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Bioengineering

Micropatterned संवहनी पेशी पतली फिल्मों की विस्तारित संस्कृति के लिए microfluidic Genipin बयान तकनीक

Published: June 26, 2015 doi: 10.3791/52971
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota

Introduction

इस तरह के मस्तिष्क vasospasm 1,2, उच्च रक्तचाप 3, और atherosclerosis 4, के रूप में वाहिका रोगों, धीरे-धीरे विकसित प्रकृति में आम तौर पर पुरानी हैं, और संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (VSMCs) द्वारा बेकार बल पीढ़ी को शामिल करना। हम में इन विवो मॉडल की तुलना में प्रयोगात्मक शर्तों के बेहतर नियंत्रण के साथ इन विट्रो तरीकों में उपयोग करते हुए इन धीमी गति से प्रगति कर संवहनी रोग का अध्ययन करना है। इन विट्रो के कार्यात्मक सिकुड़ना को मापने के लिए हम पहले से विकसित किया है संवहनी पेशी पतली फिल्मों (vMTFs) हृदय के ऊतकों 5 इंजीनियर, लेकिन इस विधि अपेक्षाकृत कम अवधि के अध्ययन तक ही सीमित कर दिया गया है। यहाँ, हम लंबी अवधि के मापन के लिए हमारे पिछले vMTF तकनीक फैलता है कि एक सब्सट्रेट संशोधन तकनीक मौजूद है।

अन्तःचूचुक समग्र नाड़ी समारोह में भी महत्वपूर्ण है, इंजीनियर धमनी लामेल्ले नाड़ी में परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रणाली प्रदानरोग प्रगति दौरान सिकुड़ना। एक कार्यात्मक रोग ऊतक मॉडल, संरचना और धमनी लामेल्ला के समारोह में दोनों इंजीनियर को, जहाज के बुनियादी सिकुड़ा इकाई, उच्च निष्ठा के साथ recapitulated किया जाना चाहिए। धमनी लामेल्ले 6 elastin के पत्रक द्वारा अलग सिकुड़ा VSMCs का गाढ़ा, circumferentially गठबंधन चादरें हैं। Polydimethylsiloxane (PDMS) substrates पर बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन की microcontact मुद्रण पहले से हृदय के ऊतकों 5,7-10 गठबंधन की नकल करने के ऊतक संगठन के लिए मार्गदर्शन cues प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, ऊतकों पुरानी पढ़ाई में उनके प्रयोज्यता सीमित संस्कृति में 3-4 दिनों के बाद अखंडता खो सकते हैं microcontact मुद्रण का उपयोग कर नमूनों। इस प्रोटोकॉल एक नया microfluidic के बयान तकनीक के साथ पिछले microcontact मुद्रण तकनीक की जगह से इस मुद्दे का समाधान प्रदान करता है।

Genipin और च के साथ Genchi एट अल। संशोधित PDMS substrates केound संस्कृति 11 में एक महीने के लिए myocytes की व्यवहार्यता अप लंबे समय तक। यहाँ, हम PDMS पर नमूनों संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की संस्कृति का विस्तार करने के लिए एक समान दृष्टिकोण का उपयोग करें। Genipin, गार्डेनिया फल का एक प्राकृतिक hydrolytic व्युत्पन्न, इसी तरह crosslinking एजेंट और ऊतकों की मरम्मत 12,13 और ईसीएम संशोधन 14 के क्षेत्र में एक biomaterial के रूप में इसके बढ़ते उपयोग की तुलना में इसकी वजह से अपेक्षाकृत कम विषाक्तता के लिए सब्सट्रेट संशोधन के लिए एक वांछनीय उम्मीदवार है 15। इस प्रोटोकॉल में, फ़ाइब्रोनेक्टिन पिछले microcontact मुद्रण विधियों के रूप में, एक सेल मार्गदर्शन के संकेत के रूप में उपयोग किया जाता है; हालांकि, genipin फ़ाइब्रोनेक्टिन patterning के लिए पूर्व PDMS substrates पर जमा किया जाता है। कोशिकाओं के नमूनों मैट्रिक्स नीचा के रूप में इस प्रकार, संलग्न VSMCs से नए संश्लेषित ईसीएम genipin लेपित PDMS सब्सट्रेट करने के लिए बाध्य कर सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल दो कदम genipin और ईसीएम बयान के लिए एक microfluidic वितरण डिवाइस का इस्तेमाल करता है। microfluidic युक्ति mimics microco के डिजाइनपिछले अध्ययनों में 16 इंजीनियर धमनी lamellae के लिए इस्तेमाल किया ntact मुद्रण पैटर्न। इस प्रकार, हम इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक विवो संरचना और धमनी lamellae के सिकुड़ा समारोह में अत्यधिक गठबंधन पुनरावृत्ति कि धमनी लामेल्ले mimics उपज की उम्मीद है। हम यह भी है कि genipin इन विट्रो रोग मॉडल में लंबी अवधि के लिए एक उपयुक्त सब्सट्रेट संशोधन यौगिक है पुष्टि करने के लिए ऊतक सिकुड़ना का मूल्यांकन।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य का निर्माण और PDMS substrates पर संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (VSMCs) की विस्तारित संस्कृति के दौरान सिकुड़ना का आकलन करने के लिए चित्र 1 में दिखाया संरचना के साथ एक नाड़ी पेशी पतली फिल्म (vMTF) का उपयोग करने के लिए है। VSMC व्यवहार्यता को लम्बा खींच करने के लिए, हम crosslinker यौगिक genipin का उपयोग। Grosberg एट अल। 8 अन्य vMTF विधियों 5 भी प्रस्तुत सब्सट्रेट निर्माण प्रोटोकॉल के लिए सूक्ष्म परिवर्तनों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता द्वारा विकसित रूप में इन vMTFs substrates के लिए ऊतक सिकुड़ना का विश्लेषण करने के लिए तैयार कर रहे हैं।

1. सब्सट्रेट निर्माण

  1. Coverslip सफाई
    1. एक coverslip धुंधला रैक में 25 मिमी व्यास कांच coverslips रखें। एक बड़े बीकर या कंटेनर में रैक रखें (उदाहरण के लिए, एक खाली - 100। 1,000 μl pipet टिप कंटेनर)।
    2. पूरी तरह से coverslips के विसर्जित करने के लिए कंटेनर के लिए 70% इथेनॉल जोड़ें। कम से कम 30 मिनट के लिए उन्हें Sonicate। </ ली>
    3. इथेनॉल समाधान से coverslip के रैक निकालें। 1- 2 घंटे के लिए (coverslips पर कण संचय रोकने के लिए) एक बाँझ संस्कृति हुड में रैक फांसी से शुष्क हवा की coverslips के लिए अनुमति दें।
      नोट: coverslips के पूर्व निम्नलिखित कदम को पूरी तरह से सूखा होना चाहिए।
  2. Coverslip पर पाली (एन आईएसओ propylacrylamide) (PIPAAm) पट्टी अलगाव
    1. Coverslip (चित्रा 1 ए) पर केंद्रित एक उजागर पट्टी छोड़ रहा है, एक साफ coverslip के किनारों से चिपकने वाला टेप, टेप का उपयोग करना। आवेदन और / या microfluidic डिजाइन पर आधारित इस अवगत कराया पट्टी की चौड़ाई को संशोधित करें।
    2. मार्क बाद में संदर्भ (चित्रा 1 ए) के लिए एक प्रयोगशाला मार्कर का उपयोग coverslip पर टेप स्ट्रिप्स के किनारों।
    3. पकवान (चित्रा 1 ए, डॉटेड लाल रेखा) से जारी करने के लिए coverslip की परिधि के आसपास काट दिया।
  3. पाली (एन आईएसओ propylacrylamide) (PIPAAm) कोटिंग
    1. एक विश्लेषणात्मक संतुलन का प्रयोग, गड़बड़ी की 1 ग्राम का वजनPAAm पाउडर। एक कैसरजन जो unpolymerized एन आईएसओ propylacrylamide, का प्रयोग न करें।
    2. एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब PIPAAm स्थानांतरण। एक 10% W / वी समाधान उपज के लिए एक रासायनिक हुड के अंदर 1-butanol के 10 मिलीलीटर जोड़ें। चेतावनी: 1-butanol के फ़्लैश बिंदु 37 ओ सी है एक ज्वलनशील कैबिनेट में जिसके परिणामस्वरूप समाधान स्टोर और हीटिंग से बचें।
    3. PIPAAm 10 मिनट के लिए भंग करने की अनुमति दें। पाउडर अभी भी दिखाई दे रहा है, तो सभी पाउडर घुल जब तक एक भंवर-मिक्सर का उपयोग कर समाधान मिश्रण।
      नोट: निम्न चरणों का एक स्पिन coater के उपयोग की आवश्यकता है। प्रत्येक coverslip के लिए:
    4. संदंश के साथ स्पिन coater चक पर टेप coverslip जगह।
    5. Coverslip के केंद्र में उजागर गिलास के साथ बूंदों रखकर coverslip पर PIPAAm समाधान के 150 μl स्थानांतरण। उजागर क्षेत्र की पूरी कवरेज सुनिश्चित करें।
    6. स्पिन कोट PIPAAm निम्नलिखित नुस्खा का उपयोग:
      1. 3,000 rpm के लिए 10 सेकंड रैंप। 5 सेकंड के लिए ध्यान केन्द्रित।
      2. रैंप पर 10 सेकंड के लिए 6,000 RPM। 60 सेकंड के लिए ध्यान केन्द्रित।
      3. 3,000 rpm के लिए 10 सेकंड रैंप। 5 सेकंड के लिए ध्यान केन्द्रित।
    7. सामना करना पड़ रहा PIPAAm के साथ एक कवर पेट्री डिश में coverslip जगह। कम से कम 15 मिनट के लिए शुष्क हवा की अनुमति दें।
    8. ध्यान से एक केंद्र पट्टी में PIPAAm कोटिंग की एक पतली परत के साथ उजागर पूर्ण coverslip छोड़ रहा है, सभी coverslips से चिपकने वाला टेप निकालें।
  4. PDMS कोटिंग
    1. मिक्स और एक 10 में PDMS की 15 ग्राम देगास: 1 आधार: crosslinker अनुपात। पूर्व मिश्रण करने के लिए sonicated 0.2 माइक्रोन फ्लोरोसेंट microbeads की 8 बूँदें - 7 जोड़ें। PDMS contaminating से धूल और अन्य कणों को रोकने के लिए जब उपयोग में नहीं एल्यूमीनियम पन्नी के साथ PDMS के कप को कवर किया।
      नोट: निम्न चरणों का एक स्पिन coater के उपयोग की आवश्यकता है। प्रत्येक coverslip के लिए:
    2. संदंश के साथ स्पिन coater चक पर एक PIPAAm लेपित coverslip रखें।
    3. Coverslip के क्षेत्र के कम से कम एक-तिहाई को कवर coverslip पर PDMS स्थानांतरण।
    4. निम्नलिखित recip का उपयोग कर स्पिन कोटई:
      1. 500 rpm के लिए 5 सेकंड रैंप। 5 सेकंड ध्यान केन्द्रित करना।
      2. 1,000 rpm के लिए 5 सेकंड रैंप। 5 सेकंड ध्यान केन्द्रित करना।
      3. 3,000 rpm के लिए 10 सेकंड रैंप। 10 सेकंड ध्यान केन्द्रित करना।
      4. 4000 rpm के लिए 10 सेकंड रैंप। 60 सेकंड ध्यान केन्द्रित करना।
      5. 2,000 rpm के लिए 10 सेकंड रैंप। 15 सेकंड ध्यान केन्द्रित करना।
      6. 1,000 rpm के लिए 10 सेकंड रैंप। 10 सेकंड ध्यान केन्द्रित करना।
      7. 500 rpm के लिए 5 सेकंड रैंप। 5 सेकंड ध्यान केन्द्रित करना।
    5. PDMS का सामना करना पड़ के साथ एक कवर पेट्री डिश में coverslip जगह। Coverslip के स्पिन लेपित किया गया था जब समय रिकॉर्ड। PDMS सब्सट्रेट मोटाई का पता लगाने में बाद में उपयोग के लिए प्रयोग भर में प्रत्येक coverslip के साथ जुड़े समय का ध्यान रखें।
    6. उचित PDMS इलाज सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 1.5 घंटे के लिए एक 90 डिग्री सेल्सियस ओवन में coverslips युक्त पेट्री डिश में रखें। एक ओवन उपलब्ध नहीं है, तो coverslips के आरटी पर कम से कम 48 घंटे के लिए इलाज करते हैं।
    7. ओवन से coverslips निकालें और उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक एक अंधेरे दराज में उन्हें दुकान।
    8. हर चौथे coverslip के च अलग निर्धारित करेंया एक profilometer साथ स्पिन कोटिंग समय के एक समारोह के रूप में सब्सट्रेट मोटाई के बाद के माप,।

इंजीनियरिंग ऊतकों के लिए 2. Microfluidic patterning

  1. Microfluidic उपकरणों का निर्माण
    1. ऊतक Microfluidic Photomask का डिजाइन
      1. Microfluidic पैटर्न डिजाइन करने के लिए कोई भी उचित कंप्यूटर एडेड डिजाइन कार्यक्रम का उपयोग करें। मानव गर्भनाल धमनी संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं से बना धमनी lamellae के लिए, 10 माइक्रोन की दीवारों के साथ 10 माइक्रोन चैनलों की एक बारी पैटर्न का उपयोग करें।
      2. संभव 17 अगर शाखाओं में बंटी बाइनरी चैनल का उपयोग करें, लेकिन अन्य शाखाओं में बंटी डिजाइन में इस्तेमाल किया जा सकता है। (दीवारों और चैनलों, चित्रा 1 बी) में अंतर रखने वांछित ऊतक पैटर्न को प्राप्त करने तक प्रत्येक शाखाओं में चलना के लिए चैनलों की चौड़ाई और लंबाई कम।
      3. सतह के उपचार के समाधान नियुक्ति और वैक्यूम के आवेदन के लिए एक भी दुकान के लिए एक एकल प्रवेश पास करने के लिए डिवाइस डिजाइन।
      4. फैबपहले से 18 में वर्णित के रूप में, microfluidic डिजाइन (एस) से युक्त एक photomask ricate।
    2. Photolithographic निर्माण मे
      ध्यान दें: एक उपयुक्त cleanroom या इसी तरह की सुविधा में photolithography प्रदर्शन करते हैं। ऊतक microfluidic उपकरणों (~ 20-25 माइक्रोन चैनल ऊंचाई) के नरम Lithographic निर्माण के लिए पैटर्न के साथ सिलिकॉन वेफर्स बनाने का उपयोग photolithography:
      1. 1 मिनट प्रत्येक के लिए एसीटोन, मेथनॉल, और isopropyl शराब में एक सिलिकॉन वेफर साफ करें। एक नाइट्रोजन बंदूक के साथ वेफर सूखी।
      2. अतिरिक्त नमी को दूर करने के लिए 115 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक गर्म थाली पर वेफर Prebake।
      3. : लंबाई में 25 माइक्रोन - स्पिन कोट उपज के लिए निम्नलिखित नुस्खा का उपयोग कर र -8 3025 photoresist के साथ वेफर 20 सुविधाएँ
        1. 500 rpm के लिए 5 सेकंड रैंप। 5 सेकंड ध्यान केन्द्रित करना।
        2. 4000 rpm के लिए 15 सेकंड रैंप। 15 सेकंड ध्यान केन्द्रित करना।
      4. शीतल सेंकना 15 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर वेफर।
      5. टी एक photomask लोड, और बेनकाबवह एक संपर्क मुखौटा aligner पर एक वैक्यूम संपर्क कार्यक्रम का उपयोग कर 16 सेकंड के लिए वफ़र।
      6. हार्ड 4 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली पर वेफर सेंकना।
      7. डेवलपर में 6 मिनट के लिए वेफर का विकास करना। फिर, ताजा डेवलपर में 2 सेकंड के लिए दो बार वेफर धोने और isopropyl शराब के साथ वेफर कुल्ला।
      8. एक निर्वात desiccator भीतर एक खाली थाली में tridecafluoro-trichlorosilane के 3 बूँदें - 2 रखकर नमूनों वेफर हे / एन Silanate। वेफर के नीचे और ऊपर दोनों उजागर कर रहे हैं इतना है कि पेट्री डिश का उपयोग कर वेफर सहारा।
        चेतावनी: Tridecafluro-trichlorosilane एक ज्वलनशील और संक्षारक तरल है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और स्थानीय निकास उपयोग के लिए आवश्यक है।
    3. ऊतक microfluidic युक्ति निर्माण
      1. एक पेट्री डिश में एक silanated, नमूनों वेफर सुविधा तरफ ऊपर रखें।
      2. मिक्स और एक 10 के साथ PDMS की 100 ग्राम देगास: 1 आधार: crosslinker अनुपात। पूरी तरह से और समान रूप से वेफर को कवर, डिश में PDMS डालो।
      3. सभी हवाई बुलबुले, uncured PDMS से लगभग 30 मिनट हटा रहे हैं जब तक एक निर्वात desiccator में पकवान रखें। कम से कम 1.5 घंटे के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर डिश में PDMS इलाज। पूरी तरह से इलाज प्राप्त करने के लिए निर्माण के दिशा निर्देशों द्वारा निर्देशित के रूप में समय और तापमान को समायोजित किया जा सकता है।
      4. PDMS के ठीक हो जाने के बाद, एक धार के साथ वेफर के आसपास PDMS के बाहर कटौती और ध्यान से पकवान से PDMS से ढके वेफर जारी। वेफर के नीचे अतिरिक्त PDMS निकालें और धीरे धीरे वेफर के ऊपर से दूर PDMS छील।
      5. एक साफ पकवान में PDMS डिस्क सुविधा तरफ ऊपर रखें और उपयोग के बाद प्रकाश से दूर वेफर की दुकान।
      6. एक रेजर ब्लेड का उपयोग पैटर्न चारों ओर से अतिरिक्त PDMS दूर काटें। आयताकार आकार (चित्रा 1C) में कट उपकरणों के बाद के चरणों में substrates से डिवाइस की छाल को कम करने के लिए। सटीक कटौती के रूप में लंबे समय पर्याप्त स्थान इनलेट, आउटलेट, और ऊतक पैटर्न क्षेत्र (चित्रा 1C) के लिए मौजूद है, के रूप में आवश्यक नहीं कर रहे हैं।
      7. एक प्रकार की मदिराएक 1 मिमी शल्य बायोप्सी पंच का उपयोग इनलेट और आउटलेट छेद (चित्रा 1C)।
  2. Microfluidic युक्ति जमाव
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, microfluidic वितरण नमूनों genipin, लंबी अवधि के ऊतक संवर्धन के लिए कुंजी crosslinking एजेंट, साथ ही फ़ाइब्रोनेक्टिन जमा करने के लिए प्रयोग किया जाता है। पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन नसबंदी (2.2.3) के लिए पहले कदम बाँझ परिस्थितियों में जगह लेने की जरूरत नहीं है, लेकिन सीमित प्रदूषण और धूल संग्रह प्रोटोकॉल भर में प्रोत्साहित किया जाता है। पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (2.2.3) के साथ coverslip नसबंदी के बाद होने वाली सभी कदम बाँझ तकनीक का उपयोग करना चाहिए। नोट: प्रोटोकॉल के इस भाग से पहले सेल बोने के लिए एक दिन में शुरू किया जाना चाहिए।
    1. सब्सट्रेट और microfluidic युक्ति तैयारी
      1. कम से कम 30 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में microfluidic उपकरणों Sonicate।
      2. दबाव हवा या नाइट्रोजन का उपयोग sonicated microfluidic उपकरणों सूखी, और एक पेट्री डिश वाई में उन्हें जगहवें चैनल सुविधाओं पर अनावश्यक पहनने को रोकने के चेहरे-अप की सुविधा है।
      3. 8 मिनट के लिए एक UVO क्लीनर (सतह क्रियाशील है तो कवर डिश पर हटाया) में 10 vMTF सब्सट्रेट coverslips के लिए ऊपर रखें।
      4. UVO इलाज coverslips निकालें, और एक बार में एक पर्ची एक पर नीचे microfluidic उपकरणों सुविधा साइड जगह (अभिविन्यास -1 सी चित्रा के समान होना चाहिए)। नीचे मजबूती से उपकरणों पर प्रेस PDMS लेपित coverslips के लिए एक तंग सील सुनिश्चित करने के लिए।
    2. Genipin और फ़ाइब्रोनेक्टिन का बयान
      1. Lyophilized genipin के 5 मिलीग्राम कंटेनर के लिए बाँझ DDH 2 ओ के 1 मिलीलीटर जोड़कर एक 5 मिलीग्राम / एमएल genipin समाधान तैयार है। एक भंवर-मिक्सर का उपयोग कर समाधान मिलाएं। कम से कम 30 मिनट के लिए आरटी पर अलग निर्धारित करें।
        नोट: पाउडर में कम से कम एक मिनट के लिए, आरटी पर इतना दोहराए मिश्रण solubilize मुश्किल है कि अक्सर आवश्यक है।
      2. जल्दी से, युक्ति भड़काना के लिए प्रत्येक डिवाइस के प्रवेश पर 70% इथेनॉल की एक बूंद जगह है। कोई दांत नहींanol उपकरणों के माध्यम से बाती चाहिए।
      3. 5 के बाद - 10 मिनट, ध्यान से तुरंत इनलेट पर 1X फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ की जगह, इनलेट पर अतिरिक्त इथेनॉल aspirate। इस बिंदु से आगे, इनलेट डिवाइस के लिए हवा की शुरूआत से बचने के लिए पूरी तरह से सूखा बनने के लिए अनुमति नहीं करना सुनिश्चित करें।
      4. प्रत्येक डिवाइस के आउटलेट पर एक निर्वात चूषित्र टिप रखें। इथेनॉल दूर कुल्ला करने के लिए उपकरणों के माध्यम से 1X पीबीएस ड्रा। इनलेट पर 1X पीबीएस की एक छोटी राशि के लिए छोड़ दें। नोट: इनलेट लगभग सूखा दिखाई देता है, और अधिक 1X पीबीएस जोड़ने।
      5. केवल एक छोटी राशि genipin समाधान के आवेदन करने से पहले प्रवेश पर बनी हुई है, ताकि अतिरिक्त 1X पीबीएस aspirate।
      6. प्रत्येक इनलेट (चित्रा -1) पर 5 मिलीग्राम / एमएल genipin समाधान के 60 μl रखें। आउटलेट (चित्रा -1) में एक निर्वात चूषित्र टिप रखकर उपकरणों के माध्यम से genipin समाधान ड्रा। इनलेट पर समाधान की एक छोटी राशि छोड़ रहा है, के माध्यम से समाधान के सभी आकर्षित करने के लिए नहीं भूलें।
      7. प्लेस (लगभग सिक्के के आकार के) 1X पीबीएस के इनलेट और ऊष्मायन के दौरान गीला बनाए रखने के लिए आउटलेट दोनों पर चला जाता है। 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक humidified ओवन या इनक्यूबेटर करने के लिए उपकरणों (बाँझ वातावरण आवश्यक नहीं है) युक्त पकवान ले जाएँ, और 4 घंटे के लिए सेते हैं। पकवान कवर करने की आवश्यकता नहीं है।
      8. ऊष्मायन के दौरान, पूर्व microfluidic युक्ति के लिए आवेदन करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए बर्फ पर बाँझ DDH 2 ओ में 50 माइक्रोग्राम / एमएल के एक एकाग्रता के लिए फ़ाइब्रोनेक्टिन resuspend।
      9. Genipin की ऊष्मायन के बाद, डिवाइस दुकानों पर सभी शेष 1X पीबीएस महाप्राण। इनलेट पर शेष 1X पीबीएस के माध्यम से खींच, प्रत्येक डिवाइस के आउटलेट पर एक निर्वात चूषित्र लागू करने के लिए आगे बढ़ें।
      10. इनलेट पर शेष 1X पीबीएस की एक न्यूनतम राशि (चित्रा -1) को जोड़ने, प्रत्येक प्रवेश पर 50 माइक्रोग्राम / एमएल फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान के 100 μl रखें।
      11. (आउटलेट पर एक निर्वात चूषित्र टिप का उपयोग उपकरणों के माध्यम से फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान ड्रा
      12. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक ओवन या इनक्यूबेटर करने के लिए उपकरणों से युक्त खुला पकवान ले जाएँ, और 24 घंटे के लिए सेते हैं। नोट: फ़ाइब्रोनेक्टिन कदम 1X पीबीएस के साथ प्रवेश और दुकान के गीला आवश्यकता नहीं है। इनलेट पर फ़ाइब्रोनेक्टिन के शेष पूल बाहर सूख जाएगा। यह आशा की जाती है।
    3. सेल बोने के लिए बंध्याकरण और तैयारी
      1. नमूनों vMTF coverslips के बंध्याकरण के लिए पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के समाधान तैयार है। बाँझ 1X पीबीएस के 500 मिलीलीटर, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 5 मिलीलीटर (10,000 माइक्रोग्राम / एमएल 10,000 इकाइयों / एमएल) जोड़ें।
      2. एक बाँझ जैव सुरक्षा हुड में उपकरणों से युक्त पकवान रखें।
      3. ध्यान से हल्के से सामने हाथ में coverslip लोभी, जबकि धीरे-धीरे, एक कोने में युक्ति छीलने द्वारा coverslips से उपकरणों को हटा दें।नोट: इस कदम को हटाने की प्रक्रिया में coverslip वाले नुकसान को कम करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता है। एक वैकल्पिक डिवाइस रिहाई में सहायता करने के लिए इनलेट और / या दुकान पर 1X पीबीएस इंजेक्षन करने के लिए एक सिरिंज का उपयोग कर रहा है।
      4. बाँझ छह अच्छी तरह से बर्तन में coverslips रखें। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के कम से कम 5 मिलीलीटर जोड़ें। कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक बाँझ इनक्यूबेटर में बर्तन रखें।
      5. नसबंदी के बाद, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान महाप्राण, और सुसंस्कृत मानव नाल धमनी संवहनी चिकनी पेशी cells19 (चित्रा -1) के साथ coverslips बीज। VSMCs के लिए बोने एकाग्रता ~ 2 सेमी प्रति 80,000 कोशिकाओं है। प्रत्येक नमूने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या को कम करने के लिए, बोने क्षेत्र कम करने के लिए एक reducer का उपयोग करें। एक reducer का एक उदाहरण से पहले बोने के लिए बाँझ वैक्यूम तेल के साथ coverslip से जुड़ी एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब की कटौती ऊपर है।
      6. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में एक बाँझ इनक्यूबेटर में वरीयता प्राप्त coverslips सेते (2A चित्रा-बी)।
    4. लंबे समय तक vMTF टिशू कल्चर
      1. एक दिन बोने के बाद, सेल मध्यम और reducers को हटा दें। 1X पीबीएस के साथ ऊतकों कुल्ला। VSMCs 20 में एक सिकुड़ा phenotype के लिए प्रेरित करने के लिए सीरम मुक्त सेल के माध्यम से 4 मिलीलीटर जोड़ें।
      2. लंबी अवधि संस्कृति के लिए वांछित के रूप में हर दूसरे दिन 1X पीबीएस कुल्ला और ताजा सीरम मुक्त माध्यम के अलावा दोहराएँ।

चित्र 1
1. Microfluidic प्रोटीन वितरण डिवाइस चित्रा। (ए) PIPAAm कोटिंग के लिए coverslip से टेप किया। लाल बिंदीदार सर्कल: coverslip के जारी करने के लिए पथ काटने (बी) के ऊतक microfluidic मुखौटा पैटर्न के प्रतिनिधि ऑटोकैड ड्राइंग।। इनसेट: द्विआधारी शाखाओं का विस्तार करने के लिए alternइनलेट और आउटलेट के साथ एक coverslip सब्सट्रेट पर microfluidic डिवाइस के 10 माइक्रोन एक्स 10 माइक्रोन ऊतक पैटर्न। (सी) प्लेसमेंट ating संकेत दिया। microfluidic प्रोटीन patterning और वितरण (डी) योजनाबद्ध। बाएं-से-सही: microfluidic चैनलों की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवि (पैमाने पर पट्टी: 50 माइक्रोन); प्रोटीन बयान के लिए विधि का विस्तृत योजनाबद्ध; Immunohistochemistry दाग फ़ाइब्रोनेक्टिन (पैमाने पर पट्टी: 50 माइक्रोन); संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ सेल बोने। गढ़े ऊतक (ई) योजनाबद्ध। 1 सेंट इनसेट: स्तरित निर्माण का विस्तार। 2 एन डी इनसेट: microfluidic के बयान के बाद PDMS सब्सट्रेट के genipin संशोधन का विस्तार। © IOP प्रकाशन। Reproduced और / या अनुमति के साथ संशोधित। सभी अधिकार सुरक्षित। 19 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

VMTF सिकुड़ना परख के साथ 3. ऊतक समारोह विश्लेषण

नोट: यहां प्रस्तुत MTF सिकुड़ना परख Grosberg एट अल में विकसित तकनीक के बाद मॉडलिंग की है 8।

  1. vMTF सिकुड़ना प्रयोग
    1. एक 100 मिमी डिश में एक ऊतक के नमूने रखें। 7.4 पीएच पर बाँझ 1X Tyrode के solution8 जोड़ें नमूना कवर करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक गरम।
    2. PIPAAm किनारे करने के लिए सीधा कई समानांतर कटौती करने के लिए एक रेजर ब्लेड का प्रयोग करें। पतली स्ट्रिप्स (चित्रा 3 ए, पक्ष कटौती) के साथ बारी vMTFs (चौड़ाई ~ 2 मिमी के साथ) हो जाएगा कि व्यापक ऊतक वर्गों है कि पैदावार एक तरीके में कटौती करें। साफ कटौती करने के लिए, नमूने के साथ संपर्क में एक रेजर ब्लेड जगह है और टीम के लिए खींचें मजबूती से।
    3. पकवान 90 डिग्री घुमाएँ और ऊतक के बीच में दो सीधे, समानांतर में कटौती करने, PIPAAm की पट्टी (चित्रा 3 ए, अंत में कटौती) के समानांतर। निकालें और इन कटौती के बीच ऊतक के ढीले पट्टी के निपटानs और vMTFs के बीच (पिछले चरण में कटौती) में पतली स्ट्रिप्स संपर्क बनाने से सटे फिल्मों को रोकने के लिए।
    4. नमूना 10 मिनट के लिए आरटी पर आराम करने की अनुमति है, या सभी तक PIPAAm भंग कर दिया है। नोट: PIPAAm भविष्य चरणों में रहता है, तो नमूना अवशिष्ट PIPAAm भंग करने के काटने पकवान को लौट जा सकता है। जरूरत के रूप में vMTF के नीचे के एक सज्जन scraping, PIPAAm हटाने में सहायता कर सकते हैं।
    5. एक स्वच्छ 35 मिमी पेट्री डिश में वैक्यूम तेल की एक छोटी बिंदी रखें। 37 डिग्री सेल्सियस पर ताजा, बाँझ 1X Tyrode के समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें। Coverslip के आंदोलन को रोकने के लिए वैक्यूम तेल पर 100 मिमी से 35 मिमी डिश के लिए पकवान, और प्रेस से कट फिल्मों के साथ coverslip स्थानांतरण।
    6. Stereomicroscope के मंच पर एक तापमान नियंत्रित मंच में पकवान रखें।
    7. कब्जा समय व्यतीत प्रेषित और इच्छित अंतराल पर फ्लोरोसेंट प्रकाश छवियों (उदाहरण के लिए।, 30 सेकंड) उपचार परख भर में।
    8. Serially (20 मिनट के लिए 50 एनएम endothelin-1 के साथ vMTFs का इलाजप्रेरित संकुचन) और 30 मिनट (ऊतक विश्राम के लिए 100 माइक्रोन हा-1077)। 5 मिलीलीटर मात्रा में वांछित उपचार एकाग्रता से बेदखल निर्दिष्ट समय बिंदुओं पर बाँझ 1X Tyrode के समाधान के 5 मिलीलीटर युक्त प्रायोगिक पकवान, करने के लिए प्रत्येक उपचार के केंद्रित समाधान जोड़ें। छवियों में पिपेट पर कब्जा करने से बचने के लिए समय चूक छवि अधिग्रहण के बीच अंतराल के दौरान उपचार जोड़ कर।
  2. vMTF सिकुड़ना विश्लेषण
    1. 1.4.8 में अलग सेट coverslips के प्रयोग, एक profilometer21 के साथ PDMS सब्सट्रेट मोटाई मापने। Coverslips के प्रत्येक सेट के लिए स्पिन समय वक्र बनाम एक मोटाई बनाएँ। एक सिकुड़ना प्रयोग में इस्तेमाल प्रत्येक coverslip के लिए vMTF मोटाई का अनुमान लगाने के लिए इस वक्र का प्रयोग करें।
    2. प्रयोग के दौरान हर बार बिंदु के लिए vMTF प्रक्षेपण लंबाई मापने, और जैसा कि पहले बताया विधियों 8 का उपयोग वक्रता त्रिज्या जुड़े (3B चित्रा) की गणना।
    3. हर बार पीओ पर vMTF तनाव की गणनापिछले vMTF विधियों 5 का उपयोग कर इंट।
      नोट: 3.2.1 से गणना की अनुमानित vMTF मोटाई का प्रयोग करें। 9 पहले से सूचना दी, के रूप में confocal छवियों का उपयोग कर VSMC मोटाई मापने। कंपनी डाटा शीट से PDMS यंग मापांक प्राप्त करते हैं।

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Representative Results

इस काम का प्राथमिक लक्ष्य हाइड्रोफोबिक PDMS substrates पर micropatterned VSMCs की व्यवहार्यता का विस्तार करने के लिए किया गया था। इस नमूनों genipin और PDMS पर फ़ाइब्रोनेक्टिन (चित्रा 1) जमा करने के लिए एक microfluidic वितरण प्रणाली को शामिल द्वारा पूरा किया गया। Microfluidic के वितरण का उपयोग ईसीएम प्रोटीन के जमाव genipin और फ़ाइब्रोनेक्टिन (चित्रा -1) की लाइनों के बीच नंगे PDMS के साथ चैनल के पैटर्न के उच्च निष्ठा हस्तांतरण झुकेंगे। पिछले microcontact मुद्रण विधियों 5,10,16 के समान धमनी lamellae के vivo संरचना नकल उतार जुड़ी कोशिकाओं (चित्रा 1E) फार्म मिला हुआ monolayers (चित्रा 2),। ये ऊतक जिसका तनाव vMTF प्रौद्योगिकी का उपयोग कर मापा गया था (चित्रा 3) उत्तरदायी, सिकुड़ा निर्माणों, झुकेंगे।

दो सप्ताह के पाठ्यक्रम पर ऊतक व्यवहार्यता के गुणात्मक मूल्यांकन genipin-modifi पर कम से कम गिरावट से पता चलाएड substrates के (2A चित्रा)। ऊतक संगम और संरेखण दो सप्ताह (चित्रा 2B, -2 सी और 2 डी) पर बनाए रखा गया। दो प्रमुख तनाव मूल्यों हर vMTF के लिए गणना की गई:। 1) बेसल स्वर और 2) प्रेरित सिकुड़ना (चित्रा -3 सी और 3 डी) बेसल स्वर संतुलन पर unstimulated VSMCs द्वारा बनाए रखा तनाव है। प्रेरित सिकुड़ना endothelin-1 के साथ उत्तेजना से प्रेरित अतिरिक्त तनाव है। बेसल टोन और प्रेरित सिकुड़ना दोनों (3E चित्रा और 3F) भर vasoactive ऊतकों का प्रदर्शन दो सप्ताह के समय के पाठ्यक्रम पर अनुरूप व्यवहार दिखाया। सीरम की कमी से जूझ VSMCs 19 पैदा करना नहीं है के बाद से परख के अंत में ऊतक सिकुड़ना में मामूली कमी, ऊतक रचना कोशिकाओं की संख्या कम का प्रत्यक्ष परिणाम है। संस्कृति के माध्यम से सीरम की एक न्यूनतम बेसल स्तर के अलावा भविष्य के काम में इस परिणाम को कम कर सकते हैं।

चित्रा 2. टिश्यूज सफलतापूर्वक Genipin संशोधित substrates पर दो सप्ताह के लिए नकल में विवो धमनी तहदार संरचना सक्षम रहते हैं और दो ​​सप्ताह के दौरान पूरे बलिदान समय बिंदुओं पर ऊतकों (ए) प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियों (पैमाने पर पट्टी: 200 माइक्रोन)।। एफ actin filaments, नीला: नाभिक (कोशिकाओं की उपस्थिति स्थापित करने के लिए दिखाया गया है), पैमाने बार सीरम भुखमरी (हरे रंग के बाद (बी) दिन 1 पर तय genipin संशोधित substrates पर गढ़े ऊतकों के प्रतिनिधि immunohistochemistry के चित्र, 4 दिन, और दिन में 10 ।। - 7) (डी) ऊतक संरेखण एफ actin अभिविन्यास आदेश पैरामीटर (OOP के द्वारा मापा जाता है) 22 (त्रुटि सलाखों के मानक त्रुटि, एन = 3: एफ actin कवरेज (त्रुटि सलाखों के द्वारा मापा 100 माइक्रोन) (सी) प्रतिशत संगम : मानक त्रुटि, एन = 3-7)। © IOP Publishiएनजी। Reproduced और / या अनुमति के साथ संशोधित। सर्वाधिकार सुरक्षित। सभी अधिकार सुरक्षित। 19 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. ऊतक सिकुड़ना दो सप्ताह के पाठ्यक्रम पर बनाए रखा है। (ए) प्रतिनिधि vMTF काटने योजना। (बी) में कटौती vMTF के योजनाबद्ध। 32 डिग्री सेल्सियस से नीचे ठंडा होने पर, PIPAAm घुल, vMTF रिहा। सक्रिय सेल परत में तनाव मोड़ करने के लिए निष्क्रिय PDMS परत का कारण बनता है। प्रक्षेपण लंबाई की माप Grosberg में तरीकों के अनुसार वक्रता त्रिज्या में बदला जा सकता एट अल। वक्रता त्रिज्या 8 ऊतकों में औसत पार के अनुभागीय तनाव की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (सी) अनुक्रमिक प्रेषित निम्न आय वर्गप्रतिनिधि सिकुड़ना परख की एचटी छवियों (पैमाने पर पट्टी: 1 मिमी)। ऊतकों, संतुलन तक पहुँचने पूर्ण विश्राम की अनुमति देने के endothelin -1, तो हा-1077 के साथ इलाज के साथ प्रेरित कर रहे हैं। नीचे:। सिकुड़ना परख के लिए परख के दौरान आदर्श ऊतक की ओर देखने के योजनाबद्ध (डी) प्रतिनिधि तनाव की अवस्था। दो प्रमुख तनाव मान की गणना कर रहे हैं। बेसल स्वर संतुलन तनाव राज्य और आराम से तनाव राज्य के बीच का अंतर है। प्रेरित सिकुड़ना endothelin -1 प्रेरित राज्य के लिए संतुलन राज्य से तनाव में परिवर्तन है (ई) बेसल टोन (त्रुटि सलाखों: मानक त्रुटि, एन = 5 - 12) (एफ) प्रेरित सिकुड़ना (त्रुटि सलाखों:।। मानक त्रुटि, एन = 5 - 12)। © IOP प्रकाशन। Reproduced और / या अनुमति के साथ संशोधित। सभी अधिकार सुरक्षित। 19 का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंयह आंकड़ा।

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Discussion

यहाँ, हम जीर्ण रोग रास्ते 1,23,24 की विस्तारित प्रयोग गुना अधिक विशिष्ट, की अनुमति पहले से विकसित vMTF प्रौद्योगिकी पर बनाता है कि एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। यह पूरा करने के लिए हम पहले से MTF सिकुड़ना प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए बेहतर संवहनी ऊतक व्यवहार्यता के साथ इंजीनियर धमनी लामेल्ले उपज के लिए एक microfluidic बयान तकनीक का उपयोग कर, PDMS substrates के 11 वर्ष की लंबी अवधि के functionalization के प्रदान करने के लिए दिखाया गया है जो genipin, micropattern। मैक्केन एट अल। एक संबंधित MTF मॉडल 25 में कई हफ्तों के लिए इंजीनियर हृदय के ऊतकों की विस्तारित संस्कृति के लिए एक विकल्प के micromolded जिलेटिन हाइड्रोजेल सब्सट्रेट विकसित की है।

इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक दो सप्ताह के पाठ्यक्रम पर धमनी लामेल्ला संरचना (चित्रा 2) और समारोह (चित्रा 3) मजाक उड़ाया कि vMTFs झुकेंगे। प्रस्तुत प्रोटोकॉल के सफल समापन के वांछित Res पैदावार जबकिरोग-प्रासंगिक समय के पाठ्यक्रम के लिए बढ़ाया संस्कृति टाइम्स की ULT (जैसे, ऊपर से 14 दिनों में 26 के लिए बने मस्तिष्क vasospasm की वैकृत प्रभाव), कुछ आम नुकसान उत्पन्न होती हैं। डिवाइस में शाखाओं के आंशिक या पूर्ण रुकावट में परिणाम कर सकते हैं कि हानिकारक नुकसान में PDMS microfluidic उपकरणों परिणामों का बार-बार इस्तेमाल करते हैं। इस प्रकार, नए उपकरणों के एक प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। एक और मुद्दा है, के रूप में आम नहीं है, जबकि ऊतकों की अप्रत्याशित और असंगत delamination है। इन घटनाओं घटना में प्रकृति में यादृच्छिक और दुर्लभ होना प्रतीत होता है। अवलोकन करके, ऊतकों delaminating से पहले एक arch- या लुमेन जैसी संरचना के रूप में। हम यह भी microcontact मुद्रण तकनीक का उपयोग कर गढ़े ऊतकों में इस व्यवहार मनाया। इस प्रकार, हम इस मुद्दे पर बोने या एक प्ररूपी असामान्य व्यवहार में यह परिणाम है कि सुसंस्कृत VSMCs में स्विच नहीं है और यहाँ प्रस्तुत निर्माण के तरीकों का एक सीधा परिणाम या तो का परिणाम मानते हैं।

वर्तमान microfluidआईसी डिजाइन रैखिक प्रवाह पैटर्न की आवश्यकता है और इस तरह के रूप में, एक ही प्रिंसिपल दिशा में संरेखण के साथ ऊतकों तक सीमित है। ऐसे निलय दौरे संरचना 27 के "ईंट की दीवार" पैटर्न के रूप में और अधिक जटिल आकृति, आवश्यकता के ऊतकों के लिए आवेदन के अधिक विस्तृत microfluidic डिजाइन की आवश्यकता होगी। हम अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ genipin संशोधित substrates के वरीयता प्राप्त नहीं किया है। हालांकि, Genchi एट अल। genipin संशोधित PDMS 11 पर isotropic कंकाल की मांसपेशी की व्यवहार्यता बढ़ाया दिखाया। इस प्रकार, हम इस प्रोटोकॉल की एक न्यूनतम संशोधित संस्करण अंग-पर-एक चिप प्रौद्योगिकियों के भविष्य के विकास में अन्य अंग प्रणालियों के लिए व्यापक प्रयोज्यता है कि आत्मविश्वास महसूस।

पिछले विधियों 8 पर आधारित vMTFs के लिए तनाव गणना पद्धति पतली फिल्मों के ऊतकों में रिश्तेदार सिकुड़ना और इसी काट लंबाई द्वारा सीमित है। बहुत लंबा कटौती, फिल्मों के लिए खुद पर कर्ल जाएगा। बहुत संक्षेप में कटौती, तो फिल्मों के लिए नहीं किया जाएगाएन डी। या तो मामले सीमाओं मॉडल की वजह से सिकुड़ा गुणों का समुचित विश्लेषण से बचाता है। उचित कटौती की लंबाई दोहराया प्रयोगों के माध्यम से परिष्कृत किया जाना चाहिए। अग्रवाल एट अल में के रूप में एक लेजर उत्कीर्णन प्रणाली के कार्यान्वयन,।, Repeatability और MTF 28 काटने की गुणवत्ता पर सुधार कर सकते हैं।

बेहतर एक कसकर नियंत्रित, घुन्ना प्रायोगिक प्रणाली में देशी ऊतक संरचना और समारोह पुनरावृत्ति करने की क्षमता बायोइन्जिनियरिंग के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण खोज है। इस खोज मौलिक शारीरिक और अंग प्रणालियों 29,30 के वैकृत व्यवहार की समझ को आगे बढ़ाने, कई में इन विट्रो ऊतक mimics और बहुआयामी है, फिर भी सरल मॉडल अंगों पर एक चिप के विकास के लिए प्रेरित किया है। PDMS substrates पर genipin के बयान का प्रयोग, हम दो सप्ताह से अधिक विस्तारित सेल व्यवहार्यता और संवहनी चिकनी मांसपेशी समारोह के रखरखाव का प्रदर्शन किया है। यह पिछले निर्माण techn पर एक महत्वपूर्ण सुधार हैसंस्कृति 19 में 7 दिन, और अधिक मजबूत धमनी पर एक चिप विधियों के विकास सहायता कर सकते हैं - ऊतकों और 4 के बाद कोशिका मृत्यु के delamination करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जो iques। कारण सबसे वाहिका रोगों के जीर्ण प्रकृति के कारण, इस अग्रिम विशिष्ट संवहनी विकृतियों में शामिल सिकुड़ा तंत्र में भविष्य जांच की एक किस्म के लिए रूपरेखा प्रदान करता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip staining rack Electron Microscopy Sciences www.emsdiasum.com/ 72239-04
Microscope cover glass - 25 mm Fisher Scientific, Inc. www.fishersci.com 12-545-102
Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ #21458
1-butanol Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com 360465
Spincoater Specialty Coating Systems, Inc. www.scscoatings.com
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives (Dow Corning) www.ellsworth.com 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Fluorescent microbeads Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ 17151
Silicon wafers Wafer World, Inc. www.waferworld.com 2398
Photoresist  MicroChem Corp. www.microchem.com
Contact mask aligner Suss MicroTec www.suss.com
Developer MicroChem Corp. www.microchem.com
Tridecafluro-trichlorosilane UCT Specialties, Inc. www.unitedchem.com T2492
Surgical biopsy punch Integra LifeSciences Corp. www.miltex.com 33-31AA-P/25
Genipin Cayman Chemical www.caymanchem.com 10010622
1X phosphate buffered saline Mediatech, Inc. www.cellgro.com 21-031-CV
Fibronectin Corning, Inc. www.corning.com 356008
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com 15140-122
Umbillical artery smooth muscle cells Lonza www.lonza.com CC-2579
Tyrode's solution components Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com various
Stereomicroscope Zeiss www.zeiss.com 4350020000000000
Temperature-controlled platform Warner Instruments www.warneronline.com 641659; 640352; 641922
Endothelin-1 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com E7764-50UG
HA-1077 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com H139-10MG

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References

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