Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Микрожидкостных генипин осаждения Техника для расширенной культуры Micropatterned сосудистых мышечной тонких пленок

Published: June 26, 2015 doi: 10.3791/52971
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota

Introduction

Сосудистые заболевания, такие как церебральный вазоспазм 1,2, гипертонии 3 и 4, атеросклероза развиваются медленно, как правило, хронический характер, и привлечь неблагополучных силы поколения сосудистыми гладкомышечных клеток (VSMCs). Мы стремимся, чтобы изучить эти медленно прогрессирующее-сосудистых дисфункций, используя в пробирке методами с более точного управления экспериментальных условиях, чем в естественных условиях модели в. Ранее мы уже разработаны сосудистые мышечные тонкие пленки (vMTFs) для измерения функциональной сократительной в пробирке инженерии тканей сердечно-сосудистых 5, но этот способ был ограничен относительно краткосрочные исследования. Здесь мы представляем технику модификации субстрата, который расширяет наш предыдущий метод vMTF для долгосрочных измерений.

В то время как эндотелий также имеет важное значение в общей сосудистой функции, разработаны артериальной ламели обеспечивают полезную модель системы оценки изменения в сосудистойсократимость во прогрессирования заболевания. Чтобы сконструировать функциональную модель сосудистых заболеваний тканей, как структуру и функцию артериальной ламели, основной единицей сократительного сосуда, должна быть воспроизводятся с высокой точностью. Артериальная ламели представляют собой концентрические окружности, выровненный листы сократительных VSMCs разделенных листов эластина 6. Микроконтактной печати внеклеточного матрикса (ЕСМ) белки на полидиметилсилоксановых (PDMS) подложках ранее использовались, чтобы обеспечить сигналы наведения для тканевой организации, чтобы имитировать выровнены сердечно-сосудистой ткани 5,7-10. Тем не менее, ткани с рисунком, используя микроконтактной печати может потерять целостность после 3-4 дней в культуре, что ограничивает их применимость в длительных исследованиях. Этот протокол обеспечивает решение этой проблемы путем замены предыдущих методов микроконтактная печати с новой техникой микрофлюидного осаждения.

Генчи др. Модифицированные PDMS субстраты с генипин и Fкруглый продлен жизнеспособность миоцитов до одного месяца в культуре 11. Здесь мы используем аналогичный подход, чтобы расширить культуру рисунком гладкомышечных клеток сосудов ПДМС. Генипин, естественно гидролитической производное гардении фруктов, является желательным кандидатом для модификации подложки из-за его относительно низкой токсичности по сравнению с аналогичными сшивающих агентов и его более широкое использование в качестве биоматериала в области восстановления тканей 12,13 и модификации ECM 14, 15. В этом протоколе, фибронектин используется в качестве ячейки наведения команде, как и в предыдущих методов микроконтактная печати; Однако, генипин осаждается на подложках PDMS до фибронектина паттерна. Таким образом, как клетки деградируют в узорной матрицу, вновь синтезированный ЕСМ из прилагаемых VSMCs может связываться с генипин покрытием PDMS подложки.

Этот протокол использует микрожидкостных доставки устройство для двухступенчатой ​​генипин и осаждения ECM. Дизайн микрожидкостных имитирует устройство microcontact модели печатные, используемые для инженерных артериальной ламелей в предыдущих исследованиях 16. Таким образом, мы ожидаем, что этот протокол для получения артериальной ламели имитирует, что успешно воспроизводят высоко выровнены в структуре естественных и сократительной функции артериальной ламелей. Мы также оценить сократительную ткань, чтобы подтвердить, что это генипин подходит модификация субстрата соединение для долгосрочного в пробирке моделей сосудистых заболеваний.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: Цель данного протокола состоит в построении и использовать сосудистую мышечную тонкую пленку (vMTF) со структурой, показанной на рисунке 1, чтобы оценить сократимость течение длительного культуре сосудистых гладкомышечных клеток (VSMCs) ПДМС субстратов. Чтобы продлить жизнеспособность VSMC, мы используем сшивающий соединение генипин. Подложки для этих vMTFs предназначены для анализа тканей сократимость, разработанной Гросберг др. 8 Другие методы vMTF 5 также могут быть использованы, с тонкими изменениями в представленной протокола изготовления подложки.

1. Изготовление основания

  1. Покровное очистки
    1. Поместите диаметром 25 мм покровные стекла в окрашивания покровное стойки. Поместите стойку в большой стакан или контейнер (например, пустой 100 -. 1000 мкл пипетки наконечник контейнера).
    2. Добавить 70% этанола в контейнер, чтобы полностью погрузить покровные. Разрушать ультразвуком их в течение по крайней мере 30 мин. </ LI>
    3. Удалить покровное стойки из раствора этанола. Разрешить покровные высохнуть на воздухе через повешение стойку в стерильной капот культуры (чтобы предотвратить накопление частиц на покровные) для 1- 2 часа.
      Примечание: Покровные стекла должны быть абсолютно сухими до следующих шагов.
  2. Поли (N-изо-пропилакриламид) (PIPAAm) Газа Изоляция на покровное
    1. Использование клейкой ленты, ленты по бокам от очищаемой покровного, оставляя открытую полосу по центру на покровное (рис 1А). Изменить ширину полосы этом открытом, основанной на применении и / или микрофлюидного дизайна.
    2. Марк края ленты полоски на покровное с использованием лабораторного маркера для последующего использования (рис 1А).
    3. Сокращение по периметру покровное, чтобы освободить от чашки (фиг.1А, пунктирная красная линия).
  3. Поли (N-изо-пропилакриламид) (PIPAAm) Покрытие
    1. Использование аналитических весов, весят 1 г PIPAAm порошок. Не следует использовать Неполимеризованные N-изо-пропилакриламид, который является канцерогеном.
    2. Передача PIPAAm к 50 мл центрифужную пробирку. Добавьте 10 мл 1-бутанола в химической капотом с получением 10% вес / об раствора. ВНИМАНИЕ: Температура вспышки 1-бутанола составляет 37 ° С. Храните полученный раствор в горючей шкафу и избежать нагрева.
    3. Разрешить PIPAAm распустить в течение 10 мин. Если порошок до сих пор видны, смешайте решение не используя вихревой смеситель-пока все порошок, хорошо растворимый.
      Примечание: Следующие шаги требуют использования спинового нанесения покрытий. Для каждого покровное:
    4. Поместите покровное приклеенный на спин нанесения покрытий патрон с щипцами.
    5. Передача 150 мкл раствора PIPAAm на покровное путем размещения капель вдоль открытого стекла в центре покровного стекла. Убедитесь, полный охват области воздействия.
    6. Спин пальто PIPAAm с помощью следующей рецепт:
      1. Рампа 10 сек до 3000 оборотов в минуту. Остановимся на 5 сек.
      2. Рампа 10 сек до 6,000 мин. Остановимся на 60 сек.
      3. Рампа 10 сек до 3000 оборотов в минуту. Остановимся на 5 сек.
    7. Поместите покровное в крытой чашке Петри с PIPAAm вверх. Дайте высохнуть в течение по крайней мере 15 мин.
    8. Осторожно снимите клейкую ленту из всех покровные, оставляя полную открытую покровное с тонким слоем покрытия PIPAAm в центральной полосе.
  4. PDMS покрытие
    1. Смешайте и дегазации 15 г PDMS в соотношении 10: сшивающего: 1 база. Добавить 7 - 8 капель ультразвуком 0,2 мкм флуоресцентные микрошарики перед смешиванием. Накройте чашку PDMS с алюминиевой фольгой, когда он не используется для предотвращения попадания пыли и других частиц из загрязняя PDMS.
      Примечание: Следующие шаги требуют использования спинового нанесения покрытий. Для каждого покровное:
    2. Поместите покровное PIPAAm покрытием на спин нанесения покрытий патрон с щипцами.
    3. Перевести PDMS на покровное, охватывающий, по меньшей мере одна треть площади покровного.
    4. Спин пальто, используя следующую Recipе:
      1. Ramp 5 сек до 500 оборотов в минуту. Остановимся 5 сек.
      2. Ramp 5 сек до 1000 оборотов в минуту. Остановимся 5 сек.
      3. Рампа 10 сек до 3000 оборотов в минуту. Остановимся 10 сек.
      4. Рампа 10 сек до 4000 оборотов в минуту. Остановимся 60 сек.
      5. Рампа 10 сек до 2000 оборотов в минуту. Остановимся 15 сек.
      6. Рампа 10 сек до 1000 оборотов в минуту. Остановимся 10 сек.
      7. Ramp 5 сек до 500 оборотов в минуту. Остановимся 5 сек.
    5. Поместите покровное в крытой чашке Петри с PDMS вверх. Запишите время, когда покровное был спин-покрытием. Следите за время, связанное с каждым покровным в течение всего эксперимента для последующего использования при определении толщины подложки PDMS.
    6. Поместите чашку Петри, содержащую покровные в 90 ° C сушильном шкафу в течение по меньшей мере 1,5 ч, чтобы обеспечить надлежащее отверждение PDMS. Если печь не доступен, пусть покровные вылечить в течение по крайней мере 48 часов при комнатной температуре.
    7. Удалить покровные из духовки и не храните их в темном ящике, пока готов к использованию.
    8. Отложите каждый четвертый покровное еили выше измерение толщины подложки, как функция времени нанесения покрытия, с профилометра.

2. Микрожидкостных рисунок для инженерных тканей

  1. Изготовление микрофлюидных устройств
    1. Дизайн тканей микрофлюидных Photomask
      1. Используйте любой соответствующую программу автоматизированного проектирования для разработки микрожидкостных узоры. Для артериальной пластин, состоящей из артерии пуповины гладкомышечных клеток сосудов человека, используют переменный образец 10 мкм каналов с 10 мкм стен.
      2. Используйте двоичный канал разветвления, если это возможно 17, но могут быть использованы другие конструкции ветвления. Уменьшите ширину и длину каналов для каждого разветвления итерации до достижения желаемого ткани шаблон оформления (стены и каналы, рис 1б).
      3. Конструкция устройства имеют один вход для обработки поверхности размещения раствора и одной выходной для применения вакуума.
      4. Потрясающийricate фотомаски содержащий микрожидкостных дизайн (ы), как описано ранее 18.
    2. Фотолитография подложек
      Примечание: Выполнение фотолитографии в подходящем помещения или аналогичный объект. Для того, чтобы кремниевых пластин с узорами для мягкой литографических изготовления тканей микрофлюидных устройств (~ 20 - 25 мкм высота канала) с использованием фотолитографии:
      1. Очистить кремниевой пластины в ацетон, метанол и изопропиловый спирт в течение 1 мин каждый. Высушите пластины с пистолетом азота.
      2. Предварительного обжига пластины на горячей плите в течение 5 мин при 115 ° С для удаления избытка влаги.
      3. Спин пальто пластина с SU-8 3025 фоторезиста с помощью следующей рецепт, чтобы получить располагает 20 - 25 мкм в высоту:
        1. Ramp 5 сек до 500 оборотов в минуту. Остановимся 5 сек.
        2. Рампа 15 сек до 4000 оборотов в минуту. Остановимся 15 сек.
      4. Мягкие выпекать пластины на горячей плите при 95 ° С в течение 15 мин.
      5. Загрузите фотошаблона, и подвергать тон полупроводниковой пластине в течение 16 с использованием вакуумного контактную программу на контакт Aligner маски.
      6. Жесткий выпекать пластины на горячей плите при 95 ° С в течение 4 мин.
      7. Разработка пластины для 6 мин в разработчика. Затем промыть пластины в два раза в течение 2 сек в пресной разработчика и промыть пластины с изопропилового спирта.
      8. Silanate узорный пластины O / N путем размещения 2 - 3 капли tridecafluoro-трихлорсилана в пустую чашку в вакуумном эксикаторе. Поддерживают пластины с использованием чашек Петри так, чтобы и в нижней и верхней части пластины подвергаются.
        ВНИМАНИЕ: Tridecafluro-трихлорсилана воспламеняется и коррозионную жидкость. Правильное индивидуальной защиты и местной вытяжной необходимо для использования.
    3. Ткань Изготовление Микрожидкостных Устройство
      1. Поставьте силанизировать, узорной пластины особенность стороной вверх в чашке Петри.
      2. Смешайте и дегазации 100 г PDMS с соотношении 10: сшивающего: 1 база. Вылейте PDMS в блюдо, полностью и равномерно покрывая пластины.
      3. Поместите блюдо в вакуумном эксикаторе, пока все пузырьки воздуха не будут удалены из неотвержденных PDMS, около 30 мин. Вылечить PDMS в чашке при 90 ° С в течение по меньшей мере 1,5 ч. Время и температуру можно отрегулировать, как диктуется принципов производства для получения полного излечения.
      4. После отверждения PDMS, вырезать PDMS около пластины с лезвием и тщательно освободить PDMS покрытые пластины из тарелки. Удалить лишние PDMS под пластины и медленно корка PDMS от верхней пластины.
      5. Поместите PDMS диск особенность стороной вверх в чистую чашку и хранить пластины от света после использования.
      6. Срежьте лишние PDMS от вокруг шаблоны, используя лезвие бритвы. Cut устройства в прямоугольных форм (рис 1в), чтобы облегчить шелушение устройства из субстратов в последующих шагах. Точные разрезы не нужны, если достаточно пространство существует для впускного, розетки, и рисунок ткани области (рис 1в).
      7. Панчвпускные и выпускные отверстия (рис 1в) с использованием 1 мм хирургической биопсии удар.
  2. Микрожидкостных Нанесение Устройство
    Примечание: В этом протоколе, Микрожидкостных доставки используется для нанесения рисунком генипин, ключевой сшивающий агент для долгосрочного культивирования тканей, а также фибронектин. Шаги до пенициллина / стрептомицина стерилизации (2.2.3) не нужно проходить в стерильных условиях, но ограничения загрязнения и пыли коллекция призвал на протяжении протокола. Все шаги, происходящие после покровного стерилизации пенициллина / стрептомицина (2.2.3) следует использовать стерильную технику. Примечание: Эта часть протокола должна быть запущена один день до посева клеток.
    1. Основания и Микрожидкостных Устройство Подготовка
      1. Разрушать ультразвуком микрожидкостных устройства в 70% этаноле в течение не менее 30 мин.
      2. Высушите ультразвуком микрожидкостных устройства с помощью сжатого воздуха или азота, и поместите их в блюдо Wi-Петрий канал имеет лицевой стороной вверх, чтобы предотвратить излишний износ от особенностей.
      3. Поместите до 10 vMTF подложки покровные в уборщицей УВО (крышка снята на блюдо так, поверхность функционализируют) в течение 8 мин.
      4. Снимите УВО обработанных покровные, и поместите микрофлюидных устройства имеют стороной вниз на каждой скольжения по одному за раз (ориентация должна быть похожа на рис 1С). Плотно прижмите устройств, чтобы обеспечить плотное прилегание к PDMS-покрытием покровные.
    2. Отложение генипин и фибронектина
      1. Подготовка 5 мг / мл раствора генипин добавлением 1 мл стерильной DDH 2 O в 5 мг лиофилизированного контейнера генипин. Смешайте раствор с помощью вихревого смесителя-. Отложите при комнатной температуре в течение по крайней мере 30 мин.
        Примечание: порошок трудно растворить при комнатной температуре, так повторяющиеся перемешивание в течение по крайней мере одну минуту часто необходимо.
      2. Быстро, поместить каплю 70% -ного этанола на входе каждого устройства для заправки устройства. Примечание: ETHAnol должны фитиль через устройства.
      3. После 5 - 10 мин, тщательно аспирата избыток этанола на входе, сразу же заменив его 1X фосфатным буферным раствором (PBS) на входе. С этого момента, обязательно, чтобы не допустить на входе, чтобы стать полностью сухим, чтобы избежать введения воздуха в устройстве.
      4. Поместите наконечник Вакуумный аспиратор на выходе из каждого устройства. Нарисуйте 1X PBS через устройства для полоскания этанола прочь. Оставьте небольшое количество 1X PBS на входе. Примечание: Если на входе появляется почти сухой, добавьте больше 1X PBS.
      5. Аспирируйте избыток 1X PBS, так что только небольшое количество остается на входе перед нанесением раствора генипин.
      6. Поместите 60 мкл 5 мг / мл раствора генипин на каждом входе (рис 1D). Нарисуйте генипин решение через устройств путем размещения аспиратор наконечник вакуумного на выходе (рис 1D). Будьте уверены, чтобы не привлечь все решения через, оставив небольшое количество раствора на входе.
      7. Место капли (приблизительно центов размера) от 1X PBS как на входе и на выходе, чтобы поддерживать смачивание в процессе инкубации. Перемещение блюдо, содержащее устройства для влажной духовке или инкубатора (стерильной среде не надо), установленные до 37 ° С, и инкубируют в течение 4 ч. Тарелки не должны быть покрыты.
      8. Во время инкубации, ресуспендируют фибронектин в концентрации 50 мкг / мл в стерильной DDH 2 O на льду в течение по крайней мере 30 минут до нанесения на микрожидком устройства.
      9. После инкубации генипин, аспирация все оставшиеся 1X PBS на выходах устройств. Продолжать применять вакуумный аспиратор на каждом выходе устройства, потянув в течение оставшегося 1X PBS на входе.
      10. Поместите 100 мкл 50 мкг / мл раствора фибронектина на каждом входе, добавляя к минимальным количеством оставшегося 1X PBS на входе (рис 1D).
      11. Нарисуйте фибронектина решение через устройств, использующих наконечник вакуумного аспиратора на выходе (
      12. Перемещение непокрытой тарелку, содержащую устройства в печи или инкубатор до 37 ° С, и инкубируют в течение 24 ч. Примечание: шаг фибронектин не требует смачивания входе и выходе с 1X PBS. Остальные бассейн фибронектина на входе будет высыхать. Ожидается, что это.
    3. Стерилизация и подготовка для сотового Раздают
      1. Приготовьте раствор пенициллина / стрептомицина для стерилизации узорные vMTF покровные. Добавляют 5 мл пенициллина / стрептомицина (10000 единиц / мл; 10,000 мкг / мл) к 500 мл стерильного 1X PBS.
      2. Поместите блюдо, содержащее устройств в стерильных капот биобезопасности.
      3. Осторожно удалите устройства от покровных медленно пилинг устройство на углу, в то время как слегка захватывая покровное в противоположную руку.Примечание: Этот шаг требует практики, чтобы уменьшить ущерб покровное в процессе удаления. Альтернативой является использование шприца, чтобы ввести 1X PBS на входе и / или выходе, чтобы помочь в освобождении устройства.
      4. Поместите покровные в стерильные чашки шесть скважин. Добавить по крайней мере, 5 мл пенициллина / стрептомицина раствора в каждую лунку. Поместите посуду в стерильном инкубаторе при 37 ° С в течение не менее 30 мин.
      5. После стерилизации, аспирации раствор пенициллина / стрептомицина, и семян покровные с культивированных человеческих пупочной артерии гладкие мышцы сосудов cells19 (рис 1D). Концентрация посева для VSMCs составляет ~ 80000 клеток на см 2. Чтобы уменьшить количество клеток, необходимых для каждого образца, использовать редуктор для уменьшения площади посева. Одним из примеров является редуктором разрез верхней части 15 мл коническую пробирку, прикрепленной к покровным стерильной вакуумной смазки перед посевом.
      6. Инкубируйте семенами покровные в стерильном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2 (2А-Б).
    4. Долгосрочный vMTF культуры ткани
      1. Однажды после посева, удалить среду клеток и редукторов. Промыть тканей с 1X PBS. Добавить 4 мл бессывороточной среды клеток, чтобы индуцировать фенотип сократительную в VSMCs 20.
      2. Повторите промывание PBS 1X и добавлением свежего бессывороточной среде каждый день, как требуется для долгосрочного культуры.

Фигура 1
Рисунок 1. микрофлюидных устройство Белок доставки. () Замаскированы покровное для PIPAAm покрытия. Красный пунктирный круг: резка путь, чтобы освободить покровное (Б) представитель AutoCAD рисунок ткани микрофлюидного шаблон маски.. Врезка: Деталь двоичной ветвления в Alternтем создания 10 мкм х 10 мкм образец ткани. (С) размещение микрожидком устройства на покровное подложки с входом и выходом указано. (D) Схема микрожидком паттерна белка и доставки. Слева-направо: сканирующий электронный микроскоп изображение микроканалов (масштаб бар: 50 мкм); Подробную схему способа для осаждения белка; Иммуногистохимия окрашенных фибронектин (масштаб бар: 50 мкм); Сотовый посева с сосудистыми гладкие мышечные клетки. (Е) Схема сфабрикованному ткани. 1-й вставка: Деталь слоистой конструкции. 2-й вставка: Деталь модификации генипин из PDMS подложки после осаждения микрофлюидного. © Издательский ВГД. Воспроизводится и / или изменения с разрешения. Все права защищены. 19 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

3. Ткань Анализ Функция с vMTF сократимость анализе

Примечание: MTF сократимость анализ, представленный здесь, по образцу методике, разработанной в Гросберга др 8.

  1. vMTF Сократимость Эксперимент
    1. Поместите образец ткани в 100 мм блюдо. Добавить раствора8 стерильного 1X Тирода при рН 7,4 нагревают до 37 ° С, чтобы покрыть образец.
    2. Используйте лезвие, чтобы сделать несколько параллельных разрезов, перпендикулярных к краю PIPAAm. Сделайте сокращения образом, что дает более широкие слои ткани, которые будут vMTFs (с шириной ~ 2 мм), чередующихся с тонкими полосками (рис 3А, боковые порезы). Для того, чтобы чистые сокращения, поместите лезвие бритвы в контакте с образцом и твердо перетащить в сторону.
    3. Поверните блюдо на 90 ° и сделать две прямые, параллельные разрезы в середине ткани, параллельно полосе PIPAAm (рис 3А, конечные сокращений). Снимите и выбросьте рыхлой полосой ткани между этими разрезас и тонкие полоски между vMTFs (вырезать в предыдущем шаге), чтобы предотвратить смежные фильмы от контакта.
    4. Разрешить образец отдохнуть при комнатной температуре в течение 10 мин, или пока все PIPAAm не растворится. Примечание: Если PIPAAm остается в будущих шагов, образец может быть возвращен к режущей тарелки для растворения остаточного PIPAAm. Нежный скрип нижней vMTF может помочь в удалении PIPAAm, по мере необходимости.
    5. Нанесите небольшое пятнышко вакуумной смазки в чистом 35 мм чашки Петри. Добавьте 5 мл раствора свежего, стерильного 1X Тирода при 37 ° С. Передача покровное с вырезом фильмов из 100-мм блюдо 35 мм блюдо и нажмите на вакуумной смазкой, чтобы предотвратить движение покровного стекла.
    6. Поместите блюдо в платформе контролируемой температурой на этапе стереомикроскопа.
    7. Захват покадровой передается и люминесцентные изображения в требуемые интервалы (например,., 30 сек) на протяжении всего лечения анализе.
    8. Серийно лечения vMTFs с 50 нМ эндотелина-1 в течение 20 мин (индуцированной сжатие) и 100 мкМ HA-1077 в течение 30 мин (тканевой релаксации). Добавить концентрированные растворы каждой обработки в экспериментальной чашке, содержащей 5 мл стерильного раствора 1X Тирода в определенные моменты времени, получая целевой концентрации лечения в объеме 5 мл. Сделайте дополнения лечения в течение интервала между приобретений покадровой изображения, чтобы избежать захвата пипетки на изображениях.
  2. vMTF Сократимость анализ
    1. Использование покровные отведенных в 1.4.8, измерьте PDMS толщину подложки с profilometer21. Создать толщину против кривой времени спин для каждого набора покровные. Используйте эту кривую, чтобы оценить толщину vMTF для каждого покровного используется в эксперименте сократимости.
    2. Мера длины проекции vMTF для каждой временной точке в ходе эксперимента, и вычислить соответствующий радиус кривизны (Фиг.3В), используя ранее сообщалось о способах 8.
    3. Рассчитать vMTF стресс в каждый момент времени роInt, используя предыдущие методы vMTF 5.
      Примечание: Используйте расчетная толщина vMTF рассчитывается из 3.2.1. Измерьте толщину VSMC с помощью конфокальной изображения, как сообщалось ранее 9. Получить модуль Юнга PDMS от паспортах компания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Основная цель данной работы было продлить жизнеспособность micropatterned VSMCs на гидрофобных субстратов PDMS. Это было достигнуто путем включения микрожидкостных систему доставки, чтобы внести рисунком генипин и фибронектин на PDMS (рис 1). Отложение ECM белков с использованием микрожидкостных доставку дали высокую передачу верность рисунка канала с голыми PDMS между линиями генипин и фибронектина (рис 1D). Прикрепленные клетки (рис 1E) форма сливающихся монослоев, имитирующие структуру в естественных условиях артериальной ламелей (Рисунок 2), аналогичные предыдущей микроконтактной способов печати 5,10,16. Эти ткани дали отзывчивый, сократительные конструкции, чьи стресс измеряли с использованием технологии vMTF (Рисунок 3).

Качественная оценка жизнеспособности ткани на протяжении двух недель показали минимальное ухудшение на генипин-modifiEd субстраты (фиг.2А). Ткань слияния и выравнивание сохранялись в течение двух недель (рис 2B, 2C и 2D). Два основных значения напряжения были вычислены для каждого vMTF:. 1) базального тонуса и 2) индуцированное сократимость (3С и 3D) базального тонуса это напряжение поддерживается нестимулированных VSMCs при равновесии. Индуцированные сократимость дополнительный стресс, вызванный стимуляцией эндотелина-1. Оба базального тонуса и индуцированных сократимость показал последовательное поведение по две недели времени, конечно, демонстрируя вазоактивные тканей на протяжении (рис 3Е и 3F). Небольшое снижение сократительной ткани в конце анализа является прямым результатом уменьшенного количества клеток, образующих ткани, так как с недостатком сыворотки VSMCs не пролиферируют 19. Добавление минимальной базального уровня сыворотки в культуральной среде может облегчить этот результат в будущей работе.

Рисунок 2. Ткани остаются жизнеспособными и успешно Мимические в естественных условиях Артериальная слоистой структуры для двух недель на генипин-модифицированных субстратов () Типичные фазового контраста изображения тканей в жертву временных точках на протяжении двух недель (масштаб бар: 200 мкм).. (Б) Типичные иммуногистохимия изображения тканей, изготовленных на генипин модифицированные субстраты, закрепленных на 1 день, 4 день и 10 день после сывороточного голодания (зеленый: F-актина нитей, синий: ядра (показан установить присутствие клеток), масштаб бар .: 100 мкм) (С) Процент слияния измеряется F-актин покрытия (погрешности: стандартная ошибка, N = 3 - 7) (D) выравнивания ткани измеряется F-актин параметра порядка ориентация (ООП) 22 (баров ошибке. : стандартная ошибка, п = 3 - 7). © ВГД Publishiнг. Воспроизводится и / или изменения с разрешения. Все права защищены. Все права защищены. 19 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Ткань Сократимость поддерживается в течение двух недель. () Представитель vMTF резки схема. (Б) Схема разреза vMTF. После охлаждения ниже 32 ° С, растворяется PIPAAm, выпустив vMTF. Стресс в активном слое клеток вызывает пассивный слой PDMS, чтобы согнуть. Измерение длины проекции могут быть преобразованы с радиусом кривизны в соответствии с методами в Гросберга др. 8 Радиус кривизны используется для расчета среднего поперечного сечения напряжение в ткани. (С) Последовательное передаются LigHT изображения представительной сократимости анализа (масштаб бар: 1 мм). Ткани достичь равновесия, стимулируют эндотелина-1, затем обрабатывают HA-1077 для обеспечения полного расслабления. Внизу:. Схема вид сбоку идеализированной ткани в ходе анализа (D) представитель кривая напряжение для сократимости анализа. Два ключевых значения напряжения рассчитываются. Базальная тон разница между государством равновесия напряжений и расслабленном состоянии стресса. Индуцированные сократимость является изменение напряжения от равновесного состояния в эндотелина-1 стимулируется государством (Е) базального тонуса (планки погрешностей: стандартная погрешность, п = 5 - 12) (F), индуцированное сократимости (планки погрешностей:.. Стандартная ошибка, N = 5 - 12). © Издательский ВГД. Воспроизводится и / или изменения с разрешения. Все права защищены. 19 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версиюэтот показатель.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы приводим протокол, который строит на ранее разработанной технологии vMTF, позволяя расширенные раз эксперимент более характерно хронических сосудистых заболеваний путей 1,23,24. Чтобы достичь этого, мы micropattern генипин, который ранее было показано, чтобы обеспечить долговременную функционализации PDMS подложек 11, с использованием метода осаждения микрожидкостных с получением инженерии артериальное ламели с улучшенной жизнеспособности ткани сосудов для использования в экспериментах MTF сократимости. Маккейн и др. разработали альтернативный micromolded желатин гидрогеля субстрат для длительного культуры инженерных сердечных тканей в течение нескольких недель в соответствующей MTF модели 25.

Этот протокол дал vMTFs, которые успешно имитировали структуру артериальной ламелями (рисунок 2) и функции (рисунок 3) в течение двух недель. В то время как успешное завершение представленной протокола дает желаемых Резии расширенных времен культура заболевания релевантных времени курса (например, патологические эффекты церебрального вазоспазма сохраняющейся в течение до 14 дней 26), несколько распространенных ошибок, возникают. Повторное использование PDMS микрофлюидных устройств приводит вредного повреждений, которые могут привести к частичной или полной закупорке ветвей в устройстве. Таким образом, новые устройства должны быть использованы для каждого эксперимента. Другой вопрос, в то время как не так часто, неожиданно и непоследовательны отслоение тканей. Эти случаи, казалось, случайный характер и редко в возникновении. По наблюдениям, ткани образуют архи или просвет структуру, прежде чем расслоения. Мы также наблюдали это поведение в тканях, изготовленных с использованием методов микроконтактная печати. Таким образом, мы считаем, что этот вопрос будет результат либо через посева или фенотипической переключателя в культивируемых VSMCs, что приводит к некорректному поведению и не прямой результат способов изготовления представленных здесь.

Ток микрофлюидныхIC дизайн требует линейные структуры потока и, таким образом, ограничивается тканей с выравниванием в одном главном направлении. Применение тканей, требующих более сложной паттерна, таких как "кирпичная стена" образец желудочков миокарда структуры 27, потребует более сложную конструкцию микрожидкостных. Мы не высевают генипин модифицированные субстраты с другими типами клеток. Тем не менее, Генчи др. показали продлен жизнеспособность изотропной скелетных мышц на генипин модифицированный PDMS 11. Таким образом, мы уверены, что минимально модифицированный вариант этого протокола имеет широкое применение в других системах органов в будущем развитии орган-на-чипе технологии.

Метод расчета напряжений для vMTFs на основе предыдущих методов 8 ограничена относительной сократительной в тканях и соответствующей длины среза тонких пленок. Если вырезать слишком долго, фильмы будут виться на себя. Если вырезать слишком коротким, фильмы не будетбез обозначения даты Либо дело предотвращает надлежащий анализ сократительных свойств за счет модели ограничения. Правильное длина реза должны быть уточнены в повторных экспериментах. Внедрение системы лазерной гравировки, как и в Agarwal и соавт., Могут улучшить воспроизводимость и качество резки MTF 28.

Способность лучше воспроизводят структуру нативной ткани и функции в плотно контролируемой, автономный экспериментальной системы является ключевым стремление в области биотехнологии. Это стремление привело к разработке нескольких имитирует ткани в пробирке и мульти-функциональных, пока упрощенных модельных органов-на-чипе, углублению понимания фундаментальных физиологических и патологических поведения органов систем 29,30. Использование отложение генипин на подложках PDMS, мы продемонстрировали расширенный жизнеспособности и сохранение сосудистой функции гладкомышечных клеток в течение двух недель. Это значительное улучшение по сравнению с предыдущим изготовления технiques, которые могут привести к расслоению тканей и гибели клеток после 4 - 7 дней в культуре 19, и может помочь развитию более робастных методов артерии на-чипе. Из-за хронического характера большинства сосудистых заболеваний, это аванс обеспечивает основу для различных будущих расследований механизмов, участвующих в сократительных конкретных сосудистых патологий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip staining rack Electron Microscopy Sciences www.emsdiasum.com/ 72239-04
Microscope cover glass - 25 mm Fisher Scientific, Inc. www.fishersci.com 12-545-102
Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ #21458
1-butanol Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com 360465
Spincoater Specialty Coating Systems, Inc. www.scscoatings.com
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives (Dow Corning) www.ellsworth.com 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Fluorescent microbeads Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ 17151
Silicon wafers Wafer World, Inc. www.waferworld.com 2398
Photoresist  MicroChem Corp. www.microchem.com
Contact mask aligner Suss MicroTec www.suss.com
Developer MicroChem Corp. www.microchem.com
Tridecafluro-trichlorosilane UCT Specialties, Inc. www.unitedchem.com T2492
Surgical biopsy punch Integra LifeSciences Corp. www.miltex.com 33-31AA-P/25
Genipin Cayman Chemical www.caymanchem.com 10010622
1X phosphate buffered saline Mediatech, Inc. www.cellgro.com 21-031-CV
Fibronectin Corning, Inc. www.corning.com 356008
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com 15140-122
Umbillical artery smooth muscle cells Lonza www.lonza.com CC-2579
Tyrode's solution components Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com various
Stereomicroscope Zeiss www.zeiss.com 4350020000000000
Temperature-controlled platform Warner Instruments www.warneronline.com 641659; 640352; 641922
Endothelin-1 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com E7764-50UG
HA-1077 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com H139-10MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humphrey, J. D., Baek, S., Niklason, L. E. Biochemomechanics of cerebral vasospasm and its resolution: I. A new hypothesis and theoretical framework. Ann. Biomed. Eng. 35, 1485-1497 (2007).
  2. Hald, E. S., Alford, P. W. Smooth muscle phenotype switching in blast traumatic brain injury-induced cerebral vasospasm. Transl. Stroke Res. 5, 385-393 (2014).
  3. Olivetti, G., Anversa, P., Melissari, M., Loud, A. V. Morphometry of medial hypertrophy in the rat thoracic aorta. Lab. Invest. 42, 559-565 (1980).
  4. , Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
  5. Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
  6. Rhodin, J. A. G. Architecture of the vessel wall. Physiol. Rev. ed, B. erne,R. ., , American Physiology Society. (1979).
  7. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 19943-19948 (2011).
  8. Grosberg, A., Alford, P. W., McCain, M. L., Parker, K. K. Ensembles of engineered cardiac tissues for physiological and pharmacological study: heart on a chip. 11, 4165-4173 (2011).
  9. Alford, P. W., Nesmith, A. P., Seywerd, J. N., Grosberg, A., Parker, K. K. Vascular smooth muscle contractility depends on cell shape. Integr. Biol. (Camb). 3, 1063-1070 (2011).
  10. Win, Z., et al. Smooth muscle architecture within cell-dense vascular tissues influences functional contractility). Integr. Biol. (Camb). , (2014).
  11. Genchi, G. G., et al. Bio/non-bio interfaces: a straightforward method for obtaining long term PDMS/muscle cell biohybrid constructs). Colloid Surface B. 105, 144-151 (2013).
  12. Fessel, G., Cadby, J., Wunderli, S., van Weeren, R., Snedeker, J. G. Dose- and time-dependent effects of genipin crosslinking on cell viability and tissue mechanics - Toward clinical application for tendon repair. Acta Biomater. , (2013).
  13. Lima, E. G., et al. Genipin enhances the mechanical properties of tissue-engineered cartilage and protects against inflammatory degradation when used as a medium supplement. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 692-700 (2009).
  14. Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. J. Biomed. Mater. Res. A. , (2011).
  15. Satyam, A., Subramanian, G. S., Raghunath, M., Pandit, A., Zeugolis, D. I. In vitro evaluation of Ficoll-enriched and genipin-stabilised collagen scaffolds. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2012).
  16. Alford, P. W., et al. Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 12705-12710 (2011).
  17. Song, H., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. A microfluidic system for controlling reaction networks in time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, 768-772 (2003).
  18. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  19. Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. Long-term vascular contractility assay using genipin-modified muscular thin films. Biofabrication. 6, 045005 (2014).
  20. Han, M., Wen, J. K., Zheng, B., Cheng, Y., Zhang, C. Serum deprivation results in redifferentiation of human umbilical vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C50-C58 (2006).
  21. Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
  22. Volfson, D., Cookson, S., Hasty, J., Tsimring, L. S. Biomechanical ordering of dense cell populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15346-15351 (2008).
  23. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis. Hypertension. 38, 581-587 (2001).
  24. Kayembe, K. N., Sasahara, M., Hazama, F. Cerebral aneurysms and variations in the circle of Willis. Stroke. 15, 846-850 (1984).
  25. McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
  26. Weir, B., Grace, M., Hansen, J., Rothberg, C. Time course of vasospasm in man. 48, 173-178 (1978).
  27. McCain, M. L., Sheehy, S. P., Grosberg, A., Goss, J. A., Parker, K. K. Recapitulating maladaptive, multiscale remodeling of failing myocardium on a chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9770-9775 (2013).
  28. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).
  29. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).
  30. Meer, A. D., van den Berg, A. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse. Integr. Biol. (Camb). 4, 461-470 (2012).

Tags

Биоинженерии выпуск 100 модификация субстрата микрофлюидики осаждение белков клеток гладких мышц сосудов жизнеспособность клеток полидиметилсилоксан генипин артериальной тканевой инженерии механические свойства,
Микрожидкостных генипин осаждения Техника для расширенной культуры Micropatterned сосудистых мышечной тонких пленок
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, … More

Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films. J. Vis. Exp. (100), e52971, doi:10.3791/52971 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter