Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

טכניקת microfluidic Genipin הפקדת לתרבות מורחבת של כלי דם micropatterned השרירים Thin Films

Published: June 26, 2015 doi: 10.3791/52971
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota

Introduction

מחלות כלי דם, כגון vasospasm המוחית 1,2, יתר לחץ דם 3, וטרשת עורקת 4, לפתח לאט, הן בדרך כלל כרוניים בטבע, וכרוכים בכוח-דור מתפקד על ידי תאי שריר חלק של כלי דם (VSMCs). אנו שואפים ללמוד בתפקוד אלה איטיים מתקדמים של כלי הדם באמצעות בשיטות מבחנה עם שליטה עדינה יותר של תנאי ניסוי מאשר בin vivo מודלים. סרטים שפותחנו בעבר בכלי דם שרירי דק (vMTFs) למדידת התכווצות פונקציונלית של רקמות מהונדסות במבחנה לב וכלי דם 5, אך שיטה זו הוגבלה למחקרים יחסית לטווח קצר. כאן, אנו מציגים טכניקת שינוי מצע שמתרחבת טכניקת vMTF הקודמת שלנו למדידות לטווח ארוך.

בעוד האנדותל הוא גם קריטי בתפקוד כלי דם כללי, lamellae עורקים מהונדסים לספק מערכת מודל שימושית להערכת שינויים בכלי דםהתכווצות במהלך התקדמות מחלה. להנדס מודל פונקציונלי של כלי דם ברקמת מחלה, גם את המבנה ותפקוד של lamella העורקים, יחידת ההתכווצות הבסיסית של כלי השיט, יש סכמה עם איכות גבוהה. lamellae עורקים הם גיליונות קונצנטריים, circumferentially מיושר של VSMCs ההתכווצות מופרדת על ידי גיליונות של אלסטין 6. הדפסת microcontact של חלבוני מטריצה ​​תאית (ECM) על גבי מצעי polydimethylsiloxane (PDMS) כבר השתמשה בעבר כדי לספק רמזי הדרכה לארגון רקמה לחקות מיושרים רקמת לב וכלי דם 5,7-10. עם זאת, רקמות דוגמת באמצעות הדפסת microcontact יכול לאבד יושרה לאחר 3-4 ימים בתרבות, הגבלת תחולתם בלימודים כרוניים. פרוטוקול זה מספק פתרון לבעיה זו על ידי החלפת טכניקות הדפסת microcontact קודמות עם טכניקה בתצהיר microfluidic חדשה.

Genchi et al. מצעי PDMS שונה עם genipin וFound ממושך כדאיות של myocytes עד חודש בתרבות 11. כאן, אנו משתמשים בגישה דומה להארכת תרבות של תאי שריר בדוגמת כלי דם חלקים על PDMS. Genipin, נגזר hydrolytic טבעית של הפירות גרדניה, הוא מועמד רצוי לשינוי מצע בשל רעילותה הנמוכה יחסית בהשוואה לסוכני crosslinking דומים והשימוש הגובר שלה כביולוגי בתחומי תיקון רקמות 12,13 ושינוי ECM 14, 15. בפרוטוקול זה, פיברונקטין הוא מנוצל כרמז הדרכת תא, כמו בשיטות הדפסת microcontact קודמות; עם זאת, genipin מופקד על גבי מצעים לפני דפוסי פיברונקטין PDMS. לפיכך, כתאים לבזות את המטריצה ​​בדוגמת, ECM מסונתז חדש מVSMCs המצורף יכול להיקשר למצע PDMS המצופה genipin.

פרוטוקול זה משתמש בהתקן משלוח microfluidic לgenipin שני שלבים ותצהיר ECM. העיצוב של microco מחקה מכשיר microfluidicדפוסי הדפסת ntact משמשים לlamellae עורקים מהונדסים במחקרים קודמים 16. לפיכך, אנו מצפים פרוטוקול זה להניב מחקה lamellae עורקים שבהצלחה לשחזר מזדהים ביותר במבנה ותפקוד vivo התכווצות של lamellae עורקים. אנו גם מעריכים התכווצות רקמות כדי לאשר genipin שהיא תרכובת שינוי המצע מתאימה לטווח ארוך בדגמי מחלת כלי דם במבחנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: המטרה של פרוטוקול זה היא לבנות ולנצל סרט של כלי דם שרירי דק (vMTF) עם המבנה מוצג באיור 1 להעריך התכווצות במהלך התרבות המורחבת של תאי שריר חלק של כלי דם (VSMCs) על מצעי PDMS. כדי להאריך את כדאיות VSMC, אנו מנצלים את genipin מתחם crosslinker. מצעים לvMTFs אלה נועדו לנתח התכווצות רקמות כפי שפותח על ידי Grosberg et al. 8 שיטות אחרות vMTF גם 5 עשויים לשמש, עם שינויים קלים בפרוטוקול ייצור מצע שהוצג.

ייצור 1. תשתית

  1. ניקוי coverslip
    1. הנח coverslips זכוכית קוטר 25 מ"מ למדף צביעת coverslip. הנח את המדף לתוך כוס או מיכל גדול (למשל, ריק 100 -. מיכל 1,000 pipet μl קצה).
    2. להוסיף 70% אתנול למכל לטבול באופן מלא את coverslips. Sonicate לפחות 30 דקות. </ Li>
    3. הסר את מדף coverslip מפתרון אתנול. לאפשר coverslips לייבוש באוויר בתליית המדף בברדס תרבות סטרילי (כדי למנוע הצטברות חלקיקים על coverslips) ל1- 2 שעות.
      הערה: coverslips חייב להיות יבש לחלוטין לפני השלבים הבאים.
  2. פולי (N-ISO-propylacrylamide) בידוד (PIPAAm) הרצועה על Coverslip
    1. שימוש בנייר דבק, קלטת מהצדדים של coverslip ניקה, והשאיר רצועה נחשפה במרכז על coverslip (איור 1 א). לשנות את רוחב רצועה חשוף זה מבוסס על יישום ו / או עיצוב microfluidic.
    2. סמן את הקצוות של רצועות קלטת על coverslip באמצעות סמן מעבדה לעיון מאוחר יותר (איור 1 א).
    3. חותך סביב ההיקף של coverslip לשחרר מהצלחת (איור 1 א, קו אדום מקווקו).
  3. פולי (N-ISO-propylacrylamide) לציפוי (PIPAAm)
    1. באמצעות איזון אנליטיים, שוקל 1 גרם של PIאבקת PAAm. אל תשתמש בN-ISO-propylacrylamide unpolymerized, שהוא מסרטן.
    2. העבר את PIPAAm לצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר. להוסיף 10 מיליליטר של 1-butanol בתוך ברדס כימי להניב 10% w / v פתרון. זהירות: נקודת 1-butanol הבזק היא 37 מעלות צלסיוס אחסן את הפתרון שהתקבל בקבינט דליק ולהימנע מחימום.
    3. לאפשר PIPAAm לפזר במשך 10 דקות. אם האבקה עדיין גלויה, לערבב את הפתרון בעזרת מערבולת-מיקסר עד שכל האבקה נמס.
      הערה: השלבים הבאים דורשים שימוש בcoater ספין. לכל coverslip:
    4. מניחים את coverslip הדביק על צ'אק coater הספין עם מלקחיים.
    5. העבר את 150 μl של פתרון PIPAAm על coverslip על ידי הצבת טיפות לאורך הזכוכית החשופה במרכז coverslip. להבטיח כיסוי של השטח נחשף מלא.
    6. מעיל ספין PIPAAm באמצעות המתכון הבא:
      1. רמפה 10 שניות ל -3,000 סל"ד. להתעכב במשך 5 שניות.
      2. רמפה 10 שניות ל6,000 סל"ד. להתעכב במשך 60 שניות.
      3. רמפה 10 שניות ל -3,000 סל"ד. להתעכב במשך 5 שניות.
    7. מניחים את coverslip לתוך צלחת פטרי מכוסה PIPAAm פונה כלפי מעלה. לאפשר לאוויר יבש לפחות 15 דקות.
    8. מוציא בזהירות את נייר דבק מכל coverslips, עוזב את coverslip המלא נחשף בשכבה דקה של ציפוי PIPAAm ברצועת מרכז.
  4. PDMS ציפוי
    1. לערבב ודגת 15 גרם של PDMS ב- 10: יחס crosslinker: הבסיס 1. להוסיף 7-8 טיפות של 0.2 מיקרומטר microbeads פלורסנט sonicated לפני הערבוב. מכסה את הכוס של PDMS עם רדיד אלומיניום כאשר אינו בשימוש כדי למנוע אבק וחלקיקים אחרים מזיהום PDMS.
      הערה: השלבים הבאים דורשים שימוש בcoater ספין. לכל coverslip:
    2. מניחים coverslip מצופה PIPAAm על צ'אק coater הספין עם מלקחיים.
    3. העבר את PDMS על coverslip, מכסה לפחות שליש משטח coverslip.
    4. מעיל ספין באמצעות RECIP הבאדואר:
      1. רמפה 5 שניות ל -500 סל"ד. להתעכב 5 שניות.
      2. רמפה 5 שניות ל1,000 סל"ד. להתעכב 5 שניות.
      3. רמפה 10 שניות ל -3,000 סל"ד. תשכון 10 שניות.
      4. רמפה 10 שניות ל4,000 סל"ד. תשכון 60 שניות.
      5. רמפה 10 שניות ל2,000 סל"ד. תשכון 15 שניות.
      6. רמפה 10 שניות ל1,000 סל"ד. תשכון 10 שניות.
      7. רמפה 5 שניות ל -500 סל"ד. להתעכב 5 שניות.
    5. מניחים את coverslip לתוך צלחת פטרי מכוסה PDMS פונה כלפי מעלה. רשום את הזמן שבו היה coverslip ספין-מצופה. לעקוב אחר הזמן משויך לכל coverslip לאורך הניסוי לשימוש מאוחר יותר בקביעת עובי מצע PDMS.
    6. מניחים את צלחת פטרי המכילה את coverslips בתנור C ° 90 לפחות 1.5 שעות כדי להבטיח ריפוי PDMS נכון. אם תנור אינו זמין, בוא coverslips לרפא לפחות 48 שעות בRT.
    7. הסר את coverslips מהתנור ולאחסן אותם במגירה חשוכה עד מוכן לשימוש.
    8. מניח בצד כל רביעי ו coverslipאו מדידה עוקבת של עובי מצע, כפונקציה של זמן ציפוי ספין, עם profilometer.

2. דפוסים Microfluidic לרקמות הנדסה

  1. ייצור של המכשירים microfluidic
    1. עיצוב של Photomask Microfluidic רקמות
      1. השתמש בכל תכנית תכנון בעזרת מחשב מתאים לעצב דפוסי microfluidic. לlamellae עורקים מורכבים מתאים אנושי עורק טבורי כלי דם שריר חלק, השתמש דפוס לסירוגין של 10 מיקרומטר ערוצים עם 10 מיקרומטר קירות.
      2. השתמש ערוץ בינארי הסתעפות אם 17 אפשריים, אך ניתן להשתמש בי עיצובי הסתעפות אחרים. להקטין את הרוחב ואורך של ערוצים לכל איטרציה הסתעפות עד להשגת דפוס הרקמה הרצויה מרווח (קירות וערוצים, איור 1).
      3. לעצב את המכשיר יש כניסה אחת להשמת פתרון טיפול פני השטח ושקע בודד ליישום של ואקום.
      4. Fabricate photomask מכיל עיצוב microfluidic (ים), כפי שתואר בעבר 18.
    2. ייצור photolithographic ופל
      הערה: בצע photolithography בחדר נקי מתאים או מתקן דומה. כדי להפוך פרוסות סיליקון עם דפוסים לייצור ליתוגרפי רך של מכשירי רקמת microfluidic (~ 20 - 25 גובה ערוץ מיקרומטר) photolithography באמצעות:
      1. נקה פרוסות סיליקון באצטון, מתנול, ואלכוהול איזופרופיל דקות 1 כל אחד. ייבש את הרקיק עם אקדח חנקן.
      2. Prebake הרקיק על פלטה חשמלית במשך 5 דקות ב 115 מעלות צלזיוס כדי להסיר לחות עודפת.
      3. מעיל ספין הרקיק עם photoresist SU-8 3025 באמצעות המתכון הבא להניב כולל 20 - 25 מיקרומטר בגובה:
        1. רמפה 5 שניות ל -500 סל"ד. להתעכב 5 שניות.
        2. רמפה 15 שניות ל4,000 סל"ד. תשכון 15 שניות.
      4. לאפות רך הרקיק על פלטה חשמלית על 95 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
      5. לטעון photomask, ולחשוף tהוא ופל במשך 16 שניות באמצעות תכנית קשר ואקום על aligner מסכת קשר.
      6. קשה לאפות את הרקיק על פלטה חשמלית על 95 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
      7. לפתח את הרקיק במשך 6 דקות במפתח. לאחר מכן, לשטוף את הרקיק פעמיים עבור 2 שניות במפתח טרי ולשטוף את הרקיק עם אלכוהול איזופרופיל.
      8. Silanate O / N רקיק בדוגמת ידי הצבת 2 - 3 טיפות של tridecafluoro-trichlorosilane בצלחת ריקה בתוך ייבוש ואקום. לחזק את הרקיק באמצעות צלחות פטרי, כך ששניהם התחתון והעליון של פרוסות סיליקון נחשפים.
        זהירות: Tridecafluro-trichlorosilane הוא נוזל דליק ומאכל. ציוד מגן אישי מתאים ופליטה מקומית הוא הכרחי לשימוש.
    3. ייצור המכשיר microfluidic רקמה
      1. הנח silanated, תכונה בצד רקיק בדוגמת בצלחת פטרי.
      2. לערבב ודגה של PDMS 100 גרם עם 10: יחס crosslinker: הבסיס 1. יוצקים את PDMS לתוך הצלחת, לחלוטין ובאופן שווה מכסה את הרקיק.
      3. מניחים את הצלחת בייבוש ואקום עד שכל בועות האוויר יוסרו מן PDMS דפוקה, כ 30 דקות. לרפא את PDMS בצלחת על 90 מעלות צלזיוס לפחות 1.5 שעות. זמן וטמפרטורה יכולים להיות מותאמת כפי שהוכתבו על ידי הנחיות ייצור כדי להשיג ריפוי מלא.
      4. ברגע PDMS ריפא, לחתוך את PDMS סביב הרקיק בסכין גילוח ולשחרר את הרקיק מכוסה PDMS מהצלחת בזהירות. הסר PDMS העודף מתחת רקיק ולאט לקלף PDMS מרחק מהחלק העליון של פרוסות סיליקון.
      5. מניחים את התכונה בצד PDMS דיסק בצלחת נקייה ולאחסן את הרקיק מאור לאחר שימוש.
      6. לחתוך את PDMS העודף מרחבי הדפוסים באמצעות סכין גילוח. מכשירים חתוכים לצורות מלבניות (איור 1 ג) כדי להקל על קילוף של מכשיר ממצעים בצעדים מאוחר יותר. קיצוצים מדויקים אינם הכרחיים, כל עוד שטח נרחב קיים לכניסה, יציאה, ואזור דפוס רקמה (איור 1 ג).
      7. אגרוףחורי כניסה ויציאה (איור 1 ג) באמצעות אגרוף ביופסיה כירורגית 1 מ"מ.
  2. הפקדת מכשיר microfluidic
    הערה: בפרוטוקול זה, מסירת microfluidic משמשת להפקיד genipin בדוגמת, סוכן crosslinking מפתח עבור culturing רקמות לטווח ארוך, כמו גם פיברונקטין. צעדים לפני עיקור פניצילין / סטרפטומיצין (2.2.3) לא צריכים להתקיים בתנאים סטריליים, אבל אוסף זיהום ואבק הגבלה מעודד לאורך כל הפרוטוקול. כל הצעדים שהתרחשו לאחר עיקור coverslip עם פניצילין / סטרפטומיצין (2.2.3) צריכים לנצל את הטכניקה סטרילית. הערה: חלק זה של הפרוטוקול יש להתחיל יום אחד לפני זריעת תאים.
    1. הכנת מצע וMicrofluidic התקן
      1. Sonicate מכשירי microfluidic באתנול 70% לפחות 30 דקות.
      2. ייבש את מכשירי microfluidic sonicated באמצעות אוויר או חנקן דחוס, ומניח אותם בצלחת פטרי wiערוץ ה כולל כלפי מעלה כדי למנוע בלאי מיותר על התכונות.
      3. הנח עד 10 coverslips מצע vMTF בשואב UVO (כיסוי הוסר על צלחת כך את פני השטח הוא פונקציונליות) במשך 8 דקות.
      4. הסר את coverslips טופל UVO, ולמקם את התכונה בצד מכשירי microfluidic למטה על כל תלוש אחד בכל פעם (נטייה צריכה להיות דומה לתרשים 1C). לחץ כלפי מטה בחוזקה על המכשירים כדי להבטיח חותם חזק לcoverslips מצופה PDMS.
    2. בתצהיר של Genipin ופיברונקטין
      1. הכן פתרון genipin 5 מ"ג / מיליליטר על ידי הוספת 1 ​​מיליליטר של DDH סטרילי 2 O למכל 5 מ"ג של genipin lyophilized. מערבבים את הפתרון בעזרת מערבולת-מיקסר. מניח בצד בRT לפחות 30 דקות.
        הערה: האבקה קשה solubilize ב RT, ערבוב כל כך חוזר על עצמו לפחות דקה לעתים קרובות יש צורך.
      2. במהירות, במקום ירידה של 70% אתנול בכניסה של כל התקן להתקן תחול. הערה: ETHanol צריך פתיל באמצעות המכשירים.
      3. אחרי 5 - 10 דקות, בזהירות לשאוב אתנול העודף בכניסה, והחלפתו באופן מיידי עם מי מלח 1X פוספט (PBS) בכניסה. מכאן ולהבא, להיות בטוח שלא לאפשר כניסה ללהיות יבשה לחלוטין, כדי למנוע כניסה של אוויר למכשיר.
      4. הנח קצה aspirator ואקום ביציאה של כל מכשיר. לצייר 1X PBS באמצעות מכשירים לשטוף אתנול משם. להשאיר כמות קטנה של 1X PBS בכניסה. הערה: אם הכניסה מופיעה כמעט יבשה, להוסיף עוד 1X PBS.
      5. לשאוב עודף 1X PBS, כך שרק כמות קטנה נשארה בכניסה לפני היישום של פתרון genipin.
      6. מניחים 60 μl של 5 מ"ג פתרון genipin מיליליטר / בכל כניסה (1D איור). צייר את פתרון genipin באמצעות המכשירים על ידי הצבת קצה aspirator ואקום ביציאה (1D איור). הקפד שלא למשוך את כל הפתרון דרך, משאיר כמות קטנה של פתרון בכניסה.
      7. מקום טיפות (כ אגורה בגודל) של 1X PBS בשתי הכניסה והיציאה כדי לשמור על ההרטבה במהלך דגירה. הזז את הצלחת המכילה מכשירים לתנור או חממת humidified (סביבת סטרילית אין צורך) נקבעו ל -37 מעלות צלזיוס, ודגירה של 4 שעות. המנה לא צריכה להיות מכוסה.
      8. במהלך דגירה, resuspend פיברונקטין לריכוז של 50 מיקרוגרם / מיליליטר בסטרילי DDH 2 O על קרח במשך לפחות 30 דקות לפני היישום למכשיר microfluidic.
      9. לאחר הדגירה של genipin, לשאוב את כל 1X PBS שנותר בשקעי המכשיר. תמשיך לחול aspirator ואקום בכל שקע מכשיר, מושך באמצעות 1X PBS שנותר בכניסה.
      10. מקום 50 מיקרוגרם / מיליליטר פתרון פיברונקטין 100 μl בכל כניסה, הוספה לכמות מינימאלית של 1X PBS שנותר בכניסה (1D איור).
      11. צייר את פתרון פיברונקטין באמצעות המכשירים באמצעות קצה aspirator ואקום ביציאה (
      12. הזז את הצלחת נחשפה המכילה מכשירים לתנור או חממה מוגדרת 37 ° C, ודגירה של 24 שעות. הערה: צעד פיברונקטין אינו דורש הרטבה של הכניסה ויציאה עם 1X PBS. הבריכה הנותרת של פיברונקטין בכניסה תתייבש. זה צפוי.
    3. עיקור והכנה לזריעת תאים
      1. הכן פתרון של פניצילין / סטרפטומיצין לעיקור של coverslips vMTF בדוגמת. הוסף 5 מיליליטר של פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 יחידות / מיליליטר; 10,000 מיקרוגרם / מיליליטר) ל -500 מיליליטר של סטרילית 1X PBS.
      2. מניחים את הצלחת המכילה את המכשירים במכסת מנוע בטיחות ביולוגית סטרילי.
      3. מוציא בזהירות את המכשירים מcoverslips על ידי קילוף לאט את המכשיר בפינה, בעוד אחיזת coverslip ביד נגדית באורח קל.הערה: צעד זה דורש תרגול כדי להפחית את נזק coverslip בתהליך ההסרה. אלטרנטיבה היא באמצעות מזרק כדי להזריק 1X PBS בכניסה ו / או יציאה כדי לסייע בשחרור מכשיר.
      4. מניחים את coverslips במנות שש היטב סטרילי. להוסיף לפחות 5 מיליליטר של תמיסת פניצילין / סטרפטומיצין היטב כל אחד. מניחים את הכלים בחממה סטרילית על 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות.
      5. לאחר עיקור, לשאוב את פתרון פניצילין / סטרפטומיצין, וזרע coverslips עם השרירים cells19 התרבותי אנושי עורק טבור כלי הדם חלק (1D איור). ריכוז הזריעה לVSMCs הוא ~ 80,000 תאים לכל 2 סנטימטר. כדי להפחית את מספר התאים הדרושים לכל דגימה, להשתמש מפחית כדי להקטין את שטח הזריעה. דוגמא אחת היא כמפחית העליון החתך של צינור חרוטי 15 מיליליטר מצורף coverslip עם גריז ואקום סטרילי לפני הזריעה.
      6. דגירה coverslips זרע בחממה סטרילית על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (איור 2 א-ב).
    4. תרבות רקמות vMTF לטווח ארוך
      1. יום אחד לאחר הזריעה, להסיר את המדיום הסלולרי מוריד. יש לשטוף את הרקמות עם 1X PBS. הוסף 4 מיליליטר של מדיום סלולארי סרום ללא לגרום לפנוטיפ התכווצות בVSMCs 20.
      2. חזור על שטיפת 1X PBS ותוספת של מדיום סרום ללא טרי בכל יום אחר כרצוי לתרבות לטווח ארוך.

איור 1
איור 1. התקן משלוח חלבון microfluidic. () קלטת מcoverslip לציפוי PIPAAm. העיגול אדום מנוקד: חיתוך דרך לשחרר coverslip (ב) ציור הנציג AutoCAD של דפוס מסכת microfluidic רקמה.. הבלעה: פרט של הסתעפות בינארי לalternating 10 מיקרומטר x 10 מיקרומטר דפוס רקמה. (ג) מיקום של מכשיר microfluidic על מצע coverslip עם כניסה ויציאה שצוין. (ד) סכמטי של דפוסי חלבון microfluidic ומשלוח. תמונת מיקרוסקופ אלקטרונים הסורק של ערוצי microfluidic (סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר) משמאל לימין; סכמטי מפורט של שיטה לתצהיר חלבון; פיברונקטין אימונוהיסטוכימיה המוכתם (סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר); תא זריעה עם תאי שריר חלק בכלי דם. סכמטי (ה) של רקמה מפוברקת. 1 הבלעה st: פירוט של מבנה שכבתי. 2 nd הבלעה: פירוט של שינוי genipin של מצע PDMS לאחר תצהיר microfluidic. © IOP הוצאה לאור. לשכפל ו / או שונה ברשות. כל הזכויות שמורות. 19 אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ניתוח פונקציה 3. רקמות עם vMTF ההתכווצות Assay

הערה: assay התכווצות MTF שהוצג כאן הוא מודל לאחר הטכניקה שפותחה בet al Grosberg 8.

  1. ניסוי vMTF התכווצות
    1. מניחים דגימת רקמה בצלחת 100 מ"מ. להוסיף solution8 של סטרילי 1X Tyrode ב- pH 7.4 חימם עד 37 מעלות צלזיוס כדי לכסות את המדגם.
    2. השתמש בסכין גילוח לעשות כמה חתכים מקבילים בניצב לקצה PIPAAm. לבצע חתכים באופן שמניב סעיפי רקמות רחבים יותר שיהיה vMTFs (עם רוחב ~ 2 מ"מ) לסירוגין עם רצועות דקות (איור 3 א, קיצוצים בצד). לבצע קיצוצים נקיים, מקום סכין גילוח במגע עם המדגם ותקיפות לגרור לצד.
    3. סובב את הצלחת 90 ° ולעשות שני חתכים ישרים, מקבילים באמצע הרקמה, במקביל לרצועת PIPAAm (איור 3 א, קיצוצי הסוף). הסר ולהיפטר מהרצועה הרופפת של רקמה בין הקיצוץ אלהים והרצועות דקות בין vMTFs (חתך בשלב הקודם) כדי למנוע מסרטים סמוכים יצירת קשר.
    4. לאפשר המדגם לנוח על RT במשך 10 דקות, או עד שכל PIPAAm נמס. הערה: אם PIPAAm נשאר בצעדים עתידיים, מדגם ניתן להחזיר לצלחת החיתוך לפזר PIPAAm שייר. גירוד עדין של החלק התחתון של vMTF יכול לסייע בהסרת PIPAAm, בהתאם לצורך.
    5. הנח נקודה קטנה של שומן ואקום בצלחת פטרי 35 מ"מ נקייה. הוסף 5 מיליליטר של התמיסה של טרי, 1X Tyrode סטרילי על 37 מעלות צלזיוס. העבר את coverslip עם סרטים לחתוך מצלחת 100 מ"מ לצלחת 35 מ"מ, ולחץ על גריז ואקום כדי למנוע תנועה של coverslip.
    6. מניחים את הצלחת בפלטפורמת טמפרטורה מבוקרת על הבמה סטראו.
    7. זמן לשגות לכידה משודרת ותמונות אור ניאון במרווחים רצויים (למשל., 30 שניות) לאורך assay טיפול.
    8. סדרתי לטפל vMTFs 50 ננומטר אנדותלין -1 בבמשך 20 דקות (התכווצות מושרה) ו 100 מיקרומטר HA-1077 למשך 30 דקות (הרפיה רקמות). להוסיף פתרונות מרוכזים של כל טיפול לצלחת הניסוי המכילה 5 מיליליטר של הפתרון של סטרילי 1X Tyrode בנקודות זמן שצוינו, מניב ריכוז הטיפול הרצוי בנפח 5 מיליליטר. הפוך תוספות טיפול במרווח בין רכישות הזמן לשגות תמונה כדי למנוע לכידת פיפטה בתמונות.
  2. vMTF התכווצות ניתוח
    1. שימוש coverslips להפריש ב1.4.8, למדוד את עובי מצע PDMS עם profilometer21. צור עובי לעומת עקומת זמן ספין עבור כל קבוצה של coverslips. השתמש עקום זה להעריך את עובי vMTF לכל coverslip משמש בניסוי התכווצות.
    2. מדוד את אורכי הקרנת vMTF עבור כל נקודת זמן במהלך הניסוי, ולחשב את רדיוס עקמומיות קשור (איור 3) תוך שימוש בשיטות שדווחו בעבר 8.
    3. חישוב מתח vMTF בכל PO זמןint באמצעות שיטות vMTF קודמות 5.
      הערה: השתמש בעובי vMTF המוערך מחושב מ3.2.1. למדוד את עובי VSMC באמצעות תמונות confocal, כפי שדווח בעבר 9. להשיג מודולוס של PDMS הצעיר מגיליונות נתוני חברה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המטרה העיקרית של עבודה זו הייתה להאריך את הכדאיות של VSMCs micropatterned על מצעי PDMS הידרופובי. הדבר זה הושג על ידי שילוב מערכת מסירת microfluidic להפקיד genipin בדוגמת ופיברונקטין על PDMS (איור 1). בתצהיר של חלבוני ECM באמצעות משלוח microfluidic הניב העברת נאמנות גבוהה של דפוס הערוץ עם PDMS החשוף בין השורות של genipin ופיברונקטין (1D איור). התאים המצורפים (איור 1E) monolayers מחוברות צורה מחקה את מבנה vivo של lamellae עורקים (איור 2), דומה לשיטות הדפסת microcontact הקודם 5,10,16. רקמות אלה הניבו מבנים מגיבים, התכווצות, מתח שנמדד באמצעות טכנולוגיית vMTF (איור 3).

הערכה איכותית של כדאיות רקמות במהלך שבועיים הראתה הידרדרות מינימאלית על genipin-modifiמצעי ED (איור 2 א). מפגש רקמה ויישור נשמרו יותר משבועות (איור 2, 2C ו2D). שני ערכי לחץ מפתח חושבו עבור כל vMTF:. 1) טון בסיסי ו -2) התכווצות מושרה (איור 3 ג ו3D) טון בסל הוא מתח מתוחזק על ידי VSMCs unstimulated בשיווי המשקל. התכווצות מושרה היא לחץ נוסף הנגרם על ידי גירוי עם אנדותלין -1. שני טון בסיסי והתכווצות נגרמת הראו התנהגות עקבית במהלך הזמן של שבועיים, מדגימים רקמות vasoactive לאורך (איור 3E ו3F). הירידה הקלה בהתכווצות רקמות בסוף assay היא התוצאה הישירה של המספר המופחת של תאים המרכיבים את הרקמות, מאז VSMCs רעב סרום לא להתרבות 19. התוספת של רמה בסיסית מינימאלית של סרום לתרבות בינונית עשויה להקל את התוצאה הזאת בעבודה בעתיד.

רקמות 2. איור להישאר קיימא והצלחה במבנה לחקות vivo עורקי טבלית במשך שבועיים על מצעים שונה-Genipin () נציג תמונות בניגוד שלב של רקמות בנקודות זמן הקרבה במהלך הקורס של שבועיים (סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר).. (ב) תמונות אימונוהיסטוכימיה נציג של רקמות מפוברקות על מצעים-שונה genipin הקבוע ביום 1, יום 4, ויום 10 לאחר רעב הסרום (ירוק: F- אקטין חוטים, כחולים: גרעינים (מוצג להקים נוכחות של תאים), סרגל קנה מידה .: 100 מיקרומטר) (מפגש אחוז C) נמדד על ידי כיסוי F- אקטין (ברים שגיאה: שגיאה סטנדרטית, n = 3-7) 22 (ברים שגיאת יישור רקמות שנמדדו על ידי פרמטר כדי הנטייה F- אקטין (OOP) (ד). : שגיאה סטנדרטית, n = 3-7). © IOP Publishing. לשכפל ו / או שונה ברשות. כל הזכויות שמורות. כל הזכויות שמורות. 19 אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
התכווצות 3. רקמות איור נשמר במהלך שבועיים. (א) תכנית הנציג vMTF חיתוך. (ב) סכמטי של חתך vMTF. בקירור מתחת 32 מעלות צלזיוס, נמס PIPAAm, שחרור vMTF. מתח בשכבת התא הפעיל גורם לשכבת PDMS הפסיבית להתכופף. מדידת אורך הקרנה ניתן להמיר לרדיוס עקמומיות על פי שיטות בGrosberg et al. 8 רדיוס עקמומיות משמש לחישוב מתח החתך הממוצע ברקמה. (ג) Sequential lig מועברתמונות HT של assay התכווצות נציג (סרגל קנה מידה: 1 מ"מ). רקמות להגיע לשיווי משקל, הם מגורה עם אנדותלין -1, אז טופל בHA-1077 כדי לאפשר רגיעה מוחלטת. עקומה סכמטי של מבט מהצד של רקמה אידיאלית במהלך assay (ד) נציג לחץ עבור assay ההתכווצות: תחתון.. שני ערכי לחץ מפתח מחושבים. טון בסיסי הוא ההבדל בין מדינת מתח שיווי משקל ומצב לחץ רגוע. התכווצות מושרה היא השינוי בלחץ ממצב שיווי המשקל למצב מגורה אנדותלין-1 (ה) טון בסל (ברים שגיאה: שגיאה סטנדרטית, n = 5 - 12) ברים (F) התכווצות מושרה (שגיאה:.. שגיאה סטנדרטית, n = 5 - 12). © IOP הוצאה לאור. לשכפל ו / או שונה ברשות. כל הזכויות שמורות. 19 אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר שלנתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שבונה על טכנולוגיה שפותחה בעבר vMTF, מאפשרים פעמים ניסוי מורחבות טיפוסיות יותר של מסלולי מחלת כלי דם כרוניים 1,23,24. כדי להשיג זאת, אנו micropattern genipin, אשר בעבר הוכח לספק functionalization לטווח הארוך של מצעי PDMS 11, תוך שימוש בטכניקה בתצהיר microfluidic להניב lamellae עורקים מהונדס עם כדאיות רקמות כלי דם משופרת לשימוש בניסויי התכווצות MTF. מקיין et al. פיתח מצע חלופי micromolded הידרוג'ל ג'לטין לתרבות מורחבת של רקמות מהונדסות לב לכמה שבועות במודל MTF קשור 25.

פרוטוקול זה הניב vMTFs שחיקה בהצלחה מבנה lamella עורקים (איור 2) ופונקציה (איור 3) במהלך שבועיים. בעוד השלמה מוצלחת של הפרוטוקול הציג תשואות מיל הרצויult פעמים תרבות הוארכו כמובן זמן מחלה-רלוונטית (למשל, השפעות פתולוגיים של vasospasm המוחית מתמידה עד 14 ימים 26), כמה ממכשולים נפוצים להתעורר. שימוש חוזרים ונשנים של תוצאות מכשירי microfluidic PDMS בנזק מזיק שיכול לגרום לחסימה חלקית או מלאה של סניפים במכשיר. לפיכך, מכשירים חדשים יש להשתמש עבור כל ניסוי. נושא נוסף, ואילו לא נפוץ כמו, הוא delamination בלתי צפוי והעקבי של רקמות. מופעים אלה נראים אקראיים בטבע ונדיר בהתרחשות. על ידי התבוננות, רקמות יוצרות מבנה סתמי או כמו לומן-לפני delaminating. אנחנו גם נצפו התנהגות זו ברקמות מפוברקות באמצעות טכניקות הדפסת microcontact. לפיכך, אנו סבורים נושא זה להיות התוצאה של או-או זריעה על מתג פנוטיפי בVSMCs התרבותי שגורם להתנהגות חריגה ולא תוצאה ישירה של שיטות הייצור שהוצגו כאן.

Microfluid הנוכחיעיצוב IC דורש דפוסי זרימה ליניארית וככזה, הוא מוגבל לרקמות עם יישור לכיוון עיקרי אחד. בקשה לרקמות הדורשות דפוסים מורכבים יותר, כגון דפוס "הקיר לבנים" של מבנה שריר הלב של חדר 27, תדרוש עיצוב microfluidic משוכלל יותר. אנחנו לא זורעים מצעים-שונה genipin עם סוגי תאים אחרים. עם זאת, genchi et al. הראה הוארך כדאיות של שריר שלד איזוטרופיים על-שונה genipin PDMS 11. כך, אנו מרגישים בטוחים שגרסה שונה מינימאלית של פרוטוקול זה יש תחולה רחבה למערכות איברים אחרות בהתפתחות העתידית של טכנולוגיות איבר-על-שבב.

שיטת חישוב המתח לvMTFs מבוססת על שיטות קודמות 8 מוגבלת על ידי ההתכווצות היחסית ברקמות ואורך חתך מקביל הסרטים הדקים. אם לחתוך יותר מדי זמן, סרטים יהיו להתכרבל על עצמם. אם לחתוך קצר מדי, סרטים לא יהיוND. כל מקרה מונע ניתוח נכון של נכסי התכווצות בשל מגבלות מודל. אורך חתך נכון צריך להיות מעודן באמצעות ניסויים חוזרים ונשנים. יישום של מערכת חריטה בלייזר, כמו באח Agarwal al., יכול לשפר את הדירות ואת איכות של MTF חיתוך 28.

היכולת לשחזר טוב יותר מבנה רקמת ילידים ותפקוד במערכת ניסיונית בחוזקה בשליטה, עצמאית היא מרדף מפתח בתחום של ביו-הנדסה. מרדף זה הוביל לפיתוח של כמה מחקה רקמה במבחנה ואיברים-על-שבב רב תפקודי, עדיין פשוטים מודל, קידום ההבנה של פיסיולוגי בסיסיות והתנהגויות פתולוגיים של מערכות איברים 29,30. באמצעות תצהיר של genipin על גבי מצעי PDMS, יש לנו הפגנו כדאיות תא מורחבות ותחזוקה של תפקוד שרירים חלק וכלי דם יותר משבועות. זהו שיפור משמעותי על פני techn ייצור הקודםiques, אשר יכול להוביל לdelamination של רקמות ותאי מוות לאחר 4-7 ימים בתרבות 19, ועשוי לסייע לפיתוח שיטות עורק-על-שבב חזקים יותר. בשל האופי הכרוני של רוב המחלות לב וכלי דם, מראש זה מספק מסגרת למגוון רחב של חקירות עתיד למנגנוני התכווצות כלי דם מעורבים בפתולוגיות ספציפיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip staining rack Electron Microscopy Sciences www.emsdiasum.com/ 72239-04
Microscope cover glass - 25 mm Fisher Scientific, Inc. www.fishersci.com 12-545-102
Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ #21458
1-butanol Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com 360465
Spincoater Specialty Coating Systems, Inc. www.scscoatings.com
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives (Dow Corning) www.ellsworth.com 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Fluorescent microbeads Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ 17151
Silicon wafers Wafer World, Inc. www.waferworld.com 2398
Photoresist  MicroChem Corp. www.microchem.com
Contact mask aligner Suss MicroTec www.suss.com
Developer MicroChem Corp. www.microchem.com
Tridecafluro-trichlorosilane UCT Specialties, Inc. www.unitedchem.com T2492
Surgical biopsy punch Integra LifeSciences Corp. www.miltex.com 33-31AA-P/25
Genipin Cayman Chemical www.caymanchem.com 10010622
1X phosphate buffered saline Mediatech, Inc. www.cellgro.com 21-031-CV
Fibronectin Corning, Inc. www.corning.com 356008
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com 15140-122
Umbillical artery smooth muscle cells Lonza www.lonza.com CC-2579
Tyrode's solution components Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com various
Stereomicroscope Zeiss www.zeiss.com 4350020000000000
Temperature-controlled platform Warner Instruments www.warneronline.com 641659; 640352; 641922
Endothelin-1 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com E7764-50UG
HA-1077 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com H139-10MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humphrey, J. D., Baek, S., Niklason, L. E. Biochemomechanics of cerebral vasospasm and its resolution: I. A new hypothesis and theoretical framework. Ann. Biomed. Eng. 35, 1485-1497 (2007).
  2. Hald, E. S., Alford, P. W. Smooth muscle phenotype switching in blast traumatic brain injury-induced cerebral vasospasm. Transl. Stroke Res. 5, 385-393 (2014).
  3. Olivetti, G., Anversa, P., Melissari, M., Loud, A. V. Morphometry of medial hypertrophy in the rat thoracic aorta. Lab. Invest. 42, 559-565 (1980).
  4. , Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
  5. Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
  6. Rhodin, J. A. G. Architecture of the vessel wall. Physiol. Rev. ed, B. erne,R. ., , American Physiology Society. (1979).
  7. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 19943-19948 (2011).
  8. Grosberg, A., Alford, P. W., McCain, M. L., Parker, K. K. Ensembles of engineered cardiac tissues for physiological and pharmacological study: heart on a chip. 11, 4165-4173 (2011).
  9. Alford, P. W., Nesmith, A. P., Seywerd, J. N., Grosberg, A., Parker, K. K. Vascular smooth muscle contractility depends on cell shape. Integr. Biol. (Camb). 3, 1063-1070 (2011).
  10. Win, Z., et al. Smooth muscle architecture within cell-dense vascular tissues influences functional contractility). Integr. Biol. (Camb). , (2014).
  11. Genchi, G. G., et al. Bio/non-bio interfaces: a straightforward method for obtaining long term PDMS/muscle cell biohybrid constructs). Colloid Surface B. 105, 144-151 (2013).
  12. Fessel, G., Cadby, J., Wunderli, S., van Weeren, R., Snedeker, J. G. Dose- and time-dependent effects of genipin crosslinking on cell viability and tissue mechanics - Toward clinical application for tendon repair. Acta Biomater. , (2013).
  13. Lima, E. G., et al. Genipin enhances the mechanical properties of tissue-engineered cartilage and protects against inflammatory degradation when used as a medium supplement. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 692-700 (2009).
  14. Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. J. Biomed. Mater. Res. A. , (2011).
  15. Satyam, A., Subramanian, G. S., Raghunath, M., Pandit, A., Zeugolis, D. I. In vitro evaluation of Ficoll-enriched and genipin-stabilised collagen scaffolds. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2012).
  16. Alford, P. W., et al. Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 12705-12710 (2011).
  17. Song, H., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. A microfluidic system for controlling reaction networks in time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, 768-772 (2003).
  18. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  19. Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. Long-term vascular contractility assay using genipin-modified muscular thin films. Biofabrication. 6, 045005 (2014).
  20. Han, M., Wen, J. K., Zheng, B., Cheng, Y., Zhang, C. Serum deprivation results in redifferentiation of human umbilical vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C50-C58 (2006).
  21. Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
  22. Volfson, D., Cookson, S., Hasty, J., Tsimring, L. S. Biomechanical ordering of dense cell populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15346-15351 (2008).
  23. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis. Hypertension. 38, 581-587 (2001).
  24. Kayembe, K. N., Sasahara, M., Hazama, F. Cerebral aneurysms and variations in the circle of Willis. Stroke. 15, 846-850 (1984).
  25. McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
  26. Weir, B., Grace, M., Hansen, J., Rothberg, C. Time course of vasospasm in man. 48, 173-178 (1978).
  27. McCain, M. L., Sheehy, S. P., Grosberg, A., Goss, J. A., Parker, K. K. Recapitulating maladaptive, multiscale remodeling of failing myocardium on a chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9770-9775 (2013).
  28. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).
  29. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).
  30. Meer, A. D., van den Berg, A. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse. Integr. Biol. (Camb). 4, 461-470 (2012).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 100 שינוי מצע מיקרופלואידיקה בתצהיר חלבון תאי שריר חלק בכלי דם כדאיות תא polydimethylsiloxane genipin הנדסת רקמות עורקים תכונות מכאניות,
טכניקת microfluidic Genipin הפקדת לתרבות מורחבת של כלי דם micropatterned השרירים Thin Films
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, … More

Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films. J. Vis. Exp. (100), e52971, doi:10.3791/52971 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter