Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Mikrofluidumanordning Genipin avsättningsteknik för Extended kultur av Micropatterned Kärl Muskulös Thin Films

Published: June 26, 2015 doi: 10.3791/52971
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota

Introduction

Vaskulära sjukdomar, såsom cerebral vasospasm 1,2, hypertoni 3 och ateroskleros 4, utvecklas långsamt, är typiskt kronisk karaktär, och involverar dysfunktionella kraft-generering av vaskulära glatta muskelceller (VSMC). Vi strävar efter att studera dessa långsamt progredierande kärl dysfunktioner använder in vitro-metoder med bättre kontroll av experimentella betingelser än i in vivo-modeller. Vi har tidigare utvecklat kärlmuskel tunna filmer (vMTFs) för mätning av funktionella kontraktilitet av in vitro konstruerade kardiovaskulära vävnader 5, men denna metod har varit begränsad till relativt korttidsstudier. Här presenterar vi ett substrat modifiering teknik som utökar vår tidigare vMTF teknik för långtidsmätningar.

Medan endotel är också avgörande för övergripande kärlfunktionen, konstruerad arteriell lameller ger ett användbart modellsystem för bedömning av förändringar i vaskulärkontraktilitet under sjukdomsprogression. För att konstruera en funktionell kärlsjukdom vävnadsmodell, både struktur och funktion av artärlamellen, den grundläggande kontraktila enhet av fartygets måste rekapituleras med high fidelity. Arterial lameller är koncentriska, periferiellt inriktade ark kontraktila VSMC åtskilda av ark av elastin 6. Mikrokontakttryckning av extracellulärt matrix (ECM) proteiner på polydimetylsiloxan (PDMS) substrat har tidigare använts för att tillhandahålla vägledning ledtrådar för vävnadsorganisation för att efterlikna i linje kardiovaskulär vävnad 5,7-10. Men vävnader mönstrad med hjälp microcontact utskrift kan förlora integriteten efter 3-4 dagar i kultur, vilket begränsar deras användbarhet i kroniska studier. Detta protokoll ger en lösning på denna fråga genom att ersätta tidigare microtrycktekniker med en ny mikroflödesavsättningsteknik.

Genchi m.fl.. Modifierade PDMS substrat med genipin och found långvarig livskraft myocyter upp till en månad i kultur 11. Här använder vi en liknande strategi att utöka kultur av mönstrade vaskulära glatta muskelceller på PDMS. Genipin, en naturlig hydrolytisk derivat av gardenia frukt, är en önskvärd kandidat för substrat ändring på grund av dess relativt låg toxicitet jämfört med liknande tvärbindningsmedel och dess ökande användning som biomaterial inom vävnadsreparation 12,13 och ECM ändring 14, 15. I detta protokoll, är fibronektin utnyttjas som en cell vägledning kö, som i tidigare microtryckmetoder; dock genipin avsätts på PDMS substrat före fibronektin mönstring. Således, som celler försämra mönstrade matrisen, kan nysyntetiserade ECM från anslutna VSMC binda till genipin belagda PDMS substrat.

Detta protokoll använder en mikroflödes avgivningsanordning för två-stegs genipin och ECM nedfall. Utformningen av mikrofluidikanordning härmar microcontact tryckmönster som används för konstruerade arteriell lameller i tidigare studier 16. Därför räknar vi med detta protokoll för att ge arteriell lameller härmar som framgångsrikt rekapitulera den högt linje in vivo struktur och sammandragande funktion av arteriell lameller. Vi utvärderar också vävnads kontraktilitet att bekräfta att genipin är ett lämpligt substrat modifikation förening för långsiktig in vitro modeller kärlsjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Obs: Målet med detta protokoll är att konstruera och använda en vaskulär muskulös tunn film (vMTF) med den struktur som visas i figur 1 för att bedöma kontraktilitet under förlängd odling av vaskulära glatta muskelceller (VSMC) på PDMS substrat. För att förlänga VSMC lönsamhet, använder vi tvärbindningsföreningen genipin. De substrat för dessa vMTFs är utformade för att analysera vävnads kontraktilitet som utvecklats av Grosberg et al. 8 Övriga vMTF metoder 5 kan också användas, med subtila förändringar i presenterade underlaget tillverkningsprotokoll.

1. Substrat Fabrication

  1. Täckglas Rengöring
    1. Placera 25 mm diameter glastäck i en täckfärgningsställ. Placera stället i en stor bägare eller behållare (t.ex. en tom 100 -. 1000 | j, l pipettspets behållare).
    2. Lägg 70% etanol till behållaren för att fullständigt doppa täckglasen. Sonikera dem i minst 30 minuter. </ Li>
    3. Ta bort täck stället från etanollösningen. Låt täcklufttorka genom att hänga rack i en steril kultur huva (för att förhindra partikel samlas på täck) för 1- 2 timmar.
      Obs! Täck måste vara helt torr före följande steg.
  2. Poly (N-iso-propylakrylamid) (PIPAAm) Strip Isolering på Cover
    1. Med tejp, tejp utanför sidorna av en rengjorda täckglas, som lämnar en exponerad remsa centrerad på täckglas (Figur 1A). Ändra bredden på detta exponerad remsa grundas på tillämpning och / eller mikroflödes design.
    2. Markera kanter tejpremsor på täck använder ett labb markör för framtida behov (Figur 1A).
    3. Skär runt omkretsen av täck att släppa från skålen (Figur 1A, prickad röd linje).
  3. Poly (N-iso-propylakrylamid) (PIPAAm) Beläggning
    1. Använda en analytisk balans, väger 1 g PIPAAM pulver. Använd inte opolymeriserad N-iso-propylakrylamid, som är cancerframkallande.
    2. Överför PIPAAm till en 50 ml centrifugrör. Lägg 10 ml 1-butanol i en kemisk huv för att ge en 10% vikt / volym lösning. VARNING: flampunkt 1-butanol är 37 ° C. Förvara den resulterande lösningen i en brandfarlig skåp och undvika uppvärmning.
    3. Låt PIPAAm att upplösa under 10 minuter. Om pulver är fortfarande synliga, blanda lösningen med en vortex-blandare tills allt pulver upplöses.
      Obs: Följande steg kräver användning av en spinnbeläggare. För varje täck:
    4. Placera tejpade täck på spinnbeläggare chuck med pincett.
    5. Överför 150 | il PIPAAm lösningen på täckglas genom att placera små droppar längs den exponerade glaset i mitten av täckglas. Säkerställa fullständig täckning av den exponerade arean.
    6. Spin coat PIPAAm användning av följande recept:
      1. Ramp 10 sek till 3000 varv per minut. Dwell i 5 sek.
      2. Ramp 10 sek till 6,000 rpm. Dwell under 60 sek.
      3. Ramp 10 sek till 3000 varv per minut. Dwell i 5 sek.
    7. Placera täck i en täckt petriskål med PIPAAm uppåt. Låt lufttorka i minst 15 minuter.
    8. Ta försiktigt bort tejpen från alla täck, lämnar hela täck exponeras med ett tunt lager av PIPAAm beläggning i ett centrum remsa.
  4. PDMS Beläggning
    1. Blanda och avlufta 15 g PDMS i en 10: 1 bas: tvärbindare förhållande. Lägg 7-8 droppar sonikerade 0,2 pm fluorescerande mikropärlor före blandning. Täck kopp PDMS med aluminiumfolie när den inte används för att förhindra damm och andra partiklar från att förorena PDMS.
      Obs: Följande steg kräver användning av en spinnbeläggare. För varje täck:
    2. Placera en PIPAAm belagt täck på spinnbeläggare chuck med pincett.
    3. Överför PDMS på täck, som omfattar minst en tredjedel av täckområdet.
    4. Spin päls med användning av följande recipe:
      1. Ramp 5 sek till 500 rpm. Bo 5 sek.
      2. Ramp 5 sek till 1000 varv per minut. Bo 5 sek.
      3. Ramp 10 sek till 3000 varv per minut. Dwell 10 sek.
      4. Ramp 10 sek till 4000 varv per minut. Dwell 60 sek.
      5. Ramp 10 sek till 2000 varv per minut. Dwell 15 sek.
      6. Ramp 10 sek till 1000 varv per minut. Dwell 10 sek.
      7. Ramp 5 sek till 500 rpm. Bo 5 sek.
    5. Placera täck i en täckt petriskål med PDMS uppåt. Registrera den tid när täckglaset spinnbelades. Håll koll på tiden i samband med varje täck hela experimentet för senare användning vid bestämning av PDMS substrattjockleken.
    6. Placera petriskål med täckglas i en ugn vid 90 ° C under åtminstone 1,5 timmar för att säkerställa korrekt PDMS härdning. Om en ugn inte är tillgänglig, låt täckglasen härda i minst 48 h vid RT.
    7. Ta bort täck ur ugnen och förvara dem i en mörk låda tills den ska användas.
    8. Avsätt var fjärde täck feller senare mätning av substratets tjocklek, som en funktion av spinnbeläggningstiden, med en profilometer.

2. Mikroflödes Mönstring för ingenjörs Vävnader

  1. Tillverkning av mikroflödessystem enheter
    1. Design av vävnads Microfluidic fotomask
      1. Använd någon lämplig datorstödd design program för att designa mikroflödesmönster. För arteriell lameller består av humana navelsträngsartär vaskulära glatta muskelceller, använder ett alternerande mönster av 10 | j, m kanaler med 10 | j, m väggar.
      2. Använd binär kanal förgrening om möjligt 17, men andra förgrenings konstruktioner kan användas. Minska bredden och längden på kanalerna för varje förgrening iteration tills uppnå den önskade vävnaden mönstret avstånd (väggar och kanaler, Figur 1B).
      3. Utforma anordningen att ha en enda inlopp för ytbehandlingslösning placering och ett enda utlopp för applicering av vakuum.
      4. Fabricate en fotomask innehållande mikroflödes konstruktion (er), såsom tidigare beskrivits 18.
    2. Fotolitografisk Wafer Fabrication
      Obs: Utför fotolitografi i en lämplig renrum eller liknande anläggning. För att göra kiselskivor med mönster för mjuka litografiska tillverkning av vävnads mikrofluidikanordningar (~ 20-25 um rännhöjden) med hjälp av fotolitografi:
      1. Rengör en kiselskiva i aceton, metanol och isopropylalkohol under vardera 1 min. Torka skivan med ett kvävepistol.
      2. Prebake skivan på en varm platta i 5 min vid 115 ° C för att avlägsna överskott av fukt.
      3. Spin belägga skivan med SU-8 3025 fotoresist med användning av följande recept för att ge funktioner 20-25 um i höjd:
        1. Ramp 5 sek till 500 rpm. Bo 5 sek.
        2. Ramp 15 sek till 4000 varv per minut. Dwell 15 sek.
      4. Mjuk baka rånet på en värmeplatta vid 95 ° C under 15 minuter.
      5. Ladda en fotomask, och exponera than wafer under 16 sekunder med hjälp av en vakuumkontaktprogram på en kontaktmask Aligner.
      6. Hård baka skivan på en varm platta vid 95 ° C under 4 minuter.
      7. Utveckla rånet för 6 min i framkallaren. Därefter, tvätta skivan två gånger för två sekunder i färsk framkallare och skölj skivan med isopropylalkohol.
      8. Silanate det mönstrade rånet O / N genom att placera 2-3 droppar tridecafluoro-triklorsilan i en tom skål i en vakuumexsickator. Prop skivan upp med petriskålar så att både botten och toppen av skivan är exponerade.
        VARNING: Tridecafluro-triklorsilan är en brandfarlig och frätande vätska. Korrekt personlig skyddsutrustning och punktutsug är nödvändigt för användning.
    3. Vävnadsmikroflödessystem enhet Fabrication
      1. Placera en silanerades, mönstrat skivfunktionssidan uppåt i en petriskål.
      2. Blanda och avlufta 100 g PDMS med en 10: 1 bas: tvärbindare förhållande. Häll PDMS i skålen, helt och jämnt täcker skivan.
      3. Placera skålen i en vakuumexsickator tills alla luftbubblor avlägsnas från ohärdade PDMS, ca 30 min. Cure PDMS i skålen vid 90 ° C under minst 1,5 h. Tid och temperatur kan justeras såsom dikteras av tillverkning riktlinjer för att få en fullständig härdning.
      4. När PDMS har härdat, skär ut PDMS runt skivan med ett rakblad och försiktigt släppa PDMS-täckt rånet från skålen. Avlägsna överskott av PDMS under skivan och dra långsamt PDMS bort från toppen av skivan.
      5. Placera PDMS disken funktionssidan upp i en ren skål och lagra skivan från ljus efter användning.
      6. Skär bort överskottet PDMS från runt mönster med hjälp av ett rakblad. Cut enheter i rektangulära former (Figur 1C) för att underlätta skalning av enheten från substrat i senare steg. Exakta snitt är inte nödvändiga, så länge som gott om plats finns för inlopp, utlopp, och vävnadsmönsterarea (Figur 1C).
      7. Punchinlopps- och utloppshålen (figur 1C) med användning av en 1 mm kirurgisk biopsistans.
  2. Mikrofluidikanordning Deponering
    Obs: I detta protokoll, är mikroflödes leverans används för att sätta in mönstrade genipin, nyckeln tvärbindningsmedlet för långsiktig vävnadsodling, samt fibronektin. Steg före penicillin / streptomycin sterilisering (2.2.3) behöver inte ske under sterila förhållanden, men att begränsa föroreningar och dammuppsamling uppmuntras hela protokollet. Alla steg som inträffar efter täck sterilisering med penicillin / streptomycin (2.2.3) bör använda steril teknik. Obs: Denna del av protokollet måste startas en dag före cellsådd.
    1. Substrat och mikroflödessystem enhet Framställning
      1. Sonikera mikrofluidikanordningama i 70% etanol i minst 30 minuter.
      2. Torka de sonikerade mikrofluidikanordningama använder tryckluft eller kväve, och placera dem i en petriskål wite kanalen har framsidan uppåt för att förhindra onödigt slitage på funktionerna.
      3. Placera upp till 10 vMTF substrattäck i en UVO renare (locket avlägsnades på skålen så att ytan funktion) under 8 minuter.
      4. Ta bort UVO-behandlade täck, och placera mikrofluidikanordningar funktionssidan nedåt på varje slip en i taget (orientering bör vara liknande figur 1C). Tryck bestämt nedåt på enheterna för att säkerställa en tät förslutning till PDMS-belagda täck.
    2. Avsättning av Genipin och fibronektin
      1. Bered en 5 mg / ml genipin lösning genom att tillsätta 1 ml steril DDH 2 O till en 5 mg behållare med lyofiliserad genipin. Blanda lösningen med användning av en vortex-blandare. Ställ åt sidan vid rumstemperatur under åtminstone 30 minuter.
        Obs: Pulvret är svårt att solubilisera vid RT, så repetitiva blandning under åtminstone en minut är ofta nödvändigt.
      2. Snabbt, placera en droppe av 70% etanol vid inloppet till varje enhet för enhet priming. Obs: ETHanol bör veke genom enheterna.
      3. Efter 5-10 minuter, försiktigt aspirera överskott av etanol vid inloppet, omedelbart ersätta den med 1X fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid inloppet. Från denna punkt framåt, vara noga med att inte låta inloppet till bli helt torr för att undvika införandet av luft till enheten.
      4. Placera en vakuumsuganordningsspetsen vid utloppet från varje enhet. Rita 1X PBS genom enheter för att skölja etanol bort. Lämna en liten mängd av 1 x PBS vid inloppet. Obs: Om inloppet verkar nästan torr, tillsätt mer 1X PBS.
      5. Aspirera överskott 1X PBS, så att endast en liten mängd kvar vid inloppet före applicering av genipin lösning.
      6. Placera 60 | il av 5 mg / ml genipin lösningen vid varje inlopp (figur 1D). Rita genipin lösningen genom anordningarna genom att placera en vakuumsuganordningsspetsen vid utloppet (figur 1D). Var noga med att inte dra alla av lösningen genom, lämnar en liten mängd lösning vid inloppet.
      7. Plats droppar (cirka dime-storlek) av 1 x PBS vid både inloppet och utloppet för att bibehålla vätning under inkubation. Flytta skål innehållande enheter till en befuktad ugn eller en inkubator (steril miljö är inte nödvändigt) inställd på 37 ° C och inkubera i 4 timmar. Skålen behöver inte täckas.
      8. Under inkubationen återsuspendera fibronektin till en koncentration av 50 | ig / ml i steril DDH 2 O på is i minst 30 min före applicering på mikrofluidikanordning.
      9. Efter inkubation av genipin, aspirera alla återstående 1X PBS vid utloppen enheten. Fortsätta att tillämpa en vakuumsug vid varje utloppsanordning, dra igenom återstående 1X PBS vid inloppet.
      10. Placera 100 pl av 50 pg / ml fibronektin lösning vid varje inlopp, att man till en minimal mängd av kvarvarande 1X PBS vid inloppet (Figur 1D).
      11. Rita fibronektinlösningen genom de anordningar med användning av en vakuumsuganordningsspetsen vid utloppet (
      12. Flytta avtäckt skål innehållande enheterna till en ugn eller en inkubator inställd på 37 ° C och inkubera i 24 h. Obs: fibronektin steget kräver inte vätning av inlopp och utlopp med 1 x PBS. Den återstående poolen av fibronektin vid inloppet kommer att torka ut. Detta förväntas.
    3. Sterilisering och förberedelse för Cell sådd
      1. Framställ en lösning av penicillin / streptomycin för sterilisering av mönstrade vMTF täckglas. Tillsätt 5 ml penicillin / streptomycin (10000 enheter / ml; 10 tusen xg / ml) till 500 ml steril 1 x PBS.
      2. Placera skålen med enheter i en steril biosäkerhet huva.
      3. Ta försiktigt bort enheter från täck genom att långsamt skalar enheten vid ett hörn, medan lätt att ta tag i täck i andra handen.Obs! Det här steget kräver övning för att minska täck skada i borttagningen. Ett alternativ är att använda en spruta för att injicera 1 x PBS vid inloppet och / eller utloppet till stöd i anordningen frisättning.
      4. Placera täckglas i sterila sex brunnar. Tillsätt minst 5 ml av penicillin / streptomycin-lösning till varje brunn. Placera skålarna i en steril inkubator vid 37 ° C under minst 30 minuter.
      5. Efter sterilisering, aspirera penicillin / streptomycin lösning och utsäde täck med odlade humana navelartär vaskulära glatt muskulatur cells19 (Figur 1D). Sådd koncentrationen för VSMC är ~ 80.000 celler per cm2. För att reducera antalet celler som behövs för varje prov, använda en reduktions att minska sådd området. Ett exempel på en reducerare är den skurna toppen av en 15 ml koniskt rör fäst på täckglas med steril vakuum fett före sådd.
      6. Inkubera ympade täckglas i en steril inkubator vid 37 ° C och 5% CO2 (figur 2A-B).
    4. Långsiktig vMTF Tissue Culture
      1. En dag efter sådd, ta bort cellmediet och förminsknings. Skölj vävnaderna med 1X PBS. Tillsätt 4 ml av serumfritt cellmedium för att inducera en kontraktil fenotyp i VSMC 20.
      2. Upprepa 1X PBS skölj och tillsättning av färskt serumfritt medium varannan dag såsom önskas för långtidsodling.

Figur 1
Figur 1. mikroflödes Protein Delivery Device. (A) Tejpad bort täck för PIPAAm beläggning. Röd streckad cirkel: skära väg att frigöra täck (B) representant AutoCAD ritning av vävnad mikrofluidisk maskmönster.. Infällt: Detalj av binär förgrening till Alternrande 10 um x 10 um vävnadsmönster. (C) Placering av mikroflödessystem enhet på ett täcksubstrat med inlopp och utlopp anges. (D) Schematisk bild av mikroflödesprotein mönstring och leverans. Vänster till höger: svepelektronmikroskopbild av mikroflödessystem kanaler (skala bar: 50 pm); Detaljerat schema av metod för protein avlagring; Immunohistokemi färgade fibronektin (skala bar: 50 pm); Cellsådd med vaskulära glatta muskelceller. (E) Schematisk bild av fabricerade vävnad. 1 st infällda: Detalj av skiktad konstruktion. 2: a inlägg: Detalj av genipin modifiering av PDMS substrat efter mikroflödes avsättning. © IOP Publishing. Reproduceras och / eller modifieras med tillstånd. All rights reserved. 19 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

3. Vävnadsfunktionsanalys med vMTF Kontraktilitet analys

Obs: Analys MTF kontraktilitet presenteras här är modellerad efter den teknik som utvecklats i Grosberg et al 8.

  1. vMTF Kontraktilitet Experiment
    1. Placera ett vävnadsprov i en 100 mm skål. Tillsätt steril 1X Tyrodes solution8 vid pH 7,4 värmdes till 37 ° C för att täcka provet.
    2. Använda ett rakblad för att göra flera parallella snitt vinkelrätt mot PIPAAm kanten. Gör nedskärningar på ett sätt som ger större vävnadssnitt som kommer att vara den vMTFs (med bredd ~ 2 mm) omväxlande med tunna remsor (Figur 3A, skär sido). För att göra rena snitt, placera ett rakblad i kontakt med provet och bestämt dra åt sidan.
    3. Rotera skålen 90 ° och göra två raka, parallella snitt i mitten av vävnaden, parallellt med remsan av PIPAAm (figur 3A, end cuts). Ta bort och kassera den lösa remsan av vävnad mellan dessa snitts och de tunna remsor däremellan vMTFs (snitt i föregående steg) för att förhindra intilliggande filmer från att ta kontakt.
    4. Låt provet vila vid RT under 10 minuter, eller tills all PIPAAm har lösts upp. Obs: Om PIPAAm kvar i framtida åtgärder, kan provet återföras till skär skålen för att lösa återstående PIPAAm. En försiktig skrapning av undersidan av vMTF kan stöd i PIPAAm avlägsnande, efter behov.
    5. Placera en liten prick av vakuum fett i en ren 35 mm petriskål. Tillsätt 5 ml färsk, steril 1X Tyrodes lösning vid 37 ° C. Överför täck med skurna filmer från 100 mm skålen till 35 mm skålen och tryck på vakuum fett för att förhindra förflyttning av täck.
    6. Placera skålen i en temperaturkontrollerad plattform på stereomikroskop scenen.
    7. Capture time-lapse överförs och lysrör bilder på önskade intervall (t ex., 30 sek) under hela behandlingen analys.
    8. Serie behandla vMTFs med 50 nM endotelin-1 under 20 minuter (inducerad kontraktion) och 100 | iM HA-1077 under 30 min (vävnadsrelaxation). Lägg koncentrerade lösningar av varje behandling med den experimentella skål innehållande 5 ml steril 1X Tyrodes lösning vid specificerade tidpunkter, vilket gav den önskade behandlingen koncentrationen i 5 ml volym. Gör tillägg behandling under intervallet mellan tidsförlopp bild förvärv för att undvika att fånga pipett i bilder.
  2. vMTF Kontraktilitet Analys
    1. Använda täck som avsatts i 1.4.8, mäta PDMS substrat tjocklek med en profilometer21. Skapa en tjocklek kontra spinntidskurva för varje uppsättning av täckglas. Använd denna kurva för att uppskatta vMTF tjockleken för varje täck används i en sammandragnings experiment.
    2. Mät vMTF projektions längder för varje tidpunkt under experimentet, och beräkna tillhörande krökningsradierna (figur 3B) med användning av tidigare rapporterade metoder 8.
    3. Beräkna vMTF stress på varje gång point använda tidigare vMTF metoder 5.
      Obs: Använd den beräknade vMTF tjocklek som beräknats från 3.2.1. Mät VSMC tjocklek med hjälp av konfokala bilder, som tidigare rapporterats 9. Skaffa PDMS Youngs modul från företagets datablad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det primära målet med detta arbete var att förlänga livskraften hos micropatterned VSMC på hydrofoba PDMS substrat. Detta åstadkoms genom att införliva ett mikrofluidtillförselsystem för att avsätta mönstrade genipin och fibronektin på PDMS (Figur 1). Deponering av ECM-proteiner med hjälp av mikroflödes leverans gav trohet överföring av kanalmönstret hög med nakna PDMS mellan rader av genipin och fibronektin (Figur 1D). De bifogade celler (figur 1E) bildar konfluenta monoskikt som härmar strukturen av arteriell lameller in vivo (Figur 2), som liknar föregående mikrokontakttryckning metoder 5,10,16. Dessa vävnader gav lyhörd, kontraktila konstruktioner, vars spänning mättes med hjälp av vMTF teknik (Figur 3).

Kvalitativ bedömning av vävnad livskraft under loppet av två veckor visade minimal försämring på genipin-modified substrat (Figur 2A). Vävnadssammanflödet och inriktning kvarstod under två veckor (Figur 2B, 2C och 2D). Två viktiga spännings värden beräknades för varje vMTF:. 1) basal ton och 2) inducerade kontraktilitet (Figur 3C och 3D) Basal tonen är den stress som upprätthålls av ostimulerade VSMC vid jämvikt. Induced kontraktilitet är ytterligare stress inducerad genom stimulering med endotelin-1. Både basala ton och inducerad kontraktilitet visade konsekvent beteende över två veckor tidsförloppet, vilket visar vasoaktiva vävnader hela (Figur 3E och 3F). Den något lägre vävnads kontraktilitet vid slutet av analysen är ett direkt resultat av det reducerade antalet celler som utgör vävnaden, eftersom serumsvultna VSMC inte prolifererar 19. Tillsatsen av en minimal basal nivå av serum till odlingsmedium kan lindra detta resultat i det fortsatta arbetet.

Figur 2. Vävnader förbli livskraftig och framgångsrikt Mimic in vivo artär lamellstruktur för två veckor på Genipin modifierade substrat (A) Representativa fas kontrastrika bilder av vävnader vid offer tidpunkter under loppet av två veckor (skala bar: 200 pm).. (B) Representativa immunohistokemi bilder av vävnader tillverkade på genipin modifierade substrat fasta på Dag 1, dag 4, och Dag 10 efter serumsvält (grön: f-aktinfilament, blå: kärnor (visat att etablera närvaron av celler), skala bar .: 100 ^ m) (C) Procent konfluens mätt med f-aktin täckning (felstaplar: standardfel, n = 3 - 7) (D) Vävnadsinriktnings mätt med f-aktin orientering ordningsparameter (OOP) 22 (felstaplar. : standardfel, n = 3 - 7). © lOP Publishing. Reproduceras och / eller modifieras med tillstånd. All rights reserved. All rights reserved. 19 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Vävnads Kontraktilitet bibehålls under loppet av två veckor. (A) representant vMTF besparingsprogram. (B) Schematisk bild av snittet vMTF. Efter kylning till under 32 ° C, PIPAAm upplöses, släppa vMTF. Stress i den aktiva cellskiktet orsakar passiva PDMS skiktet att böja. Mätning av projektionslängden kan omvandlas till en krökningsradie enligt metoderna i Grosberg et al., Är 8 Krökningsradie används för att beräkna den genomsnittliga tvärsnitts stress i vävnaden. (C) Sekventiell överförd LIGht bilder av representativa kontraktilitet analys (skala bar: 1 mm). Vävnader nå jämvikt, stimuleras med endotelin-1, behandlades därefter med HA-1077 för att möjliggöra fullständig avkoppling. Nederst:. Schematisk bild av sidovy av idealiserat vävnad under loppet av analysen (D) Representant spänningskurvan för kontraktiliteten analysen. Två viktiga spänningsvärden beräknas. Basal tonen är skillnaden mellan jämviktsspänningstillstånd och avslappnad spänningstillstånd. Induced kontraktilitet är förändringen i stress från jämviktstillståndet till endotelin-1 stimulerade tillstånd (E) Basal ton (felstaplar: standardfel, n = 5-12) (F) inducerad kontraktilitet (felstaplar:.. Standardfel, n = 5-12). © IOP Publishing. Reproduceras och / eller modifieras med tillstånd. All rights reserved. 19 Klicka här för att se en större version avdenna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här presenterar vi ett protokoll som bygger på tidigare utvecklat vMTF teknik, vilket gör att långa experiment gånger mer typiska för kronisk kärlsjukdom vägar 1,23,24. För att åstadkomma detta, micropattern vi genipin, som tidigare har visat sig ge långsiktig funktionalisering av PDMS-substrat 11, med användning av ett mikrofluidavsättningsteknik för erhållande av Engineered arteriell lameller med förbättrad vaskulär vävnadsviabilitet för användning i MTF kontraktilitet experiment. McCain et al., utvecklat ett alternativ micromolded gelatinhydrogel substrat för utökad odling av manipulerade hjärtvävnader i flera veckor i en relaterad MTF modell 25.

Detta protokoll gav vMTFs som framgångsrikt härmade arteriell lamell strukturen (Figur 2) och funktion (Figur 3) under loppet av två veckor. Medan ett framgångsrikt slutförande av den presenterade protokollet ger de önskade result av utökade odlingstider för sjukdomsrelevanta tidsförlopp (t.ex. de patologiska effekterna av cerebral vasospasm bestående upp till 14 dagar 26), några vanliga fallgropar uppstår. Upprepad användning av PDMS mikrofluidikanordningar resulterar i skadlig skada som kan resultera i partiell eller fullständig blockering av filialer i anordningen. Således måste nya anordningar användas för varje experiment. En annan fråga, medan inte lika vanligt, är oväntad och inkonsekvent delaminering av vävnader. Dessa händelser tycktes vara slumpmässigt i naturen och sällsynta i händelse. Genom observation, vävnader bildar en ärke eller lumen liknande struktur innan delaminering. Vi observerade också detta beteende i vävnader tillverkade med hjälp av microtrycktekniker. Därför tror vi att denna fråga är resultatet av antingen översådd eller en fenotypisk brytare i de odlade VSMC som resulterar i onormalt beteende och inte en direkt följd av de tillverkningsmetoder som presenteras här.

Den aktuella mikrofluidic design kräver linjära flödesmönster och som sådan, är begränsat till vävnader med inriktning på en enda huvudriktning. Ansökan till vävnader som kräver mer komplexa mönster, såsom "tegelvägg" mönster av kammar hjärtinfarkt struktur 27, kommer att kräva mer avancerade mikroflödes design. Vi har inte ympas genipin modifierade substrat med andra celltyper. Emellertid Genchi et al., visade förlängas livskraft isotrop skelettmuskulatur på genipin modifierade PDMS 11. Därför känner vi övertygade om att ett minimalt modifierad version av detta protokoll har omfattande användbarhet för andra organsystem i den framtida utvecklingen av organ-on-a-chip-teknik.

Stress beräkningsmetod för vMTFs baserat på tidigare metoder 8 begränsas av den relativa kontraktilitet i vävnaderna och motsvarande skuren längd av de tunna filmerna. Om skär för länge, kommer filmer krypa på sig själva. Om klipps för kort, kommer filmer intend. Antingen fall förhindrar ordentlig analys av kontraktila egenskaper på grund av modellen begränsningar. Korrekt skärlängd bör förfinas genom upprepade försök. Genomförande av ett lasergravyr systemet, såsom i Agarwal et al., Kan förbättra repeterbarhet och kvalitet på MTF skära 28.

Förmågan att bättre rekapitulera nativ vävnadsstruktur och funktion i en tätt kontrollerad, fristående experimentellt system är en nyckel strävan inom området för bioteknik. Denna strävan har lett till utvecklingen av flera in vitro vävnads härmar och multifunktionella, men förenklad modell organ-on-a-chip, främja förståelsen av grundläggande fysiologiska och patologiska beteenden organsystem 29,30. Använda avsättning av genipin på PDMS substrat, har vi visat förlängd cellviabilitet och underhåll av vaskulär glatt muskelfunktion under två veckor. Detta är en betydande förbättring jämfört med tidigare tillverkning Techniques, vilket kan leda till delaminering av vävnader och celldöd efter 4 - 7 dagar i odling 19, och kan hjälpa utveckling av mer robusta artär-on-a-chip metoder. På grund av den kroniska karaktär flesta kärlsjukdomar, ger detta förskott ramen för en rad av framtida utredningar de kontraktila mekanismer som är involverade i specifika vaskulära sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip staining rack Electron Microscopy Sciences www.emsdiasum.com/ 72239-04
Microscope cover glass - 25 mm Fisher Scientific, Inc. www.fishersci.com 12-545-102
Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ #21458
1-butanol Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com 360465
Spincoater Specialty Coating Systems, Inc. www.scscoatings.com
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives (Dow Corning) www.ellsworth.com 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Fluorescent microbeads Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ 17151
Silicon wafers Wafer World, Inc. www.waferworld.com 2398
Photoresist  MicroChem Corp. www.microchem.com
Contact mask aligner Suss MicroTec www.suss.com
Developer MicroChem Corp. www.microchem.com
Tridecafluro-trichlorosilane UCT Specialties, Inc. www.unitedchem.com T2492
Surgical biopsy punch Integra LifeSciences Corp. www.miltex.com 33-31AA-P/25
Genipin Cayman Chemical www.caymanchem.com 10010622
1X phosphate buffered saline Mediatech, Inc. www.cellgro.com 21-031-CV
Fibronectin Corning, Inc. www.corning.com 356008
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com 15140-122
Umbillical artery smooth muscle cells Lonza www.lonza.com CC-2579
Tyrode's solution components Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com various
Stereomicroscope Zeiss www.zeiss.com 4350020000000000
Temperature-controlled platform Warner Instruments www.warneronline.com 641659; 640352; 641922
Endothelin-1 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com E7764-50UG
HA-1077 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com H139-10MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humphrey, J. D., Baek, S., Niklason, L. E. Biochemomechanics of cerebral vasospasm and its resolution: I. A new hypothesis and theoretical framework. Ann. Biomed. Eng. 35, 1485-1497 (2007).
  2. Hald, E. S., Alford, P. W. Smooth muscle phenotype switching in blast traumatic brain injury-induced cerebral vasospasm. Transl. Stroke Res. 5, 385-393 (2014).
  3. Olivetti, G., Anversa, P., Melissari, M., Loud, A. V. Morphometry of medial hypertrophy in the rat thoracic aorta. Lab. Invest. 42, 559-565 (1980).
  4. , Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
  5. Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
  6. Rhodin, J. A. G. Architecture of the vessel wall. Physiol. Rev. ed, B. erne,R. ., , American Physiology Society. (1979).
  7. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 19943-19948 (2011).
  8. Grosberg, A., Alford, P. W., McCain, M. L., Parker, K. K. Ensembles of engineered cardiac tissues for physiological and pharmacological study: heart on a chip. 11, 4165-4173 (2011).
  9. Alford, P. W., Nesmith, A. P., Seywerd, J. N., Grosberg, A., Parker, K. K. Vascular smooth muscle contractility depends on cell shape. Integr. Biol. (Camb). 3, 1063-1070 (2011).
  10. Win, Z., et al. Smooth muscle architecture within cell-dense vascular tissues influences functional contractility). Integr. Biol. (Camb). , (2014).
  11. Genchi, G. G., et al. Bio/non-bio interfaces: a straightforward method for obtaining long term PDMS/muscle cell biohybrid constructs). Colloid Surface B. 105, 144-151 (2013).
  12. Fessel, G., Cadby, J., Wunderli, S., van Weeren, R., Snedeker, J. G. Dose- and time-dependent effects of genipin crosslinking on cell viability and tissue mechanics - Toward clinical application for tendon repair. Acta Biomater. , (2013).
  13. Lima, E. G., et al. Genipin enhances the mechanical properties of tissue-engineered cartilage and protects against inflammatory degradation when used as a medium supplement. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 692-700 (2009).
  14. Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. J. Biomed. Mater. Res. A. , (2011).
  15. Satyam, A., Subramanian, G. S., Raghunath, M., Pandit, A., Zeugolis, D. I. In vitro evaluation of Ficoll-enriched and genipin-stabilised collagen scaffolds. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2012).
  16. Alford, P. W., et al. Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 12705-12710 (2011).
  17. Song, H., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. A microfluidic system for controlling reaction networks in time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, 768-772 (2003).
  18. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  19. Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. Long-term vascular contractility assay using genipin-modified muscular thin films. Biofabrication. 6, 045005 (2014).
  20. Han, M., Wen, J. K., Zheng, B., Cheng, Y., Zhang, C. Serum deprivation results in redifferentiation of human umbilical vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C50-C58 (2006).
  21. Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
  22. Volfson, D., Cookson, S., Hasty, J., Tsimring, L. S. Biomechanical ordering of dense cell populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15346-15351 (2008).
  23. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis. Hypertension. 38, 581-587 (2001).
  24. Kayembe, K. N., Sasahara, M., Hazama, F. Cerebral aneurysms and variations in the circle of Willis. Stroke. 15, 846-850 (1984).
  25. McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
  26. Weir, B., Grace, M., Hansen, J., Rothberg, C. Time course of vasospasm in man. 48, 173-178 (1978).
  27. McCain, M. L., Sheehy, S. P., Grosberg, A., Goss, J. A., Parker, K. K. Recapitulating maladaptive, multiscale remodeling of failing myocardium on a chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9770-9775 (2013).
  28. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).
  29. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).
  30. Meer, A. D., van den Berg, A. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse. Integr. Biol. (Camb). 4, 461-470 (2012).

Tags

Bioteknik substrat modifiering mikrofluidik protein nedfall vaskulära glatta muskelceller cellviabilitet polydimetylsiloxan genipin arteriell vävnadsteknik mekaniska egenskaper,
Mikrofluidumanordning Genipin avsättningsteknik för Extended kultur av Micropatterned Kärl Muskulös Thin Films
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, … More

Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films. J. Vis. Exp. (100), e52971, doi:10.3791/52971 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter