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Bioengineering

Técnica microfluídico genipina Deposição de Cultura Extensão da micropatterned vasculares musculares Filmes Finos

Published: June 26, 2015 doi: 10.3791/52971
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota

Introduction

As doenças vasculares, tais como vasospasmo cerebral 1,2, 3 hipertensão, aterosclerose e 4, desenvolvem-se lentamente, são tipicamente de natureza crónica, e envolvem disfuncional força de geração de células do músculo liso vascular (VSMCs). Nosso objetivo é estudar essas disfunções vasculares em progressão lenta utilizando métodos in vitro com um controle mais preciso de condições experimentais do que em modelos in vivo. Nós já desenvolvidas películas finas musculares vasculares (vMTFs) para a medição da contractilidade funcional de engenharia de tecidos in vitro cardiovasculares 5, mas este método tem sido limitada a estudos relativamente curto. Aqui, nós apresentamos uma técnica de modificação substrato que se expande a nossa técnica anterior vMTF para medições de longo prazo.

Enquanto o endotélio é também crítico na função vascular no geral, lamelas arterial projetado fornecer um sistema modelo útil para avaliar alterações na vascularcontractilidade durante a progressão da doença. Para manipular um modelo de tecido de doença vascular funcional, tanto a estrutura e função da lamela arterial, a unidade de base contrátil do recipiente, deve ser reproduzido com alta fidelidade. Arterial lamelas são concêntricos folhas, circunferencialmente alinhadas de VSMCs de contrácteis separadas por folhas de elastina 6. Microcontact impressão de matriz extracelular (ECM) proteínas sobre substratos de polidimetilsiloxano (PDMS) foi anteriormente utilizada para fornecer sinais de orientação para a organização do tecido para imitar alinhados tecido cardiovascular 5,7-10. No entanto, tecidos estampados com impressão microcontact pode perder a integridade após 3-4 dias em cultura, o que limita a sua aplicabilidade em estudos crônicos. Este protocolo fornece uma solução para este problema, substituindo técnicas de impressão microcontact anteriores com uma nova técnica de deposição de microfluidos.

Genbutsu et al. PDMS substratos modificados com genipina e found viabilidade de miócitos prolongada até um mês na cultura 11. Aqui, usamos uma abordagem semelhante para estender a cultura de células de músculo liso vascular estampados em PDMS. Genipina, um derivado hidrolítica natural da fruta gardénia, é um candidato desejável para modificação do substrato, devido à sua toxicidade relativamente baixa em comparação com agentes de reticulação similares e a sua crescente utilização como biomaterial nos domínios da reparação de tecidos e modificação 12,13 ECM 14, 15. Neste protocolo, a fibronectina é utilizada como um sinal de orientação de células, tal como nos processos anteriores de impressão microcontacto; no entanto, genipina é depositada sobre substratos de PDMS antes da fibronectina padronização. Assim, como as células degradam a matriz modelado, ECM recém-sintetizados a partir de VSMCs de anexados podem ligar-se ao substrato revestido PDMS-genipina.

Este protocolo utiliza um dispositivo de fornecimento de microfluidos de genipina de duas etapas e de deposição de ECM. O design do dispositivo microfluídico imita micromedidorpadrões de impressão ntact utilizados para lamelas arterial engenharia em estudos anteriores 16. Assim, esperamos que este protocolo para produzir imita lamelas arterial que recapitulam o sucesso altamente alinhado na estrutura vivo e função contrátil de lamelas arterial. Nós também avaliar a contratilidade tecido para confirmar que genipina é um composto modificação substrato adequado para longo prazo em modelos de doenças vasculares in vitro.

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Protocol

Nota: O objectivo deste protocolo é de construir e utilizar um filme fino vascular muscular (vMTF) com a estrutura mostrada na Figura 1 para avaliar a contractilidade durante a cultura prolongada de células de músculo liso vascular (VSMC) em substratos de PDMS. Para prolongar a viabilidade VSMC, nós utilizamos o genipina composto reticulador. Os substratos para estes vMTFs são projetados para analisar a contratilidade tecido desenvolvido pelo Grosberg et al. 8 Outros métodos vMTF 5 também podem ser utilizados, com mudanças sutis ao protocolo fabricação substrato apresentados.

1. Substrato Fabrication

  1. Limpeza lamela
    1. Coloque 25 milímetros lamelas de vidro de diâmetro em um suporte de coloração lamela. Coloque o rack em um grande copo ou recipiente (por exemplo, um vazio 100 -. 1000 ul pipeta de ponta recipiente).
    2. Adicionar etanol a 70% ao recipiente para imergir completamente as lamelas. Sonicar durante pelo menos 30 min. </ Li>
    3. Remover a cremalheira lamela da solução de etanol. Permitir que as lamelas para o ar seco por enforcamento do rack em uma capa de cultura estéril (para evitar a acumulação de partículas em lamelas) por 1- 2 horas.
      Nota: As lamelas de cobertura deve ser completamente seco antes de as seguintes etapas.
  2. Poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) Faixa de isolamento em Coverslip
    1. Usando fita adesiva, fita de fora dos lados de uma lamela limpa, deixando uma tira exposta centrado sobre a lamela (Figura 1A). Modificar a largura desta faixa exposta com base na aplicação e / ou projeto microfluídico.
    2. Mark as bordas de tiras de fita sobre a lamela usando um marcador de laboratório para posterior referência (Figura 1A).
    3. Corte em torno do perímetro da lamela para liberar a partir do prato (Figura 1A, linha tracejada vermelha).
  3. Poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) Revestimento
    1. Usando uma balança analítica, pesar 1 g de PIPAAm pó. Não use não polimerizado N-iso-propilacrilamida, que é uma substância cancerígena.
    2. Transferir a PIPAAm para um tubo de centrífuga de 50 ml. Adicionar 10 ml de 1-butanol no interior de uma capa química para se obter uma solução a 10% w / v. CUIDADO: O ponto de inflamação de 1-butanol é de 37 o C. Guardar a solução resultante em um gabinete inflamável e evitar aquecimento.
    3. Permitir que o PIPAAm para dissolver durante 10 min. Se o pó é ainda visível, misturar a solução com um vortex-mixer até que todos se dissolve em pó.
      Nota: Os seguintes passos requerem a utilização de um revestidor de rotação. Para cada lamela:
    4. Coloque a lamela gravado na rotação coater chuck com uma pinça.
    5. Transferir 150 ul da solução PIPAAm para a lamela, colocando gotículas ao longo do vidro exposta no centro da lamela. Assegurar a cobertura completa da área exposta.
    6. Revestimento de spin PIPAAm com a seguinte receita:
      1. Rampa de 10 segundos a 3000 rpm. Habitar por 5 s.
      2. Rampa de 10 seg a 6,000 rpm. Habitar durante 60 segundos.
      3. Rampa de 10 segundos a 3000 rpm. Habitar por 5 s.
    7. Coloque a lamela numa caixa de Petri coberta com o PIPAAm voltado para cima. Deixar secar ao ar durante pelo menos 15 min.
    8. Remova cuidadosamente a fita adesiva de todos os lamelas, deixando a lamela completa exposta com uma fina camada de revestimento PIPAAm em uma faixa central.
  4. PDMS Coating
    1. Misture e desgaseificar 15 g de PDMS em uma proporção de 10: crosslinker: base 1. Adicionar 7-8 gotas de sonicadas microesferas fluorescentes 0,2 um antes de se misturar. Cubra o copo de PDMS com folha de alumínio quando não estiver em uso para evitar a poeira e outras partículas de contaminar o PDMS.
      Nota: Os seguintes passos requerem a utilização de um revestidor de rotação. Para cada lamela:
    2. Coloque uma lamela PIPAAm-revestido na rotação coater chuck com uma pinça.
    3. Transferir para o PDMS lamela, abrangendo, pelo menos, um terço da área da lamela.
    4. Casaco de rotação com a seguinte recipe:
      1. Rampa de 5 segundos a 500 rpm. Habitar 5 sec.
      2. Rampa de 5 segundos a 1000 rpm. Habitar 5 sec.
      3. Rampa de 10 segundos a 3000 rpm. Habitam 10 seg.
      4. Rampa de 10 segundos a 4000 rpm. Habitam 60 seg.
      5. Rampa de 10 seg a 2000 rpm. Habitam 15 seg.
      6. Rampa de 10 segundos a 1000 rpm. Habitam 10 seg.
      7. Rampa de 5 segundos a 500 rpm. Habitar 5 sec.
    5. Coloque a lamela numa caixa de Petri coberta com o PDMS voltado para cima. Registre o momento em que a lamela foi spin-revestido. Mantenha o controle do tempo associado a cada lamela durante todo o experimento para uso posterior na determinação da espessura do substrato PDMS.
    6. Colocar a placa de Petri contendo as lamelas em um forno a 90 ° C durante pelo menos 1,5 h para assegurar uma cura adequada PDMS. Se um forno não está disponível, as lamelas deixar curar durante pelo menos 48 horas à temperatura ambiente.
    7. Retirar as lamelas do forno e armazená-los em uma gaveta escura até que esteja pronto para uso.
    8. Separe cada quarta lamela fou posterior medição da espessura do substrato, como uma função do tempo de revestimento por rotação, com um perfilómetro.

2. Patterning microfluídicos para Tecidos Engenharia

  1. Fabricação de dispositivos microfluídicos
    1. Design of Tissue fotomáscara Microfluidic
      1. Use qualquer programa de desenho assistido por computador apropriado para projetar padrões microfluídicos. Para lamelas arterial composto de artéria cordão umbilical células musculares lisas vasculares humanas, utilizam um padrão alternado de 10 uM canais com paredes 10 um.
      2. Use canal binário de ramificação, se possível 17, mas podem ser utilizados outros modelos de ramificação. Diminuir a largura e comprimento dos canais para cada iteração de ramificação até atingir o padrão de tecido desejado espaçamento (paredes e canais, Figura 1B).
      3. Conceber o dispositivo ter uma única entrada para a colocação solução de tratamento de superfície e uma única saída para aplicação de vácuo.
      4. Fabricate uma fotomáscara contendo o desenho de microfluidos (s), como previamente descrito 18.
    2. Fotolitográfica Wafer Fabricação
      Nota: Execute fotolitografia em uma sala limpa adequada ou instalação semelhante. Para fazer pastilhas de silício com os padrões para a fabricação litográfico macio de dispositivos microfluídicos de tecido (~ 20-25 mm altura do canal) utilizando fotolitografia:
      1. Limpar uma bolacha de silício em acetona, metanol e álcool isopropílico durante 1 min cada. Seca-se a pastilha com uma pistola de azoto.
      2. Prebake a bolacha sobre uma placa de aquecimento durante 5 minutos a 115 ° C para remover o excesso de humidade.
      3. Revestimento de spin o wafer com SU-8 3025 photoresist usando a seguinte receita para produzir apresenta 20-25 mm de altura:
        1. Rampa de 5 segundos a 500 rpm. Habitar 5 sec.
        2. Rampa de 15 seg a 4000 rpm. Habitam 15 seg.
      4. Coza macio a bolacha sobre uma placa quente a 95 ° C durante 15 min.
      5. Coloque uma photomask, e expor tele bolacha por 16 seg usando um programa de contato vácuo em um alinhador de contato da máscara.
      6. Disco cozer a bolacha sobre uma placa quente a 95 ° C durante 4 min.
      7. Desenvolver o wafer de 6 min em desenvolvedor. Em seguida, lava-se a pastilha por duas vezes durante 2 segundos em revelador novo e enxaguar o wafer com álcool isopropílico.
      8. Silanate modelado a bolacha S / N, colocando 2-3 gotas de tridecafluoro-triclorossilano num prato vazio num exsicador de vácuo. Prop-se a bolacha usando pratos de Petri de modo a que tanto a parte inferior e superior da bolacha são expostos.
        CUIDADO: Tridecafluro-trichlorosilane é um líquido inflamável e corrosivo. Equipamento de protecção individual adequado e exaustão local é necessária para o uso.
    3. Tecido de dispositivos microfluídicos Fabrication
      1. Coloque um silanado, recurso do lado do wafer modelou-se em uma placa de Petri.
      2. Misture e desgaseificar 100 g de PDMS com uma proporção de 10: crosslinker: base 1. Despeje o PDMS para o prato, completa e uniformemente cobrindo o wafer.
      3. Colocar a cápsula num exsicador de vácuo até que todas as bolhas de ar são removidas a partir dos PDMS não curado, a cerca de 30 min. Curar o PDMS no prato a 90 ° C durante pelo menos 1,5 h. O tempo ea temperatura pode ser ajustada como ditado pelas orientações de fabrico para se obter uma cura completa.
      4. Uma vez que o PDMS tem curado, cortar os PDMS em todo o wafer com uma lâmina de barbear e solte cuidadosamente o wafer PDMS-cobertos do prato. Remover o excesso de PDMS e por baixo da bolacha lentamente casca PDMS de distância da parte superior da bolacha.
      5. Coloque recurso do lado do disco PDMS-se em um prato limpo e armazenar o wafer longe da luz após o uso.
      6. Cortar o excesso de PDMS em torno dos padrões usando uma lâmina de barbear. Dispositivos de corte em forma rectangular (Figura 1C) para facilitar a casca de dispositivo a partir de substratos em etapas posteriores. Cortes precisos não são necessários, desde que existe um amplo espaço para a entrada, de saída e a área de padrão de tecido (Figura 1C).
      7. Socoorifícios de entrada e de saída (Figura 1C), utilizando de 1 mm biópsia cirúrgica perfurador.
  2. Deposição de dispositivos microfluídicos
    Nota: Neste protocolo, a entrega de microfluidos é utilizado para depositar modelado genipina, o agente de reticulação chave para a cultura de tecido a longo prazo, bem como a fibronectina. Passos anteriores à esterilização penicilina / estreptomicina (2.2.3) não precisa ter lugar em condições estéreis, mas limitando coleção contaminação e poeira é incentivada ao longo do protocolo. Todos os passos que ocorrem após a esterilização lamela com penicilina / estreptomicina (2.2.3) deve utilizar uma técnica estéril. Nota: Esta parte do protocolo deve ser iniciado um dia antes da sementeira celular.
    1. Substrato e microfluídicos dispositivo de preparação
      1. Sonicar os microcanais em etanol a 70% durante pelo menos 30 min.
      2. Secar os dispositivos microfluídicos sonicadas usando ar comprimido ou nitrogênio, e colocá-los em uma placa de Petri with canal possui a face para cima para evitar o desgaste desnecessário sobre os recursos.
      3. Coloque até 10 vMTF lamelas de substrato em um aspirador de UVO (tampa removida no prato assim que a superfície é funcionalizado) para 8 min.
      4. Retirar as lamelas tratados com UVO, e coloque o recurso do lado dispositivos microfluídicos para baixo em cada deslizamento um de cada vez (orientação deve ser semelhante à Figura 1C). Pressione firmemente os dispositivos para garantir um selo apertado para as lamelas PDMS-revestidos.
    2. Deposição de genipina e Fibronectina
      1. Prepara-se uma solução / genipina ml 5 mg por adição de 1 ml de ddH 2 O esterilizada para um recipiente de 5 mg de genipina liofilizada. Misturar a solução com um vortex-mixer. Pôr de lado à temperatura ambiente durante pelo menos 30 min.
        Nota: O pó é difícil de solubilizar à TA, a mistura de modo repetitivo, durante pelo menos um minuto é muitas vezes necessário.
      2. Rapidamente, colocar uma gota de etanol a 70% na entrada de cada dispositivo para dispositivo de escorvamento. Nota: O ethanol deve pavio através dos dispositivos.
      3. Após 5-10 minutos, aspirar cuidadosamente o excesso de etanol na entrada, imediatamente substituindo-o com solução salina tamponada com fosfato 1X (PBS) na entrada. Deste ponto em diante, certifique-se de não permitir a entrada para tornar-se completamente seca para evitar a introdução de ar para o dispositivo.
      4. Inserir uma ponta do aspirador de vácuo na saída de cada dispositivo. Desenhar 1X PBS por meio de dispositivos para enxaguar etanol distância. Deixar uma pequena quantidade de PBS 1X na entrada. Nota: Se entrada aparece quase seca, adicione mais 1X PBS.
      5. Aspirar o excesso de 1X PBS, de forma que apenas uma pequena quantidade permanece à entrada do tubo, antes da aplicação da solução de genipina.
      6. Colocar 60 ul da solução / genipina ml 5 mg em cada entrada (Figura 1D). Desenhar a solução genipina através dos dispositivos de colocação de um aspirador de vácuo a ponta da tomada (Figura 1D). Certifique-se para não chamar toda a solução através, deixando uma pequena quantidade de solução na entrada.
      7. Local gotas (cerca de dime-size) de 1X PBS, tanto a entrada e a saída para manter molhante durante a incubação. Mover o prato que contém dispositivos para um forno ou incubadora humidificada (ambiente estéril não é necessário) definido como 37 ° C e incubar durante 4 horas. O prato não tem de ser coberto.
      8. Durante a incubação, ressuspender fibronectina a uma concentração de 50 ug / ml em ddH2O estéril em gelo durante pelo menos 30 minutos antes da aplicação para o dispositivo de microfluidos.
      9. Após a incubação de genipina, Aspirar todo o restante 1X PBS nas saídas do dispositivo. Continuar para aplicar um aspirador a vácuo em cada dispositivo de saída, por meio de puxar o restante 1X PBS na entrada.
      10. Coloque 100 ml de / 50 ml de solução de fibronectina ug em cada entrada, a adição de uma quantidade mínima de permanecer 1X PBS a entrada (Figura 1D).
      11. Desenhar a solução de fibronectina pelos dispositivos que utilizam uma ponta do aspirador de vácuo na saída (
      12. Mover o prato descoberto que contém os dispositivos para um forno ou incubadora ajustada a 37 ° C, e incuba-se durante 24 h. Nota: O passo de fibronectina não requer humedecimento da entrada e saída com 1X PBS. A piscina restante de fibronectina na entrada vai secar. Isso é esperado.
    3. Esterilização e Preparação para Sementeira celular
      1. Prepara-se uma solução de penicilina / estreptomicina para a esterilização de lamelas vMTF modelado. Adicionar 5 ml de penicilina / estreptomicina (10000 unidades / ml; 10.000 ug / ml) em 500 ml de 1X PBS estéril.
      2. Coloque o prato contendo os dispositivos em uma capa de biossegurança estéril.
      3. Remova cuidadosamente os dispositivos das lamelas por descascar lentamente o dispositivo em um canto, enquanto segurando levemente a lamela na mão oposta.Nota: Esta etapa requer prática para reduzir os danos lamela no processo de remoção. Uma alternativa é utilizar uma seringa para injectar 1X PBS na entrada e / ou saída para ajudar na libertação do dispositivo.
      4. Coloque as lamelas em placas de seis poços estéreis. Adicionar, pelo menos, 5 ml de solução de penicilina / estreptomicina a cada poço. Colocar as cápsulas numa incubadora esterilizada, a 37 ° C durante pelo menos 30 min.
      5. Após a esterilização, aspirar a solução de penicilina / estreptomicina e semear as lamelas com cultura humana artéria umbilical vascular cells19 músculo liso (Figura 1D). A concentração para a semeadura é VSMCs de ~ 80.000 células por cm2. Para reduzir o número de células necessárias para cada amostra, utilizar um redutor para diminuir a área da sementeira. Um exemplo de um redutor é o corte superior de um tubo cónico de 15 ml ligado a lamela com graxa de vácuo estéril antes da semeadura.
      6. Incubar as lamelas inoculadas numa incubadora esterilizada, a 37 ° C e 5% de CO 2 (Figura 2A-B).
    4. Longo prazo Cultura de Tecidos vMTF
      1. Um dia após a semeadura, remova o meio celular e redutores. Lavar os tecidos com 1X PBS. Adicione 4 ml de meio de células isento de soro para induzir um fenótipo contrátil no VSMCs 20.
      2. Repetir a lavagem 1X PBS e adição de meio isento de soro fresco a cada dois dias, como desejado para a cultura a longo prazo.

Figura 1
Figura 1. Dispositivo Microfluidic Protein Delivery. (A) Gravado fora lamela para o revestimento PIPAAm. Círculo vermelho pontilhada: cortando caminho para a libertação lamela (B) Representante desenho AutoCAD de tecido padrão de máscara microfluídico.. Detalhe: Detalhe de ramificação binário para AlternAting 10 um x 10 um padrão de tecido. (C) A colocação de dispositivo de microfluidos sobre um substrato lamela com entrada e saída indicado. (D) Esquema de modelação de proteínas de microfluidos e entrega. Imagem microscópio eletrônico de varredura de canais microfluídicos (barra de escala:: 50 mm) da esquerda para a direita; Esquemática detalhada do método para deposição de proteína; Imunohistoquímica fibronectina manchado (barra de escala: 50 mm); Sementeira celular com células do músculo liso vascular. (E) Esquema de tecido fabricado. 1º inserir: Detalhe de construção em camadas. 2º inserir: Detalhe de modificação genipina de substrato PDMS após a deposição de microfluidos. © IOP Publishing. Reproduzidos e / ou modificado com permissão. Todos os direitos reservados. 19 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Tissue Análise de função com vMTF Contractilidade Assay

Nota: O ensaio MTF contratilidade apresentado aqui é modelado após a técnica desenvolvida em Grosberg et al 8.

  1. vMTF Contractilidade Experiment
    1. Colocar uma amostra de tecido em um placa de 100 mm. Adicionar solution8 de estéril 1X Tyrode a pH 7,4 aqueceu-se a 37 ° C para cobrir a amostra.
    2. Usar uma lâmina de barbear para fazer vários cortes paralelos perpendiculares à aresta PIPAAm. Faça cortes de uma maneira que produz cortes de tecido mais amplos que serão o vMTFs (com largura ~ 2 mm) alternando com tiras finas (Figura 3A, cortes laterais). Para fazer cortes limpos, colocar uma lâmina de barbear em contacto com a amostra e firmemente arraste para o lado.
    3. Rodar o prato 90 ° e faz dois cortes direitos, paralelos no meio do tecido, paralela à tira de PIPAAm (Figura 3A, cortes finais). Remova e elimine a tira de tecido solto entre estes cortes e as tiras finas no meio vMTFs (corte na etapa anterior) para impedir filmes adjacentes de fazer contato.
    4. Deixar a amostra em repouso à temperatura ambiente durante 10 minutos, ou até que todo o PIPAAm tenha dissolvido. Nota: Se PIPAAm permanece nos passos futuros, a amostra pode ser devolvida para o prato de corte para dissolver PIPAAm residual. Um raspagem suave da parte inferior do vMTF pode ajudar na remoção PIPAAm, conforme necessário.
    5. Coloque um pequeno ponto de graxa de vácuo em um ambiente limpo 35 milímetros placa de Petri. Adicionar 5 ml de solução fresca, estéril 1X de Tyrode a 37 ° C. Transfira a lamela com corte filmes da placa de 100 mm a de 35 mm prato e pressione para graxa de vácuo para evitar o movimento da lamela.
    6. Colocar a cápsula em uma plataforma com temperatura controlada na fase estereomicroscópio.
    7. Captura de lapso de tempo transmitidos e imagens fluorescentes em intervalos desejados (por exemplo., 30 seg) durante todo ensaio de tratamento.
    8. Serialmente tratar vMTFs com 50 nM de endotelina-1 durante 20 min (contracção induzida) e 100 pM HA-1077 durante 30 minutos (relaxamento do tecido). Adicionar soluções concentradas de cada tratamento para o prato experimental contendo 5 ml de solução de Tyrode estéril 1X em pontos de tempo específicos, dando origem a concentração de tratamento desejado no volume de 5 ml. Fazer adições de tratamento durante o intervalo entre as aquisições de imagens de lapso de tempo para evitar a captura de pipeta nas imagens.
  2. vMTF Análise Contractilidade
    1. Usando lamelas retiradas, a 1.4.8, medir a espessura substrato PDMS com uma profilometer21. Criar uma espessura vs. curva do tempo de centrifugação para cada conjunto de lamelas. Esta curva é utilizada para calcular a espessura da vMTF para cada lamela utilizada numa experiência de contractilidade.
    2. Medir o comprimento de projecção vMTF para cada ponto de tempo durante a experiência e calcular os raios de curvatura associado (Figura 3B), utilizando métodos anteriormente relatados 8.
    3. Calcule vMTF estresse em cada po tempoint usando métodos vMTF anteriores 5.
      Nota: Utilize a espessura vMTF estimativa calculada a partir de 3.2.1. Medir a espessura VSMC usando imagens confocal, como relatado previamente 9. Obter o módulo de PDMS Jovem de fichas de dados da empresa.

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Representative Results

O principal objetivo deste trabalho foi estender a viabilidade de VSMCs micropatterned em substratos PDMS hidrofóbicas. Isto foi conseguido por incorporação de um sistema de entrega de microfluidos para depositar modelado genipina e fibronectina em PDMS (Figura 1). Deposição de proteínas ECM usando entrega microfluídico rendeu transferência de alta fidelidade do padrão de canal com PDMS descalços entre as linhas de genipina e fibronectina (Figura 1D). As células ligadas (Figura 1E) monocamadas confluentes forma que imitam a estrutura in vivo de lamelas arterial (Figura 2), semelhantes a métodos de impressão microcontact anterior 5,10,16. Estes tecidos responsivos, produziu construções contrácteis, cuja tensão foi medida utilizando tecnologia vMTF (Figura 3).

Avaliação qualitativa de viabilidade do tecido ao longo de duas semanas mostraram deterioração mínima em genipina-modifisubstratos ED (Figura 2A). Confluência tecido e alinhamento foram mantidas ao longo de duas semanas (Figura 2B, 2C e 2D). Dois valores de chave de stress foram calculados para cada vMTF:. 1) tónus basal e 2) contractilidade induzida (Figura 3C e 3D) tónus basal é a tensão mantida por VSMCs não estimuladas em equilíbrio. Contractilidade induzido é a stress adicional induzida por estimulação com a endotelina-1. Ambos tom basal e contratilidade induzida mostrou um comportamento consistente ao longo do tempo de duas semanas, demonstrando tecidos vasoativas todo (Figura 3E e 3F). A pequena queda na contractilidade do tecido no final do ensaio é o resultado directo da redução do número de células que compõem o tecido, uma vez que as VSMCs privadas de soro não proliferam 19. A adição de um nível basal mínima de soro ao meio de cultura pode aliviar este resultado em trabalhos futuros.

Figura 2. Os tecidos permanecer viável e com sucesso Mimic in vivo Arterial Estrutura lamelar por duas semanas em substratos genipina modificados (A) representativos imagens de contraste de fase de tecidos em momentos de sacrifício ao longo do curso de duas semanas (barra de escala: 200 m).. (B) imagens de imunohistoquímica representativos de tecidos fabricados em substratos modificados com genipina fixos no Dia 1, Dia 4 e Dia 10 após privação de soro (verde: f-actina filamentos, azuis: núcleos (mostrado para estabelecer presença de células), barra de escala .: 100 mm) (C) confluência por cento medido por f-actina cobertura (barras de erro: erro padrão, n = 3-7) (D) de alinhamento do tecido medida pelo parâmetro de ordem orientação f-actina (OOP) 22 (barras de erro. : erro padrão, n = 3-7). © IOP Publishing. Reproduzidos e / ou modificado com permissão. Todos os direitos reservados. Todos os direitos reservados. 19 Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Tissue Contractilidade é mantido ao longo de duas semanas. (A) Esquema representativo vMTF de corte. (B) Esquema de corte vMTF. Após arrefecimento abaixo de 32 ° C, dissolve-se PIPAAm, libertando vMTF. Tensão na camada de células faz com que a camada activa de PDMS passiva para dobrar. Medição do comprimento de projecção pode ser convertido a um raio de curvatura de acordo com métodos em Grosberg et al. 8 Raio de curvatura é usado para calcular a tensão de corte transversal média no tecido. (C) Lig sequencial transmitidoht imagens de ensaio contratilidade representante (barra de escala: 1 milímetro). Os tecidos atingir o equilíbrio, são estimuladas com depois tratado com HA-1077 da endotelina-1, para permitir um relaxamento completo. Parte inferior:. Esquemática da vista lateral do tecido idealizada durante o curso do ensaio (D) curva de tensão representativas para o ensaio de contractilidade. Dois valores de chave de stress são calculados. Tônus basal é a diferença entre o estado de tensão e equilíbrio o estado de tensão relaxada. Contractilidade induzido é a alteração na tensão do estado de equilíbrio para o estado de endotelina-1 estimuladas (E) tónus basal (barras de erro: desvio padrão, n = 5 - 12) (F) contractilidade Induzida (barras de erro:.. Erro padrão, n = 5 - 12). © IOP Publishing. Reproduzidos e / ou modificado com permissão. Todos os direitos reservados. 19 Por favor, clique aqui para ver uma versão maioreste valor.

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Discussion

Aqui, apresentamos um protocolo que se baseia em tecnologia vMTF anteriormente desenvolvido, permitindo tempos de experiência estendidas mais típico dos caminhos da doença vasculares crônicas 1,23,24. Para conseguir isso, micropadrão genipina, que tem sido mostrado previamente para fornecer funcionalização de longo prazo de PDMS substratos 11, usando uma técnica de deposição de microfluidos para se obter lamelas arterial concebido com melhoria da viabilidade do tecido vascular para uso em experiências de contractilidade MTF. McCain et ai. desenvolveu um substrato alternativo de hidrogel de gelatina micromolded para a cultura alargada de tecidos cardíacos projetados para várias semanas em um modelo MTF relacionada 25.

Este protocolo produziu vMTFs que imitavam com sucesso lamela arterial (Figura 2) e função (Figura 3) ao longo de duas semanas. Embora a conclusão bem sucedida do protocolo apresentado produz os res desejadosult vezes estendidas para cultura relevante doença curso de tempo (por exemplo, os efeitos patológicos de vasoespasmo cerebral que persiste por até 14 dias 26), surgem algumas armadilhas comuns. O uso repetido de PDMS microcanais resulta em danos prejudiciais que pode resultar em bloqueio parcial ou completo de ramos no dispositivo. Assim, novos dispositivos devem ser utilizados para cada experiência. Outra questão, embora não tão comum, é delaminação inesperado e inconsistente dos tecidos. Estas ocorrências parecia ser de natureza aleatória e rara na ocorrência. Pela observação, tecidos formar uma estrutura Arce- ou lúmen-like antes de delaminação. Também observamos esse comportamento em tecidos fabricados usando técnicas de impressão microcontact. Assim, acreditamos que esta questão é o resultado de tanto sobre-semeadura ou um interruptor fenotípica nos VSMCs cultivadas que resulta em comportamento anormal e não um resultado direto dos métodos de fabricação aqui apresentados.

O MICROFLUID atualic design requer padrões de fluxo lineares e, como tal, está limitado a tecidos com alinhamento numa única direcção principal. Aplicação para os tecidos que exigem padrões mais complexos, como o padrão da estrutura do miocárdio ventricular 27 "parede de tijolos", vai exigir mais elaborado projeto microfluídico. Nós não semeadas substratos modificados com genipina com outros tipos de células. No entanto, Genchi et ai. mostrou estendida viabilidade do músculo esquelético isotrópico em modificado genipina PDMS-11. Assim, nos sentimos confiantes de que uma versão modificada-minimamente deste protocolo tem aplicabilidade generalizada para outros sistemas de órgãos no desenvolvimento futuro das tecnologias de órgãos-on-a-chip.

O método de cálculo do stress para vMTFs com base em métodos anteriores 8 é limitada pela contractilidade relativa nos tecidos e comprimento de corte correspondente dos filmes finos. Se cortar demasiado longo, filmes vai enrolar em si mesmos. Se cortado muito curto, filmes não seránd. Ambos os casos impede uma análise adequada das propriedades contráteis devido a modelar limitações. Comprimento adequado corte deve ser refinado através de experiências repetidas. Implementação de um sistema de gravação a laser, como no Agarwal et al., Pode melhorar a repetibilidade ea qualidade dos MTF corte 28.

A capacidade de melhor recapitular estrutura nativa e função do tecido em um sistema experimental auto-contida controlada de modo estanque é uma chave de busca no campo de bioengenharia. Este exercício tem levado ao desenvolvimento de vários tecidos in vitro imita e multi-funcionais, modelo órgãos-on-a-chip ainda simplificado, facilitar o entendimento da fisiológico fundamental e comportamentos patológicos de sistemas de órgãos 29,30. Utilizando deposição de genipina sobre substratos de PDMS, que demonstraram a viabilidade celular prolongada e manutenção da função do músculo liso dos vasos sanguíneos ao longo de duas semanas. Esta é uma melhoria significativa sobre tecnol fabricação anterioriques, que pode levar à delaminação de tecidos e morte celular após 4-7 dias em cultura 19, e podem auxiliar o desenvolvimento de métodos de artéria-on-a-chip mais robusto. Devido à natureza crônica da maioria das doenças vasculares, este avanço fornece o quadro para uma variedade de futuras investigações sobre os mecanismos envolvidos na contráteis patologias vasculares específicas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip staining rack Electron Microscopy Sciences www.emsdiasum.com/ 72239-04
Microscope cover glass - 25 mm Fisher Scientific, Inc. www.fishersci.com 12-545-102
Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ #21458
1-butanol Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com 360465
Spincoater Specialty Coating Systems, Inc. www.scscoatings.com
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives (Dow Corning) www.ellsworth.com 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Fluorescent microbeads Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ 17151
Silicon wafers Wafer World, Inc. www.waferworld.com 2398
Photoresist  MicroChem Corp. www.microchem.com
Contact mask aligner Suss MicroTec www.suss.com
Developer MicroChem Corp. www.microchem.com
Tridecafluro-trichlorosilane UCT Specialties, Inc. www.unitedchem.com T2492
Surgical biopsy punch Integra LifeSciences Corp. www.miltex.com 33-31AA-P/25
Genipin Cayman Chemical www.caymanchem.com 10010622
1X phosphate buffered saline Mediatech, Inc. www.cellgro.com 21-031-CV
Fibronectin Corning, Inc. www.corning.com 356008
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com 15140-122
Umbillical artery smooth muscle cells Lonza www.lonza.com CC-2579
Tyrode's solution components Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com various
Stereomicroscope Zeiss www.zeiss.com 4350020000000000
Temperature-controlled platform Warner Instruments www.warneronline.com 641659; 640352; 641922
Endothelin-1 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com E7764-50UG
HA-1077 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com H139-10MG

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References

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Técnica microfluídico genipina Deposição de Cultura Extensão da micropatterned vasculares musculares Filmes Finos
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