Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Micropatterned Vasküler Musküler İnce Filmlerin Genişletilmiş Kültür mikroakışkan Genipin Biriktirme Tekniği

Published: June 26, 2015 doi: 10.3791/52971
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota

Introduction

Serebral vazospazm 1,2, hipertansiyon 3 ve ateroskleroz 4 gibi vasküler hastalıklar, yavaş gelişen doğada tipik olarak kronik ve vasküler düz kas hücreleri (VSMC'Ier) ile işlevsel kuvvet kuşak içerir. Biz in vivo modellere göre deneysel koşullar ince kontrolü ile in vitro yöntemleri kullanarak bu yavaş ilerleyen damar işlev bozuklukları incelemek hedefliyoruz. In vitro fonksiyonel kontraktilite ölçmek için biz daha önce geliştirilen damar kas ince filmler (vMTFs) kardiyovasküler dokuları 5 mühendislik, ancak bu yöntem nispeten kısa vadeli çalışmalar sınırlı kalmıştır. Burada, biz uzun vadeli ölçümler için önceki vMTF tekniği genişleyen bir alt tabaka değişiklik tekniğini sunuyoruz.

Endotel genel vasküler işlev kritik olsa da, işlenmiş arter lameller vasküler değişiklikleri değerlendirmek için yararlı bir model sistemi sağlamakhastalığın ilerlemesi sırasında kontraktilite. Fonksiyonel vasküler hastalık doku modeli, yapısı ve arteriyel lamel işlevini hem mühendis, geminin temel kasılma birimi, yüksek sadakat ile değinmeyecek gerekir. Arter lameller 6 elastin tabakaları ile ayrılmış kontraktil VSMC'Ierin eş, çevresel olarak hizalanmış levhalar vardır. Polidimetilsiloksan (PDMS) yüzeylerde hücre dışı matris (ECM) proteinleri microcontact baskı önceden kardiyovasküler doku 5,7-10 hizalanmış taklit eden doku organizasyonu için rehberlik ipuçları sağlamak için kullanılır olmuştur. Ancak, dokular kronik çalışmalarda uygulanabilirliğini sınırlayan, kültürde 3-4 gün sonra bütünlüğünü kaybedebilir microcontact baskı kullanarak desenli. Bu protokol, yeni bir mikroakışkan biriktirme tekniği ile önceki microcontact baskı teknikleri değiştirerek bu soruna bir çözüm sağlar.

Genipin ve f Genchi ve ark., Modifiye edilmiş PDMS substratlaround kültürde 11 bir ay miyositlerin canlılığı kadar uzamış. Burada, biz PDMS üzerinde desenli damar düz kas hücrelerinin kültürünü genişletmek için benzer bir yaklaşım kullanın. Genipin, gardenya meyve doğal hidrolitik türevi, içindeki çapraz bağlama maddeleri ve doku onarımı 12,13 ile ECM modifikasyon 14 alanlarında biyomalzeme olarak artan kullanımı ile karşılaştırıldığında nedeniyle nispeten düşük toksisiteye alt-tabaka modifikasyonu için arzu edilen bir aday 15. Bu protokol, fibronektin, önceki microcontact baskı yöntemlerde olduğu gibi, bir cep yönlendirme işaret olarak kullanılmaktadır; Bununla birlikte, genipin fibronektin desen önce PDMS substratlar üzerine tatbik edilir. Hücreler desenli matrisi bozan Dolayısıyla, ekli VSMC'Ierin gelen yeni sentezlenmiş ECM genipin kaplı PDMS substrata bağlanabilir.

Bu protokol, iki aşamalı genipin ECM tevdi edilmesi için mikro-akışkan aktarım cihazını kullanmaktadır. Mikroakışkan cihaz taklit microco tasarımıDaha önceki çalışmalarda 16 tasarlanmış arteriyel ince tabakalar için kullanılan ntact baskı kalıpları. Böylece, bu protokol başarıyla in vivo yapısı ve arteriyel lamellerin kasılma fonksiyonunda yüksek hizalanmış özetlemek arteriyel lamel taklit verim bekliyoruz. Biz de bu genipin in vitro damar hastalığı modellerinde uzun vadede uygun bir substrat değişiklik bileşik onaylamak için doku kasılma değerlendirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Bu protokolün amacı oluşturabilir ve PDMS substratlar üzerinde, vasküler düz kas hücreleri (VSMC'Ier) uzatılmış kültür sırasında kasılma değerlendirmek için, Şekil 1 'de gösterilen yapıya sahip bir vasküler kas ince film (vMTF) kullanılmasıdır. VSMC canlılığını uzatmak için, çapraz bağlayıcı bileşik genipin kullanmaktadır. Grosberg ve ark., 8 Diğer vMTF yöntemleri 5 sunulmuştur alt-tabaka imalat protokolü ince değişikliklerle, kullanılabilir tarafından geliştirilen bu vMTFs için substrat doku kasılmasını analiz etmek için tasarlanmıştır.

1. Yüzey Fabrikasyon

  1. Lamel Temizlik
    1. Bir lamel boyama rafa 25 mm çaplı cam lamelleri yerleştirin. Büyük bir beher veya kabın içine yerleştirin raf (örneğin, boş bir 100 -. 1000 ul pipetlemeyin ucu konteyner).
    2. Tam lamelleri sokmak için kaba% 70 etanol ekleyin. En az 30 dakika boyunca, onları sonikasyon. </ Li>
    3. Etanol çözeltisinden lamel raf çıkarın. 1- 2 saat süreyle (lamelleri partikül birikimini önlemek için) bir steril kültür kaputu raf asarak kuru hava lamelleri bırakın.
      Not: lamelleri önce aşağıdaki adımlara tamamen kuru olmalıdır.
  2. Lamel Poli (N-izo-propylacrylamide) (PIPAAm) Şerit İzolasyon
    1. Lamel (Şekil 1A) merkezli bir açık şeridi bırakarak, temizlenmiş bir lamel kenarlarında kapalı yapışkan bant, bant kullanarak. Uygulama ve / veya mikroakışkan tasarıma dayanan bu açık şerit genişliğini değiştirin.
    2. Mark, daha sonra referans (Şekil 1A) bir laboratuar kalemle lamel bandı şeritlerinin kenarları.
    3. Çanak (Şekil 1A, noktalı kırmızı çizgi) çıkartmak için lamel çevresinde kesin.
  3. Poli (N-izo-propylacrylamide) (PIPAAm) Kaplama
    1. Bir analitik terazi kullanılarak PI 1 g ağırlığındaPAAm toz. Kanserojen polimerleşmemiş N-iso-propylacrylamide kullanmayın.
    2. 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne PIPAAm aktarın. % 10 ağırlık / hacim solüsyonu elde etmek için kimyasal bir kaput içinde 1-bütanol 10 ml ilave edilir. DİKKAT: 1-bütanol parlama noktası 37 o C olup Yanıcı kabinede nihai çözeltinin saklayın ve ısıtma kaçının.
    3. PIPAAm 10 dakika boyunca çözünmeye bırakılır. Toz hala görünür ise, tüm toz eriyene kadar bir vorteks-mikser kullanılarak çözüm karıştırın.
      Not: Aşağıdaki adımlar bir eğirme kaplayıcı kullanılmasını gerektirir. Her lamel için:
    4. Forseps ile spin lak aynası üzerinde bantlanmış lamel yerleştirin.
    5. Lamel merkezinde açık cam boyunca damlacıkları koyarak lamel üzerine PIPAAm çözeltisi 150 ul aktarın. Maruz kalan alanın bütünüyle örtülmesinin sağlanması.
    6. Spin kat PIPAAm aşağıdaki tarifi kullanarak:
      1. 3,000 rpm 10 sn Rampa. 5 saniye boyunca yaşamak.
      2. Rampa 10 sn 6,000 rpm. 60 saniye boyunca yaşamak.
      3. 3,000 rpm 10 sn Rampa. 5 saniye boyunca yaşamak.
    7. Yukarı bakacak PIPAAm ile kaplı Petri kabı içine lamel yerleştirin. En az 15 dakika boyunca havada kurumaya bırakın.
    8. Dikkatle bir merkez şerit PIPAAm kaplama ince bir tabaka ile maruz tam lamel bırakarak, tüm lamelleri gelen yapışkan bandı çıkarın.
  4. PDMS Kaplama
    1. Mix ve 10 PDMS 15 gr degas: 1 baz: çapraz bağlayıcı oranı. Karışmadan önceki sonicated 0.2 mikron floresan mikro 8 damla - 7 ekleyin. PDMS karışmasını toz ve diğer parçacıkları önlemek için kullanılmadığı zaman alüminyum folyo ile PDMS fincan örtün.
      Not: Aşağıdaki adımlar bir eğirme kaplayıcı kullanılmasını gerektirir. Her lamel için:
    2. Forseps ile spin lak ayna üzerinde PIPAAm kaplı lamel yerleştirin.
    3. Lamel alanının en az üçte birini kapsayan bir örtücü camın üzerine PDMS aktarın.
    4. Aşağıdaki recip kullanarak Spin cekete:
      1. 500 rpm 5 sn Rampa. 5 sn yaşamak.
      2. 1000 rpm 5 sn Rampa. 5 sn yaşamak.
      3. 3,000 rpm 10 sn Rampa. 10 sn yaşamak.
      4. 4,000 rpm 10 sn Rampa. 60 sn yaşamak.
      5. 2,000 rpm 10 sn Rampa. 15 sn yaşamak.
      6. 1000 rpm 10 sn Rampa. 10 sn yaşamak.
      7. 500 rpm 5 sn Rampa. 5 sn yaşamak.
    5. PDMS yukarı bakacak şekilde bir kapalı Petri kabı içine lamel yerleştirin. Lamel spin-kaplı olan zamanını kaydedin. PDMS substrat kalınlığını belirlemede daha sonra kullanılmak üzere deney boyunca her lamel ile ilişkili zaman takip edin.
    6. Uygun PDMS yapışma için, en az 1.5 saat için 90 ° C bir fırında lamelleri içeren Petri tabağına yerleştirin. Bir fırın mevcut değilse, lamelleri oda sıcaklığında en az 48 saat süre ile tedavi sağlar.
    7. Fırından lamelleri çıkarın ve kullanmaya hazır olana kadar karanlık bir çekmecede saklayabilirsiniz.
    8. Her dördüncü lamel f kenaraya da bir profilometre ile döndürerek kaplama, zamanın bir fonksiyonu olarak alt-tabaka kalınlığı, daha sonra ölçümü.

Mühendislik Dokular 2. mikroakışkan Desenlendirme

  1. Mikroakışkan Cihazlar İmalatı
    1. Doku mikroakışkan photomask Tasarımı
      1. Mikroakışkan desen tasarımı uygun herhangi bir bilgisayar destekli tasarım programı kullanın. Insan göbek kordonu damar vasküler düz kas hücreleri oluşan arter ince tabakalar için, 10 um duvarlar 10 um kanalların bir alternatif modeli kullanırlar.
      2. Olası 17 halinde dallanma ikili kanal kullanarak, ancak diğer dallanma tasarımları kullanılabilecektir. (Duvarlar ve kanallar, Şekil 1B) aralığı istenen doku deseni elde kadar her dallanma yineleme için kanalların genişliğini ve uzunluğunu düşürün.
      3. Yüzey işleme solüsyonu yerleştirilmesi ve vakum uygulanması için, tek bir çıkış için tek bir giriş için cihaz tasarımı.
      4. FabDaha önce tarif edildiği gibi 18, mikro-akışkan bir tasarım (ler) ihtiva eden bir ışık-maskesi ricate.
    2. Fotolitografik Gofret İmalatı
      Not: Uygun bir temiz oda veya benzeri tesiste fotolitografi gerçekleştirin. Doku mikroakışkan cihazlar (~ 20-25 mikron kanal yükseklik) yumuşak litografi üretim için desenleri ile silikon gofret yapmak için kullanan fotolitografi:
      1. 1 dakika her biri için, aseton, metanol, ve isopropil alkol içinde bir silikon gofret temizleyin. Bir azot tabancası ile gofret kurulayın.
      2. Fazla nemi çıkarmak için 115 ° C'de 5 dakika boyunca sıcak bir plaka üzerinde gofret Prebake.
      3. : Yüksekliği 25 mm - Spin kat verim için aşağıdaki tarifi kullanarak SU-8 3025 fotorezist ile gofret 20 özellikleri
        1. 500 rpm 5 sn Rampa. 5 sn yaşamak.
        2. 4,000 rpm 15 saniye Rampa. 15 sn yaşamak.
      4. Yumuşak fırında 15 dakika boyunca 95 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde ince bisküvi.
      5. T photomask yükleyin ve maruzo bir kişi maske hizalama üzerinde bir vakum kontak programını kullanarak 16 saniye boyunca gofret.
      6. Sabit 4 dakika boyunca 95 ° C'de bir sıcak plaka üzerinde gofret fırında.
      7. Geliştirici 6 dakika gofret geliştirin. Daha sonra, taze, geliştirici 2 saniye boyunca iki kez gofret yıkayın ve izopropil alkol ile gofret yıkayın.
      8. Bir vakum desikatörde içinde boş bir tabak tridekaflor-trichlorosilane 3 damla - 2 yerleştirerek desenli gofret O / N Silanate. Gofret alt ve üst hem de maruz böylece Petri yemekleri kullanarak gofret Prop.
        DİKKAT: Tridecafluro-trichlorosilane yanıcı ve aşındırıcı bir sıvıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman ve yerel egzoz kullanımı için gereklidir.
    3. Doku mikroakışkan Aygıt Fabrikasyon
      1. Petri kabı içinde silanlanmış, desenli gofret özelliği tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
      2. Mix ve 10 ile PDMS 100 gr degas: 1 baz: çapraz bağlayıcı oranı. Tamamen ve eşit gofret kapsayan, çanak içine PDMS dökün.
      3. Tüm hava kabarcıkları, vulkanize edilmemiş PDMS yaklaşık 30 dakika kaldırılana kadar bir vakum desikatörde çanak yerleştirin. En az 1.5 saat boyunca 90 ° C 'de çanak PDMS Cure. Tam bir tedavi elde etmek için üretim kurallarına emrettiği gibi Zaman ve sıcaklık ayarlanabilir.
      4. PDMS tedavi edildikten sonra, bir jilet ile gofret etrafında PDMS kesip dikkatlice çanak PDMS kaplı gofret bırakın. Gofret altında aşırı PDMS çıkarın ve yavaşça gofretin üst uzak PDMS soyun.
      5. Temiz bir tabak PDMS diski özelliği tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve kullanımdan sonra ışıktan uzak gofret saklayın.
      6. Bir jilet kullanarak desen etrafında aşırı PDMS kesip. Dikdörtgen şeklinde (Şekil 1C) içine Kesme aygıtları, sonraki adımlarda substratların cihazın soyulması kolaylaştırmak içindir. Hassas kesimler sürece geniş bir alanı girişi, prize ve doku desen alanı (Şekil 1C) için mevcut olduğu, gerekli değildir.
      7. Punch1 mm'lik bir cerrahi biyopsi zımbası ile giriş ve çıkış delikleri (Şekil 1C).
  2. Mikroakışkan Cihaz Biriktirme
    Not: Bu protokol, mikroakışkan dağıtım desenli genipin, uzun vadeli bir doku kültür için önemli çapraz bağlama maddesi, aynı zamanda fibronektin yatırmak için kullanılır. Penisilin / streptomisin sterilizasyon (2.2.3) öncesinde Adımlar steril koşullarda gerçekleşmesi gerekmez, ancak sınırlayıcı kirlilik ve toz toplama protokolü boyunca teşvik edilmektedir. Penisilin / streptomisin (2.2.3) ile lamel sterilizasyon sonrasında meydana gelen tüm adımlar steril tekniği kullanmak gerekir. Not: protokolün bu bölümü öncesinde hücre tohumlama bir gün başlatılması gerekir.
    1. Yüzey ve mikroakışkan Cihaz Hazırlama
      1. En az 30 dakika boyunca% 70 etanol içinde mikroakışkan cihazlar sonikasyon.
      2. Basınçlı hava ya da azot kullanılarak sonike mikroakışkan cihazlar kurutulur ve bir Petri tabağı wi koyuninci kanal özellikleri Gereksiz aşınmaları önlemek için yüz-up bulunmaktadır.
      3. 8 dakika boyunca bir UVO temizleyici (yüzey Fonksiyonlu böylece kapak çanak kaldırıldı) 10 vMTF substrat lamelleri kadar yerleştirin.
      4. UVO ile tedavi lamelleri çıkarın ve bir anda her kayma biri üzerine aşağı Mikroakışkan cihazlar özelliği tarafı yerleştirin (oryantasyon 1C Şekil benzer olmalıdır). Sıkıca cihazlarda Basın PDMS kaplı lamelleri sıkı bir mühür sağlamak.
    2. Genipin ve Fibronektin birikmesi
      1. Liyofilize genipin 5 mg kabın steril GKD 2 O, 1 ml ilave edilerek 5 mg / ml genipin çözeltisi hazırlayın. Bir vorteks mikser kullanılarak çözelti karıştırın. En az 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bir kenara.
        Not: toz, en azından bir dakika, oda sıcaklığında çok tekrarlanan karıştırma çözündürülmesi zordur çoğu zaman gereklidir.
      2. Hızlı, cihaz prime işlemi için her bir cihazın girişinde,% 70 etanol içinde bir damla yerleştirin. Not: ETHAnole cihazları ile fitil gerekir.
      3. 5 sonra - 10 dakika, dikkatli bir şekilde, hemen girişinde 1X fosfat tamponlu salin (PBS) ile değiştirilmesi, girişteki aşırı etanol aspire. Bu noktadan itibaren, giriş cihazına hava giriş önlemek için tamamen kuru olmasına izin değil emin olun.
      4. Her cihazın çıkışında bir vakum aspiratör ucu yerleştirin. Etanol uzak durulama cihazlar aracılığıyla 1X PBS çizin. Girişinde 1X PBS küçük bir miktar boş. Not: giriş neredeyse kuru görünüyorsa, daha 1X PBS ekleyin.
      5. Sadece küçük bir miktar genipin çözeltinin uygulanmasından önce girişinde kalır, böylece aşırı 1X PBS aspire.
      6. Her bir giriş (Şekil 1D), 5 mg / ml genipin çözeltisi 60 ul koyun. Prize (Şekil 1D) bir vakum aspiratör ucu yerleştirerek cihazlar aracılığıyla genipin çözüm çizin. Giriş çözeltinin küçük bir miktar bırakarak boyunca çözelti her çekmek için emin olun.
      7. Yer (yaklaşık on sent büyüklüğünde) 1X PBS girişi ve inkübasyon sırasında ıslatma korumak için çıkışında hem de düşer. 37 ° C'ye ayarlanmış bir nemlendirilmiş fırın veya inkübatör cihazları (steril bir ortam gerekli değildir) ihtiva eden çanak taşımak ve 4 saat süre ile inkübe edilir. Kap, kaplanmıştır gerek yoktur.
      8. İnkübasyon sırasında, önce mikro sıvısal tertibat uygulama için en az 30 dakika boyunca buz üzerinde steril GKD 2 O 50 ug / ml 'lik bir konsantrasyona kadar fibronektin yeniden süspanse edin.
      9. Genipin inkübasyonundan sonra, cihaz çıkışları kalan tüm 1X PBS aspire. Girişinde kalan 1X PBS üzerinden çekerek, her cihaz çıkışında bir vakum aspiratör uygulamak için devam edin.
      10. Giriş kalan 1X PBS içinde çok az miktarda (Şekil 1D) ekleyerek, her giriş 50 ug / ml fibronektin çözeltisi 100 ul koyun.
      11. (Çıkışında bir vakum aspiratör ucu kullanarak cihazlar aracılığıyla fibronektin çözüm çizin
      12. 37 ° C'ye ayarlanmış bir fırın ya da kuluçka cihazları ihtiva eden ortaya çanak getirin ve 24 saat daha inkübe edilir. Not: fibronektin adımı 1X PBS ile giriş ve çıkış ıslanmasını gerektirmez. girişinde fibronektin kalan havuz kurur. Bu beklenmektedir.
    3. Hücre Yayımlamak için Sterilizasyon ve Hazırlama
      1. Desenli vMTF lamelleri sterilizasyonu için penisilin / streptomisin bir çözüm hazırlayın. Steril 1X PBS 500 ml penisilin / streptomisin ve 5 ml (10.000 mg / ml 10,000 ünite / ml) ilave et.
      2. Steril bir biyogüvenlik kaput cihazları içeren çanak yerleştirin.
      3. Dikkatle hafifçe ters elinde lamel doyumsuz yavaşça, bir köşede cihazı soyulması ile lamelleri cihazları kaldırın.Not: Bu adım çıkarma işleminde lamel hasarı azaltmak için pratik gerektirir. Alternatif bir cihazı serbest yardım etmek için giriş ve / veya çıkışında 1X PBS enjekte etmek için bir şırınga kullanılarak edilir.
      4. Steril altı oyuklu tabaklarda lamelleri yerleştirin. Her bir oyuğa, penisilin / streptomisin çözeltisinin en az 5 ml ilave edilir. En az 30 dakika boyunca 37 ° C'de steril inkübatör yemekler yerleştirin.
      5. Sterilizasyon sonrasında, penisilin / streptomisin solüsyonu aspire ve kültürlenmiş insan umbilikal damar vasküler düz kas cells19 (Şekil 1D) ile lamelleri tohum. VSMC'Ierin için tohumlama konsantrasyonu ~ cm2 başına 80.000 hücreleri. Her bir örnek için gerekli olan hücrelerin sayısını azaltmak için, tohum alanı azaltmak için, bir redüktör kullanın. Bir redüktör bir örneği önce tohumlama steril vakum gres ile lamel bağlı bir 15 ml konik tüp kesme üst olduğunu.
      6. 37 ° C ve% 5 CO2 ile steril bir inkübatör tohumlanmış lamelleri inkübe (Şekil 2A-B).
    4. Uzun süreli vMTF Doku Kültürü
      1. Bir gün tohumlama sonra, hücre orta ve redüktör çıkarın. 1X PBS ile dokuları durulayın. VSMC'Ierin 20 bir kasılma fenotipi uyarmak için, serumsuz hücre ortamının 4 ml ekleyin.
      2. Uzun süreli kültürü için arzu edildiği gibi her gün 1X PBS durulama ve taze serumsuz ortam ilave tekrarlayın.

Şekil 1
1. Mikroakışkan Protein Teslim Cihazı Şekil. (A) PIPAAm kaplama lamel kapalı Taped. Kırmızı noktalı daire: lamel serbest yolunu kesme (B) Doku mikroakışkan maske desen Temsilcisi AutoCAD çizim.. Ankastre: İkili dallanma Detay ALTERN içingiriş ve çıkış bir lamel alt-tabaka üzerinde mikro sıvısal tertibat 10 mm x 10 mm doku örneği. (C), bir başlatma Sıralama gösterdi. mikroakışkan proteini desen ve teslimat (D) şematik. Soldan sağa: microfluidic kanalların taramalı elektron mikroskobu görüntüsü (ölçek çubuğu: 50 mikron); Protein birikimi yönteminin detaylı şematik; İmmünohistokimya lekeli fibronektin (ölçek çubuğu: 50 mikron); Vasküler düz kas hücreleri ile hücre tohumlama. Imal doku (E) şematik. 1. içerlek: katmanlı yapının Detay. 2. inset: mikroakışkan birikimi sonra PDMS substrat genipin modifikasyonu Detay. © GİB Yayıncılık. Çoğaltılabilir ve / veya izni ile değiştirilmiş. Tüm hakları saklıdır. 19 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

VMTF Kasılma Testi ile 3. Doku Fonksiyon Analizi

Not: Burada sunulan MTF kontraktilitesinin tahlil Grosberg ark geliştirilen teknikle sonra modellenmiştir 8.

  1. vMTF Kasılma Deneme
    1. 100 mm tabak içinde bir doku numunesi yerleştirin. PH 7.4'te steril 1X Tyrode solution8 ekleme örneği kapsayacak şekilde 37 ° C'ye kadar ısıtıldı.
    2. PIPAAm kenarına dik birçok paralel kesim yapmak için bir jilet kullanın. Ince şeritler (Şekil 3A, yan keser) ile dönüşümlü vMTFs (genişlik ~ 2 mm) olacak geniş doku bölümleri veren bir şekilde keser olun. Temiz kesim yapmak için, numune ile temas halinde bir jilet yerleştirin ve yan sürükleyin sıkıca.
    3. Çanak 90 ° döndürün ve doku ortasında iki düz, paralel kesim yapmak, PIPAAm şerit (Şekil 3A, uç kesimler) paralel. Çıkarın ve bu kesim arasındaki doku gevşek şerit eldens ve vMTFs arasındaki (önceki adımda kesme) ince şeritler temas bitişik filmler önlemek için.
    4. Numune, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında dinlenmeye bırakın veya tüm kadar PIPAAm çözününceye. Not: PIPAAm gelecek adımda kalırsa, numune kalan PIPAAm çözmek için kesim çanak iade edilebilir. Gerektiğinde vMTF alt tarafının bir yumuşak kazıma, PIPAAm uzaklaştırılmasında yardımcı olabilir.
    5. Temiz bir 35 mm Petri kabındaki vakum gres küçük bir nokta koyun. 37 ° C sıcaklıkta, taze, steril 1X Tyrode çözeltisi 5 ml. Lamel hareket etmesini önlemek için vakum yağ üzerine 100 mm 35 mm çanak çanak ve basından kesim filmleri ile lamel aktarın.
    6. Stereomikroskop aşamasında sıcaklık kontrollü bir platform çanak yerleştirin.
    7. Yakalama time-lapse iletilir ve istenilen aralıklarla floresan ışık görüntüleri (örn., 30 sn) tedavi deneyi boyunca.
    8. Seri olarak (20 dakika boyunca 50 nM endotelin-1 ile tedavi vMTFskaynaklı daralma) ve 30 dakika (doku dinlenmek için 100 uM HA-1077). 5 ml hacim içinde, istenen tedavi konsantrasyonu elde belirtilen zaman noktalarında steril 1X Tyrode çözeltisi 5 ml ihtiva eden deney kabına her işlemin konsantre çözümler ekleyin. Görüntülerde pipet yakalama önlemek için time-lapse görüntü satın almalar arasındaki aralığı boyunca tedavi eklemeler yapın.
  2. vMTF Kasılma Analizi
    1. 1.4.8 kenara koyun lamelleri kullanarak, bir profilometer21 PDMS substrat kalınlığını ölçmek. Lamelleri her set için sıkma zaman eğrisi kalınlığı oluşturun. Bir kontraktilite deneyde kullanılan her lamel için vMTF kalınlığını tahmin etmek için bu eğriyi kullanın.
    2. Deney boyunca her bir zaman noktası için vMTF projeksiyon uzunlukları ölçmek ve daha önce bildirilen yöntem kullanılarak 8 eğrilik yarıçaplarına bağlı (Şekil 3B) hesaplar.
    3. Her zaman po at vMTF stres hesaplayınönceki vMTF yöntemlerini kullanarak 5 int.
      Not: 3.2.1 hesaplanan tahmini vMTF kalınlığı kullanın. Daha önce 9 bildirdiği gibi, konfokal görüntüleri kullanarak VSMC kalınlığını ölçün. Şirket veri sayfaları PDMS Young modülüne edinin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu çalışmanın temel amacı, hidrofobik PDMS yüzeylerde micropatterned VSMC'lerin canlılığı uzatmak oldu. Bu desenli genipin ve PDMS ile fibronektin (Şekil 1) biriktirilmesi için bir mikro-akışkan dağıtım sistemi eklenerek gerçekleştirilmiştir. Mikroakışkan teslim kullanarak ECM proteinleri Biriktirme genipin ve fibronektin (Şekil 1D) satırları arasında çıplak PDMS kanal desen yüksek sadakat transferi vermiştir. Önceki microcontact baskı yöntemleri 5,10,16 benzer arter lamellerinin in vivo yapısını taklit eden yapışmış hücreler (Şekil 1E) formu konfluen mono tabakalar (Şekil 2). Bu dokular olan gerilme vMTF teknolojisi kullanılarak ölçülmüştür (Şekil 3) yanıt veren, kontraktil yapıları, elde edildi.

İki hafta boyunca doku canlılığı kalitatif değerlendirilmesi genipin-modifi minimal bozulma gösterdied yüzeyler (Şekil 2A). Doku izdiham ve hizalama iki hafta içinde (Şekil 2B, 2C ve 2D) içinde muhafaza edilmiştir. İki önemli gerilme değerleri her vMTF için hesaplanmıştır. 1) bazal ton ve 2) kaynaklı kontraktilite (Şekil 3C ve 3D) Bazal ton dengede uyarılmamış VSMC'Ierin tarafından yapılmaktadır strestir. İndüklenen kontraktilite endotelin-1 ile uyarma yoluyla endüklenen ilave strestir. Bazal sesi ve uyarılmış kontraktilite Hem (Şekil 3E ve 3F'de) boyunca vazoaktif dokuları gösteren, iki haftalık süre boyunca tutarlı davranış gösterdi. Serum hasret VSMC'Ier 19 çoğalırlar yok çünkü testin sonunda doku kontraktilite hafif düşüşü, doku oluşturan hücrelerin azalması sayısının doğrudan bir sonucudur. kültür ortamına serum minimal düzeyde bazal eklenmesi gelecekteki çalışmalarında bu sonucu azaltabilir.

Şekil 2. Dokular Başarıyla Genipin modifiye Yüzeyler İki Hafta için Mimik in vivo Arter Lameller Yapısı geçerli kalır ve iki hafta boyunca kurban zaman noktalarında dokuların (A) Temsilcisi faz kontrast görüntüler (ölçek çubuğu: 200 mikron).. f-aktin filamentler, mavi: çekirdek (hücrelerin varlığını ortaya koymak için gösterilen), ölçek çubuğu serum açlık (yeşil sonra (B) 1. Gün sabitlenmiştir genipin modifiye yüzeylerde fabrikasyon dokuların Temsilcisi immünohistokimya görüntüleri, Gün 4 ve 10. Gün .. - 7) (D) Doku uyumu f-aktin oryantasyon düzen parametresi (OOP ile ölçülen) 22 (hata çubukları standart hata, n = 3: f-aktin kapsama (hata çubukları ile ölçülen 100 mikron) (C) Yüzde izdiham : Standart hata, n = 3-7). © GİB Publishing. Çoğaltılabilir ve / veya izni ile değiştirilmiş. Her hakkı saklıdır. Tüm hakları saklıdır. 19 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Doku Kasılma İki hafta boyunca muhafaza edilir. (A) Temsilcisi vMTF kesme düzeni. (B) kesilmiş vMTF şematik. 32 ° C altına soğutulduktan sonra, PIPAAm çözülür, vMTF serbest bırakır. Aktif hücre tabakası Stres bükmek için pasif PDMS katmanı neden olur. Projeksiyon uzunluğu ölçümü Grosberg yöntemlere göre bir eğrilik yarıçapına dönüştürülebilir ve ark. Eğrilik yarıçapı 8 dokusunda ortalama kesit stres hesaplamak için kullanılır. (C) ardışık iletilen ligtemsili kontraktilite tahlilinin ht görüntüleri (Ölçek çubuğu: 1 mm). Dokular, dengeye ulaşması tam bir rahatlama sağlamak için, endotelin-1, daha sonra HA-1077 ile muamele ile stimüle edilir. Alt:. Kontraktilite tahlil için tahlil sırasında idealize dokusunun yan görünümü şematik (D) Temsilcisi stres eğrisi. İki önemli gerilme değerleri hesaplanır. Bazal ton denge stres devlet ve rahat stres devlet arasındaki farktır. İsteyerek kontraktilite endotelin-1 uyarılmış duruma denge durumundan stres değişikliği (E) Bazal tonu (hata çubukları: standart hata, n = 5-12) (F) Bağlı kontraktilite (hata çubukları.:. Standart hata, n = 5-12). © GİB Yayıncılık. Çoğaltılabilir ve / veya izni ile değiştirilmiş. Tüm hakları saklıdır. 19 büyük halini görmek için tıklayınızBu rakam.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, kronik damar hastalığı yolların 1,23,24 uzun deney kat daha tipik izin önce geliştirilen vMTF teknolojisi üzerine inşa bir protokol mevcut. Bunu gerçekleştirmek için, daha önce MTF kontraktilitesi deneylerinde kullanılmak üzere geliştirilmiş bir vasküler doku canlılığı ile mühendislik arter lameller üretmek üzere bir mikro-akışkan yerleştirme tekniği kullanılarak, PDMS alt tabakalar 11 uzun süreli işlevselleştirilmesini sağlamak için gösterilmiştir genipin, mikrodesenlerle. McCain ve diğ. İlgili bir MTF modeli 25 birkaç hafta için tasarlanmış kardiyak doku uzatılmış kültür için alternatif bir micromolded jelatin hidrojel alt-tabakanın geliştirilen.

Bu protokol başarılı iki hafta boyunca arteriyel lamel yapısı (Şekil 2) ve fonksiyon (Şekil 3) taklit vMTFs vermiştir. Sunulan protokol başarıyla tamamlanması istenen res verir ikenhastalık ilgili zaman ders için uzatılmış kültür kez ULT (örneğin, 14 güne kadar 26 için süren serebral vazospazm patolojik etkileri), birkaç ortak tuzaklar ortaya çıkar. Cihazın dalların tam veya kısmi tıkanmasına neden olabilir zararlı hasara PDMS mikroakışkan cihazlar sonuçların tekrar tekrar kullanılması. Bu durumda, yeni bir cihaz, her bir deney için kullanılmalıdır. Başka bir sorun, ortak değil ise, dokuların beklenmedik ve tutarsız delaminasyon olduğunu. Bu olaylar oluşum doğada rastgele ve nadir görünüyordu. Gözlem ile, dokular delaminating önce arch- veya lümen benzeri bir yapı oluşturur. Ayrıca microcontact baskı teknikleri kullanılarak imal dokularda bu davranış gözlendi. Böylece, bu konuda aşırı tohumlama veya fenotipik anormal davranış sonuçlanan kültürlü VSMC'lerde anahtarı ve burada sunulan imalat yöntemleri doğrudan bir sonucu ya sonucu olduğuna inanıyorum.

Mevcut mikroakışkanlarIC tasarım lineer akış modelleri gerektirir ve bu nedenle, tek bir ana yönünde uyum dokular ile sınırlıdır. Böyle ventrikül yapının 27 "tuğla duvar" desen olarak daha karmaşık desenlendirme gerektiren dokulara, Uygulama daha ayrıntılı mikroakışkan tasarım gerektirir. Diğer hücre tipleri ile genipin modifiye edilmiş substratlar tohumlanmıştır değil. Bununla birlikte, Genchi ve diğ. genipin modifiye PDMS 11 izotropik iskelet kasının canlılığını uzatıldı gösterdi. Böylece, bu protokolün minimal-değiştirilmiş versiyonu organı-on-a-chip teknolojilerinin gelecekteki gelişimi diğer organ sistemlerinde yaygın uygulanabilirliği vardır emin hissediyorum.

Yukarıdaki yöntemlerden 8 göre vMTFs stres hesaplama yöntemi ince filmlerin dokularda rölatif kontraktilite ve ilgili kesme uzunluğu ile sınırlıdır. Çok uzun keserseniz, filmler kendilerine curl olacaktır. Çok kısa keserseniz, filmler olmayacaknd. Her iki durumda sınırlamaları modellemek nedeniyle kasılma özelliklerinin doğru analiz engeller. Uygun kesme uzunluğu tekrarlanan deneyler aracılığıyla rafine edilmelidir. Agarwal ve ark gibi lazer oyma sisteminin uygulanması., Tekrarlanabilirlik ve MTF 28 kesim kalitesine artırabilir.

daha sıkı bir şekilde kontrol, kendi kendine yeten deneysel sistemde yerli doku yapısını ve fonksiyonunu özetlemek yeteneği biyomühendislik alanında önemli bir uğraşıdır. Bu peşinde temel fizyolojik ve organ sistemlerinin 29,30 patolojik davranışların anlaşılmasını ilerleyen birkaç in vitro doku taklit ve çok fonksiyonlu, henüz basitleştirilmiş modeli organlar-on-a-chip gelişmesine yol açmıştır. PDMS substratlar üzerine genipin birikmesini kullanarak, iki hafta boyunca uzatılmış hücre yaşayabilirliği ve vasküler düz kas fonksiyonunun bakım göstermiştir. Bu, daha önceki üretim techn üzerinde önemli bir gelişmedirKültür 19 7 gün ve daha güçlü bir damar-on-a-chip yöntemlerin geliştirilmesine yardımcı olabilir - doku ve 4 sonra hücre ölümü delaminasyona sebep olabilir iques. Nedeniyle çoğu vasküler hastalıkların kronik doğası gereği, bu avans özgü vasküler patolojiler yer alan kasılma mekanizmalarının gelecekteki araştırmaların çeşitli çerçeve sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip staining rack Electron Microscopy Sciences www.emsdiasum.com/ 72239-04
Microscope cover glass - 25 mm Fisher Scientific, Inc. www.fishersci.com 12-545-102
Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ #21458
1-butanol Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com 360465
Spincoater Specialty Coating Systems, Inc. www.scscoatings.com
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives (Dow Corning) www.ellsworth.com 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Fluorescent microbeads Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ 17151
Silicon wafers Wafer World, Inc. www.waferworld.com 2398
Photoresist  MicroChem Corp. www.microchem.com
Contact mask aligner Suss MicroTec www.suss.com
Developer MicroChem Corp. www.microchem.com
Tridecafluro-trichlorosilane UCT Specialties, Inc. www.unitedchem.com T2492
Surgical biopsy punch Integra LifeSciences Corp. www.miltex.com 33-31AA-P/25
Genipin Cayman Chemical www.caymanchem.com 10010622
1X phosphate buffered saline Mediatech, Inc. www.cellgro.com 21-031-CV
Fibronectin Corning, Inc. www.corning.com 356008
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com 15140-122
Umbillical artery smooth muscle cells Lonza www.lonza.com CC-2579
Tyrode's solution components Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com various
Stereomicroscope Zeiss www.zeiss.com 4350020000000000
Temperature-controlled platform Warner Instruments www.warneronline.com 641659; 640352; 641922
Endothelin-1 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com E7764-50UG
HA-1077 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com H139-10MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humphrey, J. D., Baek, S., Niklason, L. E. Biochemomechanics of cerebral vasospasm and its resolution: I. A new hypothesis and theoretical framework. Ann. Biomed. Eng. 35, 1485-1497 (2007).
  2. Hald, E. S., Alford, P. W. Smooth muscle phenotype switching in blast traumatic brain injury-induced cerebral vasospasm. Transl. Stroke Res. 5, 385-393 (2014).
  3. Olivetti, G., Anversa, P., Melissari, M., Loud, A. V. Morphometry of medial hypertrophy in the rat thoracic aorta. Lab. Invest. 42, 559-565 (1980).
  4. , Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
  5. Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
  6. Rhodin, J. A. G. Architecture of the vessel wall. Physiol. Rev. ed, B. erne,R. ., , American Physiology Society. (1979).
  7. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 19943-19948 (2011).
  8. Grosberg, A., Alford, P. W., McCain, M. L., Parker, K. K. Ensembles of engineered cardiac tissues for physiological and pharmacological study: heart on a chip. 11, 4165-4173 (2011).
  9. Alford, P. W., Nesmith, A. P., Seywerd, J. N., Grosberg, A., Parker, K. K. Vascular smooth muscle contractility depends on cell shape. Integr. Biol. (Camb). 3, 1063-1070 (2011).
  10. Win, Z., et al. Smooth muscle architecture within cell-dense vascular tissues influences functional contractility). Integr. Biol. (Camb). , (2014).
  11. Genchi, G. G., et al. Bio/non-bio interfaces: a straightforward method for obtaining long term PDMS/muscle cell biohybrid constructs). Colloid Surface B. 105, 144-151 (2013).
  12. Fessel, G., Cadby, J., Wunderli, S., van Weeren, R., Snedeker, J. G. Dose- and time-dependent effects of genipin crosslinking on cell viability and tissue mechanics - Toward clinical application for tendon repair. Acta Biomater. , (2013).
  13. Lima, E. G., et al. Genipin enhances the mechanical properties of tissue-engineered cartilage and protects against inflammatory degradation when used as a medium supplement. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 692-700 (2009).
  14. Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. J. Biomed. Mater. Res. A. , (2011).
  15. Satyam, A., Subramanian, G. S., Raghunath, M., Pandit, A., Zeugolis, D. I. In vitro evaluation of Ficoll-enriched and genipin-stabilised collagen scaffolds. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2012).
  16. Alford, P. W., et al. Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 12705-12710 (2011).
  17. Song, H., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. A microfluidic system for controlling reaction networks in time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, 768-772 (2003).
  18. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  19. Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. Long-term vascular contractility assay using genipin-modified muscular thin films. Biofabrication. 6, 045005 (2014).
  20. Han, M., Wen, J. K., Zheng, B., Cheng, Y., Zhang, C. Serum deprivation results in redifferentiation of human umbilical vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C50-C58 (2006).
  21. Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
  22. Volfson, D., Cookson, S., Hasty, J., Tsimring, L. S. Biomechanical ordering of dense cell populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15346-15351 (2008).
  23. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis. Hypertension. 38, 581-587 (2001).
  24. Kayembe, K. N., Sasahara, M., Hazama, F. Cerebral aneurysms and variations in the circle of Willis. Stroke. 15, 846-850 (1984).
  25. McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
  26. Weir, B., Grace, M., Hansen, J., Rothberg, C. Time course of vasospasm in man. 48, 173-178 (1978).
  27. McCain, M. L., Sheehy, S. P., Grosberg, A., Goss, J. A., Parker, K. K. Recapitulating maladaptive, multiscale remodeling of failing myocardium on a chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9770-9775 (2013).
  28. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).
  29. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).
  30. Meer, A. D., van den Berg, A. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse. Integr. Biol. (Camb). 4, 461-470 (2012).

Tags

Bioengineering Sayı 100 alt-tabaka bir değişiklik mikroflüidik protein birikimi vasküler düz kas hücreleri hücre canlılığı polidimetilsiloksan genipin arter doku mühendisliği mekanik özellikler,
Micropatterned Vasküler Musküler İnce Filmlerin Genişletilmiş Kültür mikroakışkan Genipin Biriktirme Tekniği
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, … More

Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films. J. Vis. Exp. (100), e52971, doi:10.3791/52971 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter