saline Mediatech, Inc. www.cellgro.com 21-031-CV
Fibronectin Corning, Inc. www.corning.com 356008
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com 15140-122
Umbillical artery smooth muscle cells Lonza www.lonza.com CC-2579
Tyrode's solution components Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com various
Stereomicroscope Zeiss www.zeiss.com 4350020000000000
Temperature-controlled platform Warner Instruments www.warneronline.com 641659; 640352; 641922
Endothelin-1 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com E7764-50UG
HA-1077 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com H139-10MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humphrey, J. D., Baek, S., Niklason, L. E. Biochemomechanics of cerebral vasospasm and its resolution: I. A new hypothesis and theoretical framework. Ann. Biomed. Eng. 35, 1485-1497 (2007).
  2. Hald, E. S., Alford, P. W. Smooth muscle phenotype switching in blast traumatic brain injury-induced cerebral vasospasm. Transl. Stroke Res. 5, 385-393 (2014).
  3. Olivetti, G., Anversa, P., Melissari, M., Loud, A. V. Morphometry of medial hypertrophy in the rat thoracic aorta. Lab. Invest. 42, 559-565 (1980).
  4. , Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
  5. Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
  6. Rhodin, J. A. G. Architecture of the vessel wall. Physiol. Rev. ed, B. erne,R. ., , American Physiology Society. (1979).
  7. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 19943-19948 (2011).
  8. Grosberg, A., Alford, P. W., McCain, M. L., Parker, K. K. Ensembles of engineered cardiac tissues for physiological and pharmacological study: heart on a chip. 11, 4165-4173 (2011).
  9. Alford, P. W., Nesmith, A. P., Seywerd, J. N., Grosberg, A., Parker, K. K. Vascular smooth muscle contractility depends on cell shape. Integr. Biol. (Camb). 3, 1063-1070 (2011).
  10. Win, Z., et al. Smooth muscle architecture within cell-dense vascular tissues influences functional contractility). Integr. Biol. (Camb). , (2014).
  11. Genchi, G. G., et al. Bio/non-bio interfaces: a straightforward method for obtaining long term PDMS/muscle cell biohybrid constructs). Colloid Surface B. 105, 144-151 (2013).
  12. Fessel, G., Cadby, J., Wunderli, S., van Weeren, R., Snedeker, J. G. Dose- and time-dependent effects of genipin crosslinking on cell viability and tissue mechanics - Toward clinical application for tendon repair. Acta Biomater. , (2013).
  13. Lima, E. G., et al. Genipin enhances the mechanical properties of tissue-engineered cartilage and protects against inflammatory degradation when used as a medium supplement. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 692-700 (2009).
  14. Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. J. Biomed. Mater. Res. A. , (2011).
  15. Satyam, A., Subramanian, G. S., Raghunath, M., Pandit, A., Zeugolis, D. I. In vitro evaluation of Ficoll-enriched and genipin-stabilised collagen scaffolds. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2012).
  16. Alford, P. W., et al. Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 12705-12710 (2011).
  17. Song, H., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. A microfluidic system for controlling reaction networks in time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, 768-772 (2003).
  18. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  19. Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. Long-term vascular contractility assay using genipin-modified muscular thin films. Biofabrication. 6, 045005 (2014).
  20. Han, M., Wen, J. K., Zheng, B., Cheng, Y., Zhang, C. Serum deprivation results in redifferentiation of human umbilical vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C50-C58 (2006).
  21. Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
  22. Volfson, D., Cookson, S., Hasty, J., Tsimring, L. S. Biomechanical ordering of dense cell populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15346-15351 (2008).
  23. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis. Hypertension. 38, 581-587 (2001).
  24. Kayembe, K. N., Sasahara, M., Hazama, F. Cerebral aneurysms and variations in the circle of Willis. Stroke. 15, 846-850 (1984).
  25. McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
  26. Weir, B., Grace, M., Hansen, J., Rothberg, C. Time course of vasospasm in man. 48, 173-178 (1978).
  27. McCain, M. L., Sheehy, S. P., Grosberg, A., Goss, J. A., Parker, K. K. Recapitulating maladaptive, multiscale remodeling of failing myocardium on a chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9770-9775 (2013).
  28. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).
  29. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).
  30. Meer, A. D., van den Berg, A. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse. Integr. Biol. (Camb). 4, 461-470 (2012).

Tags

Bioengineering substraat modificatie microfluïdische eiwitafzetting vasculaire gladde spiercellen cellevensvatbaarheid polydimethylsiloxaan genipin arteriële tissue engineering mechanische eigenschappen,
Microfluïdische Genipin Deposition Techniek voor Extended Cultuur van micropatterned Vascular Gespierd Thin Films
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, … More

Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films. J. Vis. Exp. (100), e52971, doi:10.3791/52971 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter