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Bioengineering

Microfluidic genipina Deposizione Tecnica per la cultura estesa di micropatterned vascolari muscolari Thin Films

Published: June 26, 2015 doi: 10.3791/52971
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota

Introduction

Malattie vascolari, come il vasospasmo cerebrale 1,2, ipertensione 3, 4 e aterosclerosi, si sviluppano lentamente, sono tipicamente di natura cronica, e coinvolgere disfunzionale forza-generazione da parte delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC). Il nostro obiettivo è di studiare queste disfunzioni vascolari lenta progressione che utilizzano metodi in vitro con un controllo più preciso delle condizioni sperimentali rispetto ai modelli in vivo. Film Abbiamo già sviluppato vascolari muscolari sottili (vMTFs) per la misurazione della contrattilità funzionale in vitro progettati tessuti cardiovascolari 5, ma questo metodo è stata limitata a relativamente studi a breve termine. Qui vi presentiamo una tecnica modifica substrato che espande la nostra precedente tecnica vMTF per misure a lungo termine.

Mentre l'endotelio è fondamentale anche in funzione vascolare generale, lamelle arteriosa progettato fornire un sistema modello utile per valutare i cambiamenti in vascolarecontrattilità durante la progressione della malattia. Per progettare un modello di tessuto malattia vascolare funzionale, sia la struttura e la funzione della lamella arteriosa, l'unità contrattile base del recipiente, deve essere riassunta con alta fedeltà. Arteriosa lamelle sono concentrici, fogli circonferenzialmente allineati di VSMC contrattili separati da fogli di elastina 6. Stampa microcontact di matrice extracellulare (ECM) proteine ​​su polidimetilsilossano (PDMS) substrati è stata precedentemente utilizzata per fornire spunti di orientamento per l'organizzazione dei tessuti di imitare allineato tessuto cardiovascolare 5,7-10. Tuttavia, i tessuti modellati utilizzando la stampa microcontact può perdere integrità dopo 3-4 giorni di cultura, limitando la loro applicabilità in studi cronici. Questo protocollo fornisce una soluzione a questo problema, sostituendo tecniche di stampa microcontact precedenti con una nuova tecnica di deposizione microfluidica.

Modificati PDMS substrati con genipina e f Genchi et al.ound prolungata sopravvivenza dei miociti fino a un mese di cultura 11. Qui, usiamo un approccio simile per estendere la cultura delle cellule muscolari lisce vascolari modellate su PDMS. Genipina, un derivato idrolitica naturale della frutta gardenia, è un candidato desiderabile per la modifica del substrato a causa della sua tossicità relativamente bassa rispetto ad agenti reticolanti simili e il suo uso crescente come biomateriale nel campo della riparazione tissutale 12,13 e ECM modifica 14, 15. In questo protocollo, la fibronectina è utilizzata come spunto di orientamento delle cellule, come in metodi di stampa microcontact precedenti; tuttavia, genipina viene depositata su PDMS substrati prima della fibronectina patterning. Così, come le cellule si degradano la matrice fantasia, ECM di nuova sintesi di VSMC collegati può legarsi al substrato PDMS genipina rivestite.

Questo protocollo utilizza un dispositivo di somministrazione microfluidica per due fasi genipina e ECM deposizione. Il design della microfluidica imita dispositivo microcomodelli di stampa ntact utilizzati per lamelle arteriosa progettato in studi precedenti 16. Quindi, ci aspettiamo che questo protocollo di cedere imita lamelle arteriosa che ricapitolano successo altamente allineato per struttura vivo e la funzione contrattile del lamelle arteriosa. Si valutano anche contrattilità tessuto per confermare che genipina è un composto modifica substrato adatto a lungo termine in vitro modelli di malattia vascolare.

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Protocol

Nota: L'obiettivo di questo protocollo è quello di costruire e utilizzare un film vascolare muscolare sottile (vMTF) con la struttura mostrata in Figura 1 per valutare la contrattilità durante la coltura prolungata delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) su PDMS substrati. Per prolungare la vitalità VSMC, utilizziamo il genipina composto reticolante. I substrati per questi vMTFs sono progettati per analizzare contrattilità tessuto sviluppato da Grosberg et al. 8 Metodi Altro vMTF 5 possono essere utilizzati anche con piccole modifiche al protocollo substrato fabbricazione presentato.

1. Supporto Fabrication

  1. Pulizia Coverslip
    1. Mettere 25 millimetri di diametro vetrini in un rack vetrino di colorazione. Inserire la griglia in un grande bicchiere o un contenitore (ad esempio, un 100 vuoto -. 1,000 microlitri pipetta contenitore punta).
    2. Aggiungere 70% di etanolo al contenitore per immergere completamente i coprioggetti. Li con ultrasuoni per almeno 30 minuti. </ Li>
    3. Rimuovere il rack vetrino dalla soluzione di etanolo. Lasciare i coprioggetti di aria secca per impiccagione il rack in una cappa di coltura sterile (per prevenire l'accumulo di particelle su vetrini) per 1- 2 ore.
      Nota: i vetrini devono essere completamente asciutti prima i seguenti passaggi.
  2. Poli (N-iso-propylacrylamide) Isolamento (PIPAAm) Strip su Coverslip
    1. Utilizzando nastro adesivo, il nastro dai lati di un coprioggetto pulito, lasciando una striscia esposta centrata sul vetrino (Figura 1A). Modificare la larghezza di questa striscia esposta in base all'applicazione e / o progettazione microfluidica.
    2. Mark i bordi delle strisce di nastro sul vetrino con un pennarello laboratorio per riferimento futuro (Figura 1A).
    3. Tagliare lungo il perimetro del vetrino per rilasciare dal piatto (Figura 1A, tratteggiata linea rossa).
  3. Poli (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Rivestimento
    1. Utilizzando una bilancia analitica, pesare 1 g di PIPolvere PAAM. Non utilizzare polimerizzato N-iso-propylacrylamide, che è un agente cancerogeno.
    2. Trasferire il PIPAAm di una provetta da centrifuga da 50 ml. Aggiungere 10 ml di 1-butanolo all'interno di una cappa chimica per produrre un 10% w / v soluzione. ATTENZIONE: Il punto di infiammabilità di 1-butanolo è di 37 ° C. Conservare la soluzione risultante in un armadio infiammabile ed evitare il riscaldamento.
    3. Lasciare che il PIPAAm di sciogliere per 10 minuti. Se la polvere è ancora visibile, mescolare la soluzione con un vortice mixer fino a quando tutti si dissolve in polvere.
      Nota: Le seguenti operazioni richiedono l'uso di un dispositivo a induzione di rotazione. Per ogni coprioggetto:
    4. Posizionare il vetrino registrato sul mandrino di spin coater con una pinza.
    5. Trasferire 150 ml di soluzione PIPAAm sul vetrino coprioggetti posizionando goccioline lungo il vetro esposta al centro del vetrino. Assicurare una copertura completa della superficie esposta.
    6. Cappotto Spin PIPAAm utilizzando la seguente ricetta:
      1. Rampa 10 sec a 3.000 giri al minuto. Pausa per 5 sec.
      2. Rampa 10 sec a 6,000 rpm. Pausa per 60 sec.
      3. Rampa 10 sec a 3.000 giri al minuto. Pausa per 5 sec.
    7. Mettere il vetrino in una capsula di Petri coperto con la PIPAAm rivolto verso l'alto. Lasciare asciugare per almeno 15 minuti.
    8. Rimuovere delicatamente il nastro adesivo da tutte le lamelle, lasciando l'intero vetrino esposta con un sottile strato di rivestimento PIPAAm in una striscia centrale.
  4. PDMS Coating
    1. Mescolare e degassare 15 g di PDMS in un rapporto di 10: crosslinker: 1 base. Aggiungere 7 - 8 gocce di sonicati 0,2 micron microsfere fluorescenti prima della miscelazione. Coprire la tazza di PDMS con un foglio di alluminio quando non in uso per evitare che polvere e altre particelle di contaminare il PDMS.
      Nota: Le seguenti operazioni richiedono l'uso di un dispositivo a induzione di rotazione. Per ogni coprioggetto:
    2. Mettere un copri PIPAAm rivestito sul mandrino di spin coater con una pinza.
    3. Trasferire PDMS sul vetrino, che copre almeno un terzo della superficie vetrino.
    4. Cappotto Spin utilizzando il seguente recipe:
      1. Rampa 5 sec a 500 giri al minuto. Dwell 5 sec.
      2. Rampa 5 sec a 1.000 giri al minuto. Dwell 5 sec.
      3. Rampa 10 sec a 3.000 giri al minuto. Dwell 10 sec.
      4. Rampa 10 sec a 4.000 giri. Dwell 60 sec.
      5. Rampa 10 sec a 2.000 giri al minuto. Dwell 15 sec.
      6. Rampa 10 sec a 1.000 giri al minuto. Dwell 10 sec.
      7. Rampa 5 sec a 500 giri al minuto. Dwell 5 sec.
    5. Mettere il vetrino in una capsula di Petri coperto con il PDMS rivolto verso l'alto. Registrare il tempo in cui il vetrino era spin-rivestito. Tenere traccia del tempo associato a ciascun coprioggetto tutto l'esperimento per un uso successivo nel determinare lo spessore del substrato PDMS.
    6. Porre la capsula di Petri contenente i coprioggetti in un forno a 90 ° C per almeno 1,5 ore per garantire la corretta stagionatura PDMS. Se un forno non è disponibile, lasciare che i vetrini cura per almeno 48 ore a temperatura ambiente.
    7. Togliere i coprioggetti dal forno e riporli in un cassetto buio fino al momento dell'uso.
    8. Mettere da parte ogni quarto vetrino fo successiva misura di spessore del substrato, in funzione del tempo spin coating, con un profilometro.

2. Patterning Microfluidic per Ingegneria tessuti

  1. Fabbricazione di dispositivi microfluidici
    1. Progettazione di Tissue Photomask Microfluidic
      1. Utilizzare qualsiasi programma appropriato progettazione assistita da computer per la progettazione di modelli di microfluidica. Per lamelle arteriosa composto da cellule muscolari lisce vascolari arteriose cordone ombelicale umano, utilizzare uno schema alternato di 10 micron canali con 10 micron pareti.
      2. Utilizzare canale binario ramificazione se possibile 17, ma altri disegni di ramificazione possono essere utilizzati. Diminuire la larghezza e la lunghezza di canali per ogni iterazione ramificazione fino al raggiungimento del modello tessuto desiderata spaziatura (pareti e canali, Figura 1B).
      3. Progettare il dispositivo di avere un unico ingresso per il trattamento superficiale posizionamento soluzione e una singola presa per l'applicazione del vuoto.
      4. Fabricate una fotomaschera con il motivo microfluidica (s), come descritto in precedenza 18.
    2. Fotolitografia Wafer Fabrication
      Nota: Eseguire fotolitografia in una camera sterile adatto o struttura similare. Per rendere wafer di silicio con modelli per il morbido fabbricazione litografica di dispositivi microfluidici tessuti (~ 20 - 25 altezza del canale micron) con fotolitografia:
      1. Pulire un wafer di silicio in acetone, metanolo e alcool isopropilico per 1 min ciascuna. Essiccare il wafer con una pistola di azoto.
      2. Precottura il wafer su una piastra calda per 5 minuti a 115 ° C per rimuovere l'umidità in eccesso.
      3. Cappotto Spin il wafer con SU-8 3025 photoresist utilizzando la seguente ricetta per produrre presenta 20 - 25 micron di altezza:
        1. Rampa 5 sec a 500 giri al minuto. Dwell 5 sec.
        2. Rampa 15 sec a 4.000 giri. Dwell 15 sec.
      4. Morbida bake il wafer su una piastra riscaldante a 95 ° C per 15 min.
      5. Caricare un fotomaschera, ed esporre tegli wafer per 16 secondi utilizzando un programma di contatto a vuoto su un assetto maschera contatti.
      6. Duro cuocere il wafer su una piastra riscaldante a 95 ° C per 4 min.
      7. Sviluppare il wafer per 6 minuti in sviluppatore. Poi, lavare il wafer due volte per 2 secondi in sviluppatore fresco e sciacquare il wafer con alcool isopropilico.
      8. Silanate la fantasia wafer O / N mettendo 2-3 gocce di tridecafluoro-triclorosilano in un piatto vuoto all'interno di un essiccatore a vuoto. Prop wafer utilizzando piastre di Petri in modo che sia la parte inferiore e superiore del wafer sono esposti.
        ATTENZIONE: Tridecafluro-triclorosilano è un liquido infiammabile e corrosivo. Dispositivi di protezione individuale adeguata e scarico locale è necessario per l'uso.
    3. Tissue Fabrication dispositivo a microfluidi
      1. Posizionare un silanata, fantasia wafer funzione rivolta verso l'alto in una capsula di Petri.
      2. Mescolare e degassare 100 g di PDMS con un rapporto di 10: crosslinker: 1 base. Versare il PDMS nel piatto, completamente e in modo uniforme che copre il wafer.
      3. Porre la capsula in un essiccatore a vuoto fino a che tutte le bolle d'aria vengono rimosse dai PDMS polimerizzato, di circa 30 min. Curare le PDMS nel piatto a 90 ° C per almeno 1,5 ore. Il tempo e la temperatura può essere regolata come dettato dalle linee guida produzione per ottenere una guarigione completa.
      4. Una volta che il PDMS è indurito, tagliare le PDMS intorno wafer con una lama di rasoio e rilasciare accuratamente wafer PDMS-coperti dal piatto. Rimuovere PDMS in eccesso sotto wafer e sbucciare lentamente PDM distanza dalla parte superiore del wafer.
      5. Posizionare il disco PDMS funzione rivolta verso l'alto in un piatto pulito e conservare il wafer al riparo dalla luce dopo l'uso.
      6. Tagliare il PDMS in eccesso intorno ai modelli con una lama di rasoio. Dispositivi tagliati in forma rettangolare (Figura 1C) per facilitare peeling di dispositivo da substrati in fasi successive. Tagli precisi non sono necessari, finché esiste ampio spazio per l'ingresso, di uscita, e l'area del modello di tessuto (Figura 1C).
      7. Pugnoingresso e di uscita fori (Figura 1C) utilizzando un 1 millimetro biopsia chirurgica pugno.
  2. Microfluidic Deposizione dispositivo
    Nota: In questo protocollo, consegna microfluidica è utilizzato per depositare genipina fantasia, l'agente reticolante chiave per la coltura tissutale a lungo termine, e fibronectina. I passaggi precedenti alla penicillina / streptomicina sterilizzazione (2.2.3) non devono avvenire in condizioni di sterilità, ma limitando la contaminazione e la polvere raccolta è incoraggiato in tutto il protocollo. Tutti i passaggi che si verificano dopo la sterilizzazione vetrino con penicillina / streptomicina (2.2.3) dovrebbero utilizzare una tecnica sterile. Nota: Questa porzione del protocollo deve essere iniziata il giorno prima della semina cellulare.
    1. Substrato e Microfluidic dispositivo Preparazione
      1. Sonicare i dispositivi microfluidici in etanolo al 70% per almeno 30 minuti.
      2. Asciugare i dispositivi microfluidici sonicati utilizzando aria compressa o azoto, e metterli in un piatto Petri wi° canale è dotato di faccia-up per prevenire usura su di caratteristiche.
      3. Posizionare un massimo di 10 vMTF vetrini substrato in un detergente UVO (copertura rimossa sul piatto in modo che la superficie è funzionalizzato) per 8 minuti.
      4. Togliere i coprioggetti UVO-trattati, e posizionare il dispositivi microfluidici funzione rivolto verso il basso su ogni slittamento, uno alla volta (orientamento dovrebbe essere simile alla figura 1C). Premere con decisione sui dispositivi per garantire una tenuta ermetica per i coprioggetti PDMS-rivestite.
    2. Deposizione di genipina e fibronectina
      1. Preparare una / soluzione genipina ml 5 mg aggiungendo 1 ml di DDH sterili 2 O ad un contenitore 5 mg di genipina liofilizzato. Mescolare la soluzione con un vortice-mixer. Mettere da parte a temperatura ambiente per almeno 30 minuti.
        Nota: La polvere è difficile da solubilizzare a RT, miscelazione in modo ripetitivo per almeno un minuto è spesso necessario.
      2. Rapidamente, una goccia di etanolo al 70% in ingresso di ciascun dispositivo per il dispositivo di innesco. Nota: l'ETHAnol dovrebbe stoppino attraverso i dispositivi.
      3. Dopo 5 - 10 min, aspirare accuratamente l'etanolo in eccesso in ingresso, immediatamente sostituendolo con 1X tampone fosfato salino (PBS) in entrata. Da questo punto in avanti, assicurarsi di non permettere l'ingresso di diventare perfettamente asciutta per evitare l'introduzione di aria al dispositivo.
      4. Inserire una punta aspiratore all'uscita di ciascun dispositivo. Disegna 1X PBS attraverso i dispositivi per lavare via l'etanolo. Lasciare una piccola quantità di 1X PBS in ingresso. Nota: Se ingresso appare quasi asciutta, aggiungere più PBS 1X.
      5. Aspirare eccesso 1X PBS in modo che solo una piccola quantità rimane in ingresso, prima dell'applicazione della soluzione genipina.
      6. Mettere 60 ml di soluzione genipina 5 mg / ml a ciascun ingresso (Figura 1D). Aspirare la soluzione genipina attraverso i dispositivi posizionando una punta aspiratore in uscita (Figura 1D). Assicurarsi non attirare tutta la soluzione attraverso, lasciando una piccola quantità di soluzione in ingresso.
      7. Luogo gocce (circa monetina piccola) di 1X PBS sia all'entrata ed all'uscita di mantenere bagnatura durante l'incubazione. Spostare il piatto contenente dispositivi ad un forno o in un incubatore umidificato (ambiente sterile non è necessario) impostati a 37 ° C, e incubare per 4 ore. Il piatto non deve essere coperto.
      8. Durante l'incubazione, risospendere fibronectina ad una concentrazione di 50 ug / ml in sterile DDH 2 O in ghiaccio per almeno 30 minuti prima dell'applicazione al dispositivo microfluidico.
      9. Dopo l'incubazione di genipina, aspirare tutti i restanti 1X PBS presso i punti vendita del dispositivo. Continuare ad applicare un aspiratore ad ogni uscita dispositivo, tirando attraverso il restante 1X PBS in ingresso.
      10. Mettere 100 ml di 50 mg / ml soluzione fibronectina ad ogni ingresso, aggiungendo una quantità minima di residuo 1X PBS in ingresso (Figura 1D).
      11. Disegnare la soluzione fibronectina attraverso i dispositivi utilizzando una punta aspiratore in uscita (
      12. Spostare il piatto scoperto contenente i dispositivi per un forno o incubatore a 37 ° C, e incubare per 24 ore. Nota: Il passo fibronectina non richiede bagnatura di ingresso ed uscita con 1X PBS. La piscina restante della fibronectina all'ingresso si asciuga. Questo è previsto.
    3. Sterilizzazione e preparazione per la semina delle cellule
      1. Preparare una soluzione della penicillina / streptomicina per la sterilizzazione di lamelle fantasia vMTF. Aggiungere 5 ml di penicillina / streptomicina (10.000 unità / ml; 10.000 mg / ml) a 500 ml di sterile PBS 1X.
      2. Porre la capsula contenente i dispositivi in ​​una cappa di biosicurezza sterile.
      3. Rimuovere con attenzione i dispositivi dai coprioggetto lentamente peeling il dispositivo in un angolo, mentre leggermente afferrando il vetrino in mano opposta.Nota: Questo passaggio richiede pratica per ridurre i danni vetrino nel processo di rimozione. Un'alternativa sta usando una siringa per iniettare 1X PBS in ingresso e / o di uscita per facilitare il rilascio del dispositivo.
      4. Mettere i coprioggetti in piatti a sei pozzetti sterili. Aggiungere almeno 5 ml di soluzione di penicillina / streptomicina in ciascun pozzetto. Porre le capsule in un incubatore sterile a 37 ° C per almeno 30 min.
      5. Dopo la sterilizzazione, aspirare la soluzione di penicillina / streptomicina, e seminare il coprioggetto con colta umano arteria ombelicale vascolare cells19 muscolatura liscia (Figura 1D). La concentrazione di semina per VSMCs è ~ 80.000 cellule per cm 2. Per ridurre il numero di cellule necessarie per ogni campione, utilizzare un riduttore per ridurre l'area di semina. Un esempio di un riduttore è il top taglio di un tubo da 15 ml attaccato al coprioggetto con grasso per vuoto sterile prima della semina.
      6. Incubare i coprioggetti seminate in un incubatore sterile a 37 ° C e 5% CO 2 (Figura 2A-B).
    4. A lungo termine Cultura vMTF Tissue
      1. Un giorno, dopo la semina, rimuovere il supporto cellulare e riduttori. Sciacquare i tessuti con PBS 1X. Aggiungere 4 ml di terreno cellulare privo di siero per indurre un fenotipo contrattile nel VSMCs 20.
      2. Ripetere il risciacquo 1X PBS e l'aggiunta di mezzo privo di siero fresco ogni altro giorno desiderato per coltura a lungo termine.

Figura 1
Figura 1. Microfluidic Dispositivo di proteine ​​di consegna. (A) nastrate off vetrino per il rivestimento PIPAAm. Red cerchio punteggiato: percorso di taglio per liberare coprioggetto (B) disegno AutoCAD Rappresentante del tessuto microfluidica modello di maschera.. Inserto: Particolare di ramificazione binario a AlternDELL'INDICE DI 10 micron x 10 micron modello di tessuto. (C) Collocamento di dispositivo a microfluidi su un substrato vetrino con ingresso e uscita indicata. (D) Schema di microfluidica proteine ​​patterning e la consegna. Immagine microscopio elettronico a scansione dei canali microfluidica (barra della scala:: 50 micron) da sinistra a destra; Schematico dettagliata del metodo di deposizione di proteine; Immunoistochimica fibronectina macchiato (barra della scala: 50 micron); Semina delle cellule con le cellule muscolari lisce vascolari. (E) Schema di tessuto fabbricato. 1 ° inserto: Particolare di costruzione a strati. 2 ° inserto: Particolare di genipina modifica di substrato PDMS dopo la deposizione microfluidica. © IOP Publishing. Riprodotto e / o modificati con il permesso. Tutti i diritti riservati. 19 , cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Tessuto Funzione Analisi con vMTF contrattilità Assay

Nota: Il test MTF contrattilità qui presentata è modellato dopo la tecnica sviluppata in Grosberg et al 8.

  1. vMTF contrattilità Experiment
    1. Collocare un campione di tessuto in un piatto a 100 mm. Aggiungere solution8 di sterile 1X Tyrode a pH 7,4 riscaldato a 37 ° C per coprire il campione.
    2. Utilizzare una lama di rasoio per fare diversi tagli paralleli perpendicolari al bordo PIPAAm. Effettuare tagli in modo che produce sezioni di tessuto più ampio che sarà il vMTFs (con larghezza ~ 2 mm) alternate a strisce sottili (Figura 3A, tagli laterali). Per effettuare tagli puliti, posizionare una lama di rasoio in contatto con il campione e saldamente trascinarli sul lato.
    3. Ruotare il piatto 90 ° e fare due tagli paralleli rettilinei nel mezzo del tessuto, parallelamente alla striscia di PIPAAm (Figura 3A, tagli finali). Rimuovere e smaltire la striscia sciolto di tessuto tra queste taglios e le strisce sottili tra vMTFs (taglio nel passaggio precedente) per impedire il film adiacenti da fare contatto.
    4. Lasciare il campione riposare a temperatura ambiente per 10 min, o fino a quando tutto il PIPAAm è dissolta. Nota: se PIPAAm rimane in passi successivi, campione può essere restituito al piatto di taglio di sciogliere PIPAAm residua. Un raschiatura dolce della parte inferiore di vMTF può aiutare nella rimozione PIPAAm, come necessario.
    5. Mettere un piccolo punto di grasso per vuoto in un ambiente pulito 35 millimetri piastra di Petri. Aggiungere 5 ml di soluzione fresca, sterile 1X Tyrode a 37 ° C. Trasferire il vetrino con i film di taglio del piatto 100 millimetri al piatto 35 mm, e premere sul grasso per vuoto per impedire il movimento del vetrino.
    6. Porre la capsula in una piattaforma a temperatura controllata sul palco stereomicroscopio.
    7. Capture time-lapse trasmessa e immagini fluorescenti a intervalli desiderati (ad es., 30 sec) durante test trattamento.
    8. Di serie trattare vMTFs con 50 nm endotelina-1 per 20 min (contrazione indotta) e 100 mM HA-1077 per 30 min (rilassamento dei tessuti). Aggiungere soluzioni concentrate di ogni trattamento al piatto sperimentale contenente 5 ml di soluzione sterile di 1X Tyrode in momenti specifici, ottiene il trattamento concentrazione desiderata nel volume 5 ml. Fai aggiunte di trattamento durante l'intervallo tra le acquisizioni di immagini time-lapse per evitare la cattura pipetta in immagini.
  2. vMTF contrattilità Analisi
    1. Utilizzando coprioggetto accantonati 1.4.8, misurare lo spessore del substrato PDMS con un profilometer21. Creare uno spessore rispetto curva del tempo di rotazione per ogni set di lamelle. Utilizzare questa curva per stimare lo spessore vMTF per ogni coprioggetto utilizzato in un esperimento contrattilità.
    2. Misurare le lunghezze di proiezione vMTF per ogni punto di tempo durante l'esperimento, e calcolare i raggi di curvatura associata (figura 3B) con metodi precedentemente riportati 8.
    3. Calcola lo stress vMTF in ogni momento point con precedenti metodi vMTF 5.
      Nota: utilizzare lo spessore vMTF stima calcolata da 3.2.1. Misurare spessore VSMC utilizzando immagini confocale, come riportato in precedenza 9. Ottenere modulo di PDMS Young da schede tecniche dell'azienda.

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Representative Results

L'obiettivo principale di questo lavoro è stato quello di estendere la validità di VSMCs micropatterned su PDMS idrofobiche substrati. Ciò è stato realizzato incorporando un sistema di consegna microfluidico depositare genipina modellata e fibronectina su PDMS (Figura 1). Deposizione di proteine ​​ECM utilizzando l'invio microfluidica prodotto alto trasferimento fedeltà del modello di canale con PDMS nude tra le linee di genipina e fibronectina (Figura 1D). Le cellule attaccate (Figura 1E) monostrati confluenti modulo mimano la struttura in vivo di lamelle arteriosa (Figura 2), simile a microcontatto precedente metodi di stampa 5,10,16. Questi tessuti hanno prodotto reattivo, costrutti contrattili, la cui tensione è stata misurata utilizzando la tecnologia vMTF (Figura 3).

Valutazione qualitativa di vitalità del tessuto nel corso di due settimane ha mostrato un deterioramento minimo sul genipina-modifisubstrati Ed (Figura 2A). Tissue confluenza e l'allineamento sono stati mantenuti più di due settimane (Figura 2B, 2C e 2D). Due valori di sollecitazione chiave sono stati calcolati per ogni vMTF:. 1) tono basale e 2) la contrattilità indotta (Figura 3C e 3D) tono basale è lo stress mantenuto da VSMC non stimolate all'equilibrio. Contrattilità Induced è lo sforzo supplementare indotto dalla stimolazione con endotelina-1. Sia il tono basale e la contrattilità indotto hanno mostrato un comportamento coerente nel corso tempo di due settimane, dimostrando tessuti vasoattivi tutto (Figura 3E e 3F). Il leggero calo contrattilità del tessuto alla fine del saggio è il risultato diretto del ridotto numero di cellule che compongono il tessuto, poiché VSMC siero starved non proliferano 19. L'aggiunta di un livello basale minimo di siero a mezzo di coltura può alleviare questo risultato in lavoro futuro.

Figura 2. I tessuti rimanere vitali e con successo Mimic in vivo arteriosa lamellare Struttura per due settimane su substrati genipina modificati (A) Immagini rappresentative contrasto di fase di tessuti in sacrificio momenti durante il corso di due settimane (bar scala: 200 micron).. (B) le immagini di immunoistochimica rappresentativi di tessuti fabbricati su substrati genipina modificati fissato a giorno 1, 4 ° giorno, e il giorno 10 dopo deprivazione di siero (verde: f-actina filamenti blu: nuclei (dimostrato di stabilire la presenza di cellule), barra della scala .: 100 micron) (C) confluenza Percentuale misurato con copertura f-actina (barre di errore: errore standard, n = 3-7) (D) di allineamento del tessuto misurata dal parametro d'ordine orientamento f-actina (OOP) 22 (barre di errore. : errore standard, n = 3-7). © IOP Publishing. Riprodotto e / o modificati con il permesso. Tutti i diritti riservati. Tutti i diritti riservati. 19 , cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. tessuto contrattilità è mantenuta per tutto il corso di due settimane. (A) schema Rappresentante vMTF taglio. (B) Schema di taglio vMTF. Dopo raffreddamento inferiore a 32 ° C, si dissolve PIPAAm, rilasciando vMTF. Lo stress nello strato cella attiva provoca lo strato PDMS passivo piegare. Misurazione della lunghezza di proiezione può essere convertito in un raggio di curvatura secondo metodi Grosberg et al. 8 Raggio di curvatura viene utilizzato per calcolare la sollecitazione trasversale medio nel tessuto. (C) sequenziale lig trasmessaimmagini ht di rappresentante saggio contrattilità (barra in scala 1 mm). I tessuti raggiungono l'equilibrio, vengono stimolati con endotelina-1, poi trattato con HA-1077 per consentire un completo relax. In basso:. Schematica della vista laterale del tessuto idealizzato nel corso del test (D) curva sforzo Rappresentante per il saggio contrattilità. Due valori di sollecitazione chiave vengono calcolati. Tono basale è la differenza tra lo stato di stress di equilibrio e lo stato tensionale rilassato. Contrattilità indotta è il cambiamento di stress da stato di equilibrio allo stato di endotelina-1 stimolato (E) tono basale (barre di errore: errore standard, n = 5-12) (F) contrattilità indotta (barre di errore:.. Errore standard, n = di 5 - 12). © IOP Publishing. Riprodotto e / o modificati con il permesso. Tutti i diritti riservati. 19 , cliccate qui per vedere una versione più grandequesta cifra.

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Discussion

Qui, vi presentiamo un protocollo che si basa sulla tecnologia vMTF precedentemente sviluppato, consentendo tempi prolungati esperimento più tipico dei percorsi croniche malattie vascolari 1,23,24. Per realizzare ciò, si micropattern genipina, che è stato precedentemente dimostrato di fornire funzionalizzazione a lungo termine di substrati PDMS 11, utilizzando una tecnica di deposizione microfluidi cedere lamelle arteriosa progettato con migliorata viabilità tessuto vascolare per esperimenti contrattilità MTF. McCain et al. sviluppato un micromolded substrato di gelatina idrogel alternativa per la cultura estesa di tessuti cardiaci ingegnerizzati per diverse settimane in un modello di sistema multilaterale di negoziazione correlate 25.

Questo protocollo prodotto vMTFs riproducenti successo struttura lamella arteriosa (Figura 2) e la funzione (figura 3) nel corso di due settimane. Mentre il completamento del protocollo presentato produce la res desideratiult dei tempi della cultura estese per decorso della malattia rilevanti (ad esempio, gli effetti patologici del vasospasmo cerebrale persistere fino a 14 giorni 26), un paio di errori comuni presentano. L'uso ripetuto di PDMS dispositivi microfluidici provoca danni deleterio che può provocare ostruzione parziale o completa di rami nel dispositivo. Pertanto, i nuovi dispositivi devono essere usati per ogni esperimento. Un altro problema, anche se non così comune, è delaminazione inaspettato e incoerente dei tessuti. Questi avvenimenti sembravano casuali in natura e raro in caso. Per l'osservazione, tessuti formano una struttura dell'arciprete o lume-come prima delaminazioni. Abbiamo anche osservato questo comportamento in tessuti fabbricati utilizzando tecniche di stampa microcontact. Pertanto, crediamo che questo problema sia il risultato di una sovra-semina o uno switch fenotipica nelle VSMC coltivati ​​che si traduce in un comportamento anomalo e non una conseguenza diretta dei metodi di fabbricazione qui presentati.

Il microfluidi correntedisegno ic richiede schemi di flusso lineari e, come tale, è limitata a tessuti con allineamento in un'unica direzione principale. Applicazione ai tessuti che richiedono patterning più complessi, come ad esempio il modello "muro di mattoni" della struttura del miocardio ventricolare 27, richiederà più elaborato disegno microfluidica. Non abbiamo seminato substrati genipina modificati con altri tipi di cellule. Tuttavia, Genchi et al. ha mostrato esteso vitalità del muscolo scheletrico isotropo su genipina modificati PDMS 11. Così, siamo sicuri che una versione minimamente modificata di questo protocollo ha diffuso applicabilità ad altri sistemi di organi in futuro lo sviluppo di tecnologie d'organo-on-a-chip.

Il metodo di calcolo stress per vMTFs basato su metodi precedenti 8 è limitata dalla relativa contrattilità nei tessuti e relativa lunghezza di taglio dei film sottili. Se tagliare troppo lungo, film saranno arricciarsi su se stessi. Se tagliare troppo breve, i film non sarannond. Entrambi i casi impedisce il corretto analisi delle proprietà contrattili causa di modellare limitazioni. Lunghezza di taglio adeguata dovrebbe essere raffinato attraverso esperimenti ripetuti. L'implementazione di un sistema di incisione laser, come nel Agarwal et al., Può migliorare la ripetibilità e la qualità della MTF taglio 28.

La capacità di ricapitolare migliore struttura tessuto nativo e funzione in un sistema sperimentale autonomo strettamente controllato è una ricerca chiave nel campo della bioingegneria. Questa ricerca ha portato allo sviluppo di diversi imita in vitro di tessuto e multi-funzionale, tuttavia semplificate organi-on-a-chip modello, avanzando la comprensione della fisiologica fondamentale e comportamenti patologici di organi 29,30. Utilizzando deposizione di genipina su substrati PDMS, abbiamo dimostrato la vitalità delle cellule esteso e mantenimento della funzione della muscolatura liscia vascolare più di due settimane. Si tratta di un miglioramento significativo rispetto alle precedenti fabbricazione tecniques, che può portare alla delaminazione dei tessuti e delle cellule morte dopo 4-7 giorni di coltura 19, e può essere di aiuto allo sviluppo di metodi di arteria-on-a-chip più robuste. A causa della natura cronica della maggior parte delle malattie vascolari, questo progresso fornisce il quadro per una serie di future indagini sui meccanismi coinvolti nella contrattili specifiche patologie vascolari.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip staining rack Electron Microscopy Sciences www.emsdiasum.com/ 72239-04
Microscope cover glass - 25 mm Fisher Scientific, Inc. www.fishersci.com 12-545-102
Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ #21458
1-butanol Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com 360465
Spincoater Specialty Coating Systems, Inc. www.scscoatings.com
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives (Dow Corning) www.ellsworth.com 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Fluorescent microbeads Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ 17151
Silicon wafers Wafer World, Inc. www.waferworld.com 2398
Photoresist  MicroChem Corp. www.microchem.com
Contact mask aligner Suss MicroTec www.suss.com
Developer MicroChem Corp. www.microchem.com
Tridecafluro-trichlorosilane UCT Specialties, Inc. www.unitedchem.com T2492
Surgical biopsy punch Integra LifeSciences Corp. www.miltex.com 33-31AA-P/25
Genipin Cayman Chemical www.caymanchem.com 10010622
1X phosphate buffered saline Mediatech, Inc. www.cellgro.com 21-031-CV
Fibronectin Corning, Inc. www.corning.com 356008
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com 15140-122
Umbillical artery smooth muscle cells Lonza www.lonza.com CC-2579
Tyrode's solution components Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com various
Stereomicroscope Zeiss www.zeiss.com 4350020000000000
Temperature-controlled platform Warner Instruments www.warneronline.com 641659; 640352; 641922
Endothelin-1 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com E7764-50UG
HA-1077 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com H139-10MG

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References

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Tags

Bioingegneria emissione 100 modifica substrato microfluidica deposizione di proteine cellule muscolari lisce vascolari vitalità cellulare polidimetilsilossano genipina ingegneria dei tessuti arteriosa le proprietà meccaniche,
Microfluidic genipina Deposizione Tecnica per la cultura estesa di micropatterned vascolari muscolari Thin Films
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