Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Microfluidic Genipin Nedfall Technique for Extended Culture of Micropatterned Vaskulær Muskuløse Thin Films

Published: June 26, 2015 doi: 10.3791/52971
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota

Introduction

Vaskulære sykdommer, slik som cerebral vasospasme 1,2, 3 hypertensjon, aterosklerose og 4, utvikles sakte, er typisk kronisk i naturen, og involverer dysfunksjonelle kraft-generering av vaskulære glatte muskelceller (VSMCs). Vi tar sikte på å studere disse sakte framdrift vaskulære dysfunksjoner bruker in vitro metoder med bedre kontroll av eksperimentelle betingelser enn i in vivo-modeller. Vi har tidligere utviklet vaskulære muskulære tynne filmer (vMTFs) for å måle funksjonell kontraktilitet av in vitro konstruert hjerte vev 5, men denne metoden har vært begrenset til relativt kortvarige studier. Her presenterer vi et substrat modifikasjon teknikk som utvider vår forrige vMTF teknikk for langsiktige målinger.

Mens endotelet er også viktig i den totale vaskulær funksjon, konstruert arteriell lameller gi en nyttig modellsystem for å vurdere endringer i vaskulærkontraktilitet under sykdomsprogresjon. For å konstruere et funksjonelt vaskulær sykdom vev modell, både strukturen og funksjonen av den arterielle lamellen, den grunnleggende kontraktile enheten av fartøyet, må rekapitulert med høy nøyaktighet. Arteriell lameller er konsentriske, langs omkretsen innrettede ark av kontraktile VSMCs adskilt av ark av elastin 6. Mikro utskrift av ekstracellulære matrix (ECM) proteiner på polydimethylsiloxane (PDMS) substrater har tidligere blitt brukt til å gi veiledning pekepinner for vev organisasjon å etterligne justert hjerte vev 5,7-10. Men vev mønstrede bruker mikro utskrift kan miste integritet etter 3-4 dager i kultur, noe som begrenser deres anvendelse i kroniske studier. Denne protokollen gir en løsning på dette problemet ved å erstatte tidligere mikrotrykketeknikker med en ny microfluidic deponering teknikk.

Genchi et al. Modifiserte PDMS substrater med genipin og found forlenget levedyktigheten til myocytter opp til en måned i kultur 11. Her bruker vi en lignende tilnærming til å utvide kultur mønstrede vaskulære glatte muskelceller i PDMS. Genipin, en naturlig hydrolytisk derivat av gardenia frukt, er en ønskelig kandidat for substrat modifikasjon på grunn av sin relativt lave toksisitet sammenlignet med lignende tverrbindingsmidler og den økende anvendelse som et biomateriale innen vevsreparasjon 12,13 og ECM modifikasjon 14, 15. I denne protokollen, er fibronektinet benyttes som en celle veiledning cue, som i tidligere mikrotrykkmetoder; imidlertid genipin avsatt på PDMS underlag før fibronektin mønster. Således, som celler nedbryter det mønstrede matrisen, kan nysyntetiserte ECM fra festet VSMCs binde til genipin PDMS-belagte substrat.

Denne protokollen benytter en mikrofluidavgivelsesanordning for to-trinns genipin og ECM deponering. Utformingen av microfluidic enhetsligner microcontact utskrift mønstre brukes for konstruert arteriell lameller i tidligere studier 16. Dermed forventer vi denne protokollen for å gi arteriell lameller ligner som vellykket rekapitulere de høyt justert in vivo struktur og kontraktile funksjon av arteriell lameller. Vi evaluerer også vev contractility å bekrefte at genipin er et egnet substrat modifikasjon sammensatt for langsiktig in vitro karsykdom modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: Målet med denne protokollen er å konstruere og bruke en vaskulær muskuløs tynn film (vMTF) med strukturen vist i figur 1 for å vurdere kontraktilitet ved langvarig kultur av vaskulære glatte muskelceller (VSMCs) på PDMS underlag. For å forlenge VSMC levedyktighet, vi utnytte kryssbinder sammensatte genipin. Underlaget for disse vMTFs er designet for å analysere vev kontraktilitet som er utviklet av Grosberg et al. 8 Andre vMTF metoder 5 mai også brukes, med subtile endringer i det fremlagte underlaget fabrikasjon protokollen.

1. underlag Fabrication

  1. Dekk Rengjøring
    1. Plasser 25 mm diameter dekkglass i et dekkglass farging rack. Plasser stativet inn i en stor beholder eller container (f.eks en tom 100 - 1000 mL pipette tips container.).
    2. Legg 70% etanol til beholderen å fordype glassene. Sonikere dem i minst 30 min. </ Li>
    3. Fjern dekk stativet fra etanoloppløsningen. Tillat glassene lufttørke ved å henge stativet i et sterilt kultur hette (for å hindre partikkel opphopning på dekkglass) for 1- 2 timer.
      Merk: Glassene må være helt tørt før du følgende trinn.
  2. Poly (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Strip Isolation på Coverslip
    1. Ved hjelp av klebebånd, tape av sidene av et renset dekkglass, og etterlater en eksponert bånd sentrert på dekkglass (figur 1A). Endre bredden på denne eksponert stripe basert på søknad og / eller microfluidic design.
    2. Mark kantene av båndstriper på dekkglass ved hjelp av en lab markør for senere bruk (figur 1A).
    3. Skjær rundt omkretsen av dekkglass for å frigjøre fra fatet (figur 1A, stiplet rød linje).
  3. Poly (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Coating
    1. Ved hjelp av en analysevekt, veier 1 g PIPAAM pulver. Ikke bruk upolymerisert N-iso-propylacrylamide, som er et kreftfremkallende.
    2. Overfør PIPAAm til et 50 ml sentrifugerør. Tilsett 10 ml av 1-butanol i et kjemisk hette for å gi en 10% vekt / volum løsning. FORSIKTIG: Flammepunktet for 1-butanol er 37 o C. Lagre den resulterende løsning i en brennbar skap og unngå oppvarming.
    3. La PIPAAm å oppløse i 10 min. Hvis pulveret er fortsatt synlig, bland løsningen ved hjelp av en vortex-mikser til alt pulveret er oppløst.
      Merk: Følgende trinn krever bruk av en spin coater. For hver dekk:
    4. Plasser tapet dekk på spin coater chuck med pinsett.
    5. Overfør 150 ul av PIPAAm løsning på dekkglass ved å plassere dråper langs eksponert glass i midten av dekkglass. Sikre full dekning av det utsatte området.
    6. Spin strøk PIPAAm bruke følgende oppskrift:
      1. Rampe 10 sek til 3000 rpm. Dvele i 5 sek.
      2. Ramp 10 sek til 6,000 rpm. Dvele for 60 sek.
      3. Rampe 10 sek til 3000 rpm. Dvele i 5 sek.
    7. Plasser dekk inn en overbygd petriskål med PIPAAm vendt opp. La det lufttørke i minst 15 min.
    8. Fjern forsiktig klebebåndet fra alle dekkglass, slik at hele dekk eksponert med et tynt lag av PIPAAm belegg i et midtstripen.
  4. PDMS Coating
    1. Miks og degas 15 g PDMS i en 10: 1 basen: kryssbinder ratio. Legg 7-8 dråper av sonikerte 0,2 um fluorescerende mikrokuler før blanding. Dekk kopp PDMS med aluminiumsfolie når den ikke er i bruk for å hindre at støv og andre partikler forurenser de PDMS.
      Merk: Følgende trinn krever bruk av en spin coater. For hver dekk:
    2. Plasser en PIPAAm-belagt dekkglass på spin coater chuck med pinsett.
    3. Overfør PDMS på dekkglass, som dekker i det minste en tredjedel av dekkområdet.
    4. Spin strøk ved hjelp av følgende recipe:
      1. Rampe 5 sek til 500 rpm. Dwell 5 sek.
      2. Rampe 5 sek til 1000 rpm. Dwell 5 sek.
      3. Rampe 10 sek til 3000 rpm. Dwell 10 sek.
      4. Rampe 10 sek til 4000 rpm. Dwell 60 sek.
      5. Rampe 10 sek til 2000 rpm. Dwell 15 sek.
      6. Rampe 10 sek til 1000 rpm. Dwell 10 sek.
      7. Rampe 5 sek til 500 rpm. Dwell 5 sek.
    5. Plasser dekk inn en overbygd petriskål med PDMS vendt opp. Spill den tiden da dekk var spin-belagt. Hold styr på tiden tilknyttet hver dekk gjennom hele forsøket for senere bruk ved fastsettelse av PDMS underlaget tykkelse.
    6. Sett petriskål som inneholdt objektglassene i en 90 ° C ovn i minst 1,5 time for å sikre riktig PDMS herding. Hvis en ovn ikke er tilgjengelig, la Dekk herde i minst 48 timer ved romtemperatur.
    7. Fjern glassene fra ovnen og lagre dem i en mørk skuff til den er klar til bruk.
    8. Sett til side hver fjerde dekk feller senere måling av substratet tykkelse, som en funksjon av spinnbelegging tid, med et profilometer.

2. mikrofluid Mønstring for Engineering Vev

  1. Fabrikasjon av microfluidic enheter
    1. Design av Tissue microfluidic fotomaske
      1. Bruk noen passende dataassistert konstruksjon program for å designe microfluidic mønstre. For arteriell lameller sammensatt av menneskelige navlestreng blod vaskulære glatte muskelceller, bruke et vekslende mønster på 10 mikrometer kanaler med 10 mikrometer vegger.
      2. Bruk binære kanal forgrening hvis mulig 17, men andre forgrening utførelser kan anvendes. Minske bredden og lengden av kanaler for hver iterasjon inntil forgrenings å oppnå det ønskede vevet mønster mellomrom (vegger og kanaler, figur 1B).
      3. Utforme innretningen for å ha et enkelt innløp for overflatebehandling løsning plassering og et enkelt utløp for påføring av vakuum.
      4. Fabricate en fotomaske som inneholder mikrofluid utformingen (e), som tidligere beskrevet 18.
    2. Fotolitografisk Wafer Fabrication
      Merk: Utfør fotolitografi i en egnet renrom eller lignende anlegg. For å gjøre silisiumskiver med mønstre for myk litografisk fabrikasjon av vev microfluidic enheter (~ 20 - 25 mikrometer kanal høyde) ved hjelp av fotolitografi:
      1. Rens en silikonplaten i aceton, metanol og isopropylalkohol i 1 minutt hver. Tørk wafer med en nitrogen-pistol.
      2. Prebake skiven på en varm plate i 5 minutter ved 115 ° C for å fjerne overskudd av fuktighet.
      3. Spin belegge wafer med SU-8 3025 fotoresist ved hjelp av følgende oppskrift for å gi gir 20 - 25 mikrometer i høyde:
        1. Rampe 5 sek til 500 rpm. Dwell 5 sek.
        2. Rampe 15 sek til 4000 rpm. Dwell 15 sek.
      4. Soft bake skiven på en varm plate ved 95 ° C i 15 min.
      5. Legg i en fotomaske, og utsetter tHan wafer for 16 sek ved hjelp av en vakuumkontakt program på en kontakt maske aligner.
      6. Hard bake skiven på en varm plate ved 95 ° C i 4 min.
      7. Utvikle wafer for 6 min i utvikler. Deretter vaske wafer ganger i 2 sekunder på fersk utvikler og skyll wafer med isopropylalkohol.
      8. Silanate den mønstrede skiven O / N ved å plassere 2-3 dråper tridecafluoro-triklorsilan i en tom tallerken i en vakuum-eksikator. Prop skiven opp ved hjelp av petriskåler, slik at både bunnen og toppen av skiven er utsatt for.
        FORSIKTIG: Tridecafluro-triklorsilan er en brennbar og etsende væske. Riktig personlig verneutstyr og lokal avtrekks er nødvendig for bruk.
    3. Tissue microfluidic Device Fabrication
      1. Plasser en silanert, mønstret wafer funksjonssiden opp i en petriskål.
      2. Miks og degas 100 g PDMS med en 10: 1 basen: kryssbinder ratio. Hell PDMS i formen, helt og jevnt dekker wafer.
      3. Sett fatet i en vakuumeksikator inntil alle luftbobler fjernes fra uherdet PDMS, ca 30 min. Kurere PDMS i fatet ved 90 ° C i minst 1,5 time. Tid og temperatur kan justeres som diktert av føringer fremstillingen for å oppnå en fullstendig herding.
      4. Når PDMS er herdet, klipp ut PDMS rundt wafer med et barberblad og forsiktig slipper PDMS-dekket wafer fra fatet. Fjern overflødig PDMS under wafer og sakte skrelle PDMS vekk fra toppen av wafer.
      5. Plasser PDMS disk funksjonssiden opp i en ren tallerken og lagre wafer vekk fra lys etter bruk.
      6. Skjær vekk det overskytende PDMS fra rundt mønstre ved hjelp av et barberblad. Cut enheter i rektangulære former (figur 1C) for å lette peeling av enheten fra substrater i senere trinn. Presise kutt er ikke nødvendig, så lenge det finnes rikelig med plass til innløpet, uttak, og vevet mønster området (figur 1C).
      7. Punchinnløps- og utløpshullene (figur 1C) ved hjelp av et 1 mm kirurgisk biopsi slag.
  2. Microfluidic Device Nedfall
    Merk: I denne protokollen blir mikrofluidleverings anvendes for å avsette mønstrede genipin, nøkkelen tverrbindingsmiddel for langvarig dyrkning vev, så vel som fibronektin. Trinn før penicillin / streptomycin sterilisering (2.2.3) trenger ikke å skje i sterile forhold, men å begrense forurensning og støv er oppmuntret over hele protokollen. Alle trinn oppstår etter dekk sterilisering med penicillin / streptomycin (2.2.3) bør utnytte steril teknikk. Merk: Denne delen av protokollen må startes en dag før celle seeding.
    1. Substrat og mikrofluid Device Forberedelse
      1. Sonikere microfluidic enhetene i 70% etanol i minst 30 min.
      2. Tørk sonikerte microfluidic enheter ved hjelp av trykkluft eller nitrogen, og plassere dem i en petriskål with kanal har forsiden opp for å hindre unødig slitasje på funksjoner.
      3. Plassere opptil 10 vMTF underlaget Dekk i en UVO renere (dekselet fjernet på tallerken slik at overflaten blir funksjon) i 8 min.
      4. Fjern de UVO-behandlede Dekk, og plasser microfluidic enheter funksjonssiden ned på hver slip en om gangen (orientering bør være tilsvarende figur 1C). Trykk hardt ned på enhetene for å sikre en tett forsegling til PDMS-belagte dekkglass.
    2. Nedfall av Genipin og Fibronectin
      1. Tilbered en 5 mg / ml genipin oppløsning ved tilsetning av 1 ml sterilt DDH 2 O til 5 mg beholder lyofilisert genipin. Bland løsningen ved hjelp av en vortex-blander. Sett til side ved RT i minst 30 min.
        Merk: pulver er vanskelig å oppløse ved romtemperatur, så repeterende blanding i minst ett minutt er ofte nødvendig.
      2. Raskt, plassere en dråpe av 70% etanol ved innløpet til hver enhet for enhet priming. Merk: ethmetanol tilsettes bør veke gjennom enhetene.
      3. Etter 5-10 minutter, forsiktig suge overflødig etanol ved innløpet, straks å erstatte den med 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) ved innløpet. Fra dette tidspunktet, må du huske å ikke tillate innløpet til å bli helt tørr for å unngå innføring av luft til enheten.
      4. Plasser en vakuum aspiratorspiss ved utløpet fra hver enhet. Tegn 1X PBS gjennom enheter å skylle etanol unna. Igjen en liten mengde av 1 x PBS ved innløpet. Merk: Hvis innløpet vises nesten tørr, tilsett mer 1X PBS.
      5. Avsuge overskytende 1X PBS, slik at bare en liten mengde forblir i innløpet før påføring av genipin løsning.
      6. Plassere 60 ul av 5 mg / ml genipin oppløsning ved hvert innløp (figur 1D). Tegn genipin løsning gjennom enhetene ved å plassere et vakuum aspiratorspiss ved utløpet (figur 1D). Pass på å ikke trekke alle av løsningen gjennom, og etterlater en liten mengde av løsningen ved innløpet.
      7. Sted dråper (ca. krone-størrelse) av 1 x PBS ved både innløp og utløp for å opprettholde fukting under inkubering. Flytt rett inneholder enheter til en fuktet ovn eller inkubator (sterilt miljø er ikke nødvendig) satt til 37 ° C, og inkuberes i 4 timer. Skålen behøver ikke å være dekket.
      8. I løpet av inkubasjonen, resuspender fibronektin til en konsentrasjon på 50 ug / ml i steril DDH 2 O på is i minst 30 minutter før påføring på mikrofluidenhet.
      9. Etter inkubasjon av genipin, aspirer all gjenværende 1X PBS på enhets uttak. Fortsett å bruke et vakuum aspirator ved hvert uttak enhet, trekke gjennom de rester 1X PBS ved innløpet.
      10. Plasser 100 ul av 50 ug / ml fibronektin oppløsning ved hvert innløp, at det til en minimal mengde av gjenværende 1X PBS ved innløpet (figur 1D).
      11. Tegn fibronektinet løsning gjennom enheter ved hjelp av et vakuum aspiratorspiss ved utløpet (
      12. Flytt avdekket fatet inneholder enheter til en ovn eller inkubator satt til 37 ° C, og inkuber i 24 timer. Merk: fibronektin trinnet krever ikke fukting av innløp og utløp med 1X PBS. Den gjenværende pool av fibronektin ved innløpet vil tørke ut. Dette forventes.
    3. Sterilisering og klargjøring for Cell Seeding
      1. Forbered en løsning av penicillin / streptomycin for sterilisering av mønstrede vMTF Dekk. Tilsett 5 ml penicillin / streptomycin (10 000 enheter / ml; 10 000 ug / ml) til 500 ml steril 1X PBS.
      2. Sett fatet inneholder enhetene i en steril biosikkerhet hette.
      3. Fjern forsiktig enheter fra glassene ved sakte peeling enheten et hjørne, mens lett å ta tak i dekkglass i andre hånden.Merk: Dette trinnet krever øvelse for å redusere dekk skader i fjerningen. Et alternativ er å bruke en sprøyte til å injisere 1X PBS ved innløp og / eller utløp for å hjelpe til utløserenheten.
      4. Plasser glassene i sterile seks-brønns retter. Tilsett minst 5 ml penicillin / streptomycin-løsning til hver brønn. Plasser retter i en steril inkubator ved 37 ° C i minst 30 min.
      5. Etter sterilisering, aspirer penicillin / streptomycin løsning, og frø glassene med dyrkede humane umbilical artery vaskulær glatt muskulatur cells19 (figur 1D). Seeding konsentrasjon for VSMCs er ~ 80 000 celler per cm 2. For å redusere antall celler som er nødvendig for hver prøve ved å bruke et reduksjons å redusere seeding området. Et eksempel på en redusering er kuttet toppen av en 15 ml konisk rør festet til dekkglass med steril vakuumfett før såing.
      6. Inkuber seeded Dekk i en steril inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 (Figur 2A-B).
    4. Langsiktig vMTF Tissue Culture
      1. En dag etter seeding, fjerne celle medium og reduksjonsgir. Skyll vev med 1X PBS. Tilsett 4 ml serumfritt celle-medium for å indusere en kontraktil fenotype i VSMCs 20.
      2. Gjenta 1X PBS skylling og tilsetning av friskt serumfritt medium annenhver dag etter ønske for langtidskultur.

Figur 1
Figur 1. microfluidic Protein Levering Device. (A) tapet av dekkglass for PIPAAm belegg. Rød stiplet sirkel: kutte banen for å slippe dekkglass (B) Representant AutoCAD tegning av vev microfluidic maske mønster.. Innfelt: Detalj av binære forgrening til Alternating 10 mikrometer x 10 mm vev mønster. (C) Plassering av microfluidic enhet på et dekk underlaget med innløp og utløp indikert. (D) Skjematisk av microfluidic protein mønster og levering. Fra venstre mot høyre: scanning elektronmikroskopbilde av microfluidic kanaler (skala bar: 50 mikrometer); Detaljert skjema av metoden for proteinavsetning; Immunhistokjemi farget fibronektin (skala bar: 50 mikrometer); Cell seeding med vaskulære glatte muskelceller. (E) Skjematisk av fabrikkerte vev. 1 st innfelt: Detalj av lagdelt konstruksjon. 2. innfelt: Detalj av genipin modifikasjon av PDMS underlaget etter microfluidic deponering. © IOP Publishing. Reproduseres og / eller modifisert med tillatelse. Alle rettigheter reservert. 19 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

3. Tissue Funksjonsanalyse med vMTF kontraktilitet analysen

Merk: MTF contractility analysen som presenteres her er modellert etter teknikken utviklet i Grosberg et al 8.

  1. vMTF kontraktilitet Experiment
    1. Plasser en vevsprøve i en 100 mm tallerken. Legg sterile 1X Tyrodes solution8 ved pH 7,4 oppvarmet til 37 ° C for å dekke prøven.
    2. Bruke et barberblad for å lage flere parallelle kutt vinkelrett på PIPAAm kanten. Gjøre kutt på en måte som gir større vevssnitt som vil være vMTFs (med bredde ~ 2 mm) alternerer med tynne strimler (figur 3A, side kutt). For å gjøre rene kutt, plasserer et barberblad i kontakt med prøven og fast drar til siden.
    3. Roter fatet 90 ° og gjøre to rette, parallelle kutt i midten av vev, parallelt med stripe av PIPAAm (figur 3A, slutten kutt). Fjern og kast den løse stripe av vev mellom disse kutts og de tynne strimler i mellom vMTFs (kutt i forrige trinn) for å hindre tilstøtende filmer fra å ta kontakt.
    4. Tillat prøven å hvile ved romtemperatur i 10 minutter, eller inntil all PIPAAm er oppløst. Merk: Hvis PIPAAm forblir i fremtidige trinn, kan prøven bli returnert til skjære retten til å oppløse rest PIPAAm. En mild skraping av undersiden av vMTF kan hjelpe i PIPAAm fjerning, etter behov.
    5. Plasser en liten prikk av vakuum fett i en ren 35 mm petriskål. Tilsett 5 ml friskt, sterilt 1X Tyrodes oppløsning ved 37 ° C. Overfør dekkglass med cut filmer fra 100 mm fatet til 35 mm fatet, og trykk på vakuum fett for å hindre bevegelse av dekkglass.
    6. Sett fatet i et temperaturkontrollert plattform på stereo scenen.
    7. Capture time-lapse overført og lysrør bilder med ønskede intervaller (f.eks., 30 sek) gjennom hele behandlingen analysen.
    8. Serielt behandle vMTFs med 50 nM endotelin-1 i 20 minutter (indusert sammentrekning) og 100 uM HA-1077 i 30 minutter (tissue avslapning). Legg konsentrerte oppløsninger av hver behandling til den eksperimentelle skål inneholdende 5 ml sterilt 1X Tyrodes oppløsning ved spesifiserte tidspunkter, hvilket ga det ønskede behandlingskonsentrasjonen i 5 ml volumet. Gjør behandlings Tilgang i intervallet mellom time-lapse bilde oppkjøp for å unngå å fange pipette i bilder.
  2. vMTF kontraktilitet Analyse
    1. Bruke Dekk avsatt i 1.4.8, måle PDMS underlaget tykkelse med en profilometer21. Lag en tykkelse vs spin tidskurven for hvert sett av dekk. Bruk av denne kurve for å estimere vMTF tykkelse for hver dekk brukes i en kontraktilitet eksperiment.
    2. Mål vMTF projeksjons lengder for hvert tidspunkt under forsøket, og beregne den tilhørende krumningsradier (figur 3B) ved anvendelse av metoder som tidligere er rapportert 8.
    3. Beregn vMTF stress på hver gang point å bruke tidligere vMTF metoder fem.
      Merk: Bruk den estimerte vMTF tykkelse beregnet fra 3.2.1. Mål VSMC tykkelse bruker konfokale bilder, som tidligere rapportert ni. Skaff PDMS Youngs modul fra selskap datablad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det primære målet med dette arbeidet var å øke levedyktigheten til micropatterned VSMCs på hydrofobe PDMS underlag. Dette ble oppnådd ved å inkorporere et mikrofluidleveringssystem for å avsette mønstrede genipin og fibronectin på PDMS (figur 1). Nedfall av ECM proteiner ved hjelp av mikrofluid levering ga high fidelity overføring av kanalen mønster med blanke PDMS mellom linjene genipin og fibronectin (figur 1D). Vedlagte celler (figur 1E) skjema sammenflytende monolag ligne in vivo strukturen av arteriell lameller (figur 2), i likhet med forrige mikrotrykkmetoder 5,10,16. Disse vev ga responsive, kontraktile konstruksjoner, hvis spenning ble målt ved bruk vMTF teknologi (figur 3).

Kvalitativ vurdering av vev levedyktighet i løpet av to uker viste minimal forverring på genipin-modified substrater (Figur 2A). Tissue samløpet og justering ble opprettholdt over to uker (Figur 2B, 2C og 2D). To viktige spenningsverdier ble beregnet for hver vMTF:. 1) basal tone og 2) induserte kontraktilitet (figur 3C og 3D) Basal tone et belastningen opprettholdes ved ikke-stimulerte VSMCs ved likevekt. Indusert kontraktilitet er den ekstra stress indusert ved stimulering med endotelin-1. Både basal tone og indusert contractility viste konsistent atferd over to-ukers tid selvfølgelig, demonstrerer vasoaktive vev hele (Figur 3E og 3F). Den lille nedgang i vev kontraktilitet ved slutten av analysen er et direkte resultat av det reduserte antall celler som utgjør vev, ettersom serum-sultet VSMCs ikke sprer 19. Tilsetningen av et minimalt nivå av basal serum til kulturmediet kan lindre dette resultat i det videre arbeidet.

Figur 2. Vev være levedyktig og lykkes Mimic in vivo arteriell Plate Struktur for to uker på Genipin-modifiserte Underlag (A) bilder Representative fase kontrast av vevet på offer tidspunkter i løpet av to uker (skala bar: 200 mikrometer).. (B) Representative immunhistokjemi bilder av vev fabrikkert på genipin modifisert underlag fast på dag 1, dag 4, og Dag 10 etter serum sult (grønn: f-aktin filamenter, blå: kjerner (vist å etablere tilstedeværelse av celler), skala bar .: 100 mikrometer) (C) Prosent samløpet målt ved f-aktin dekning (feilfelt: standard feil, n = 3-7) (D) Tissue justerings målt ved f-aktin orientering for parameter (OOP) 22 (feilfelt. : standardfeil, n = 3 - 7). © IOP PUBLISHIng. Reproduseres og / eller modifisert med tillatelse. Alle rettigheter reservert. Alle rettigheter reservert. 19 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Tissue kontraktilitet opprettholdes i løpet av to uker. (A) Representant vMTF skjæring ordningen. (B) Skjematisk av cut vMTF. Etter avkjøling under 32 ° C, PIPAAm oppløses, slippe vMTF. Stress i det aktive cellelaget fører til at passive PDMS lag å bøye. Måling av projeksjon lengde kan omdannes til en krumningsradius i henhold til fremgangsmåte i Grosberg et al. 8 er krumningsradius som brukes til å beregne den gjennomsnittlige tverrsnitts spenning i vevet. (C) sekvensiell overføres light bilder av representative contractility assay (Skala: 1 mm). Vev nå likevekt, blir stimulert med endotelin-1, deretter behandlet med HA-1077 for å tillate fullstendig avslapning. Bunn.: Skjematisk fremstilling av sideriss av idealiserte vev i løpet av analysen (D) Representative spenning kurve for kontraktilitet analysen. To viktige spenningsverdier beregnes. Basal tone er forskjellen mellom likevektsspenningstilstand og avslappet spenningstilstand. Induced kontraktilitet er endringen i stress fra likevektstilstand til endotelin-1 stimulert tilstand (E) Basal tone (feilfelt: standard feil, n = 5 - 12) (F) Induced kontraktilitet (feilfelt:.. Standard feil, n = 5 - 12). © IOP Publishing. Reproduseres og / eller modifisert med tillatelse. Alle rettigheter reservert. 19 Klikk her for å se en større versjon avdette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenterer vi en protokoll som bygger på tidligere utviklet vMTF teknologi, slik at utvidet eksperiment ganger mer typisk for kroniske karsykdom trasé 1,23,24. For å oppnå dette, micropattern vi genipin, som tidligere har vist seg å gi langvarig funksjonalisering av PDMS substrater 11, ved anvendelse av en mikrofluidavsetningsteknikk for å gi Konstruert arteriell lameller med forbedret vaskulært vev levedyktighet for bruk i MTF kontraktilitet eksperimenter. McCain et al. utviklet en alternativ micromolded gelatin hydrogel substrat for utvidet kultur av konstruerte hjertevev i flere uker i et beslektet MTF modell 25.

Denne protokollen ga vMTFs som med hell etterlignet arteriell lamell struktur (figur 2) og funksjon (figur 3) i løpet av to uker. Mens vellykket gjennomføring av present protokollen gir de ønskede result utvidede kultur ganger for sykdoms relevant utdanning (for eksempel de patologiske virkningene av cerebral vasospasme som varer i opptil 14 dager 26), noen vanlige fallgruver oppstår. Gjentatt bruk av PDMS microfluidic enheter resulterer i skadelig skader som kan føre til delvis eller fullstendig blokkering av avdelinger i enheten. Derfor må nye enheter brukes for hvert forsøk. Et annet problem, mens ikke så vanlig, er uventet og inkonsekvent delaminering av vev. Disse hendelsene syntes å være tilfeldig i naturen, og i sjeldne forekomst. Ved observasjon, vev danne en Arch eller lumen-lignende struktur før dela. Vi har også observert denne oppførselen i vev fabrikkert ved hjelp av mikrotrykketeknikker. Følgelig tror vi at dette problemet å være et resultat av enten over seeding eller en fenotypisk bryter i de dyrkede VSMCs som resulterer i unormal oppførsel og ikke et direkte resultat av de fremstillingsmetoder som er presentert her.

Den nåværende microfluidic utforming krever lineære strømningsmønster og som sådan er begrenset til vev med innretting i én hovedretning. Søknad til vev som krever mer komplisert mønster, slik som "murvegg" mønster av ventrikulær myokardial struktur 27, vil kreve mer utførlig mikrofluid design. Vi har ikke sådd genipin-modifiserte substrater med andre celletyper. Imidlertid Genchi et al. viste forlenget levedyktigheten til isotropisk skjelettmuskulatur på genipin modifisert PDMS 11. Dermed føler vi oss trygge på at en minimal-modifisert versjon av denne protokollen har utbredt anvendelse til andre organsystemer i den fremtidige utviklingen av organ-on-a-chip teknologi.

Beregningen spenning fremgangsmåte for vMTFs basert på tidligere metoder 8 er begrenset av den relative kontraktilitet i vevene, og tilsvarende klippet lengde av de tynne filmer. Hvis kuttet for lenge, vil filmene krøller på seg selv. Hvis kuttet for kort, vil filmene ikke værend. Begge tilfelle hindrer riktig analyse av kontraktile egenskaper på grunn av modellere begrensninger. Riktig kuttelengde bør raffineres gjennom gjentatte eksperimenter. Implementering av et laserinngraveringssystem, som i Agarwal et al., Kan forbedre repeterbarheten og kvaliteten av MTF skjære 28.

Evnen til å bedre rekapitulere opprinnelige vevet struktur og funksjon i en tett kontrollert, selvstendig eksperimentelt system er en nøkkel streben innen bioteknologi. Denne jakten har ført til utvikling av flere in vitro vev ligner og multi-funksjonelle, men forenklet modell organer-on-a-chip, fremme forståelse av grunnleggende fysiologiske og patologiske atferd av organsystemer 29,30. Ved hjelp av avsetning av genipin på PDMS substrater, har vi demonstrert forlenget celleviabilitet og vedlikehold av vaskulær glatt muskelfunksjon i løpet av to uker. Dette er en betydelig forbedring fra forrige fabrikasjon techniques, som kan føre til delaminering av vev og celledød etter 4-7 dager i kultur 19, og kan hjelpe til å utvikle mer robuste arterie-på-en-brikke metoder. På grunn av den kroniske natur fleste vaskulære sykdommer, gir dette forhånd rammene for en rekke fremtidige undersøkelser i de kontraktile mekanismene som er involvert i konkrete vaskulære sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip staining rack Electron Microscopy Sciences www.emsdiasum.com/ 72239-04
Microscope cover glass - 25 mm Fisher Scientific, Inc. www.fishersci.com 12-545-102
Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ #21458
1-butanol Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com 360465
Spincoater Specialty Coating Systems, Inc. www.scscoatings.com
Polydimethylsiloxane (PDMS) Ellsworth Adhesives (Dow Corning) www.ellsworth.com 184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Fluorescent microbeads Polysciences, Inc. www.polysciences.com/ 17151
Silicon wafers Wafer World, Inc. www.waferworld.com 2398
Photoresist  MicroChem Corp. www.microchem.com
Contact mask aligner Suss MicroTec www.suss.com
Developer MicroChem Corp. www.microchem.com
Tridecafluro-trichlorosilane UCT Specialties, Inc. www.unitedchem.com T2492
Surgical biopsy punch Integra LifeSciences Corp. www.miltex.com 33-31AA-P/25
Genipin Cayman Chemical www.caymanchem.com 10010622
1X phosphate buffered saline Mediatech, Inc. www.cellgro.com 21-031-CV
Fibronectin Corning, Inc. www.corning.com 356008
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Inc. www.lifetechnologies.com 15140-122
Umbillical artery smooth muscle cells Lonza www.lonza.com CC-2579
Tyrode's solution components Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com various
Stereomicroscope Zeiss www.zeiss.com 4350020000000000
Temperature-controlled platform Warner Instruments www.warneronline.com 641659; 640352; 641922
Endothelin-1 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com E7764-50UG
HA-1077 Sigma-Aldrich www.sigmaaldrich.com H139-10MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humphrey, J. D., Baek, S., Niklason, L. E. Biochemomechanics of cerebral vasospasm and its resolution: I. A new hypothesis and theoretical framework. Ann. Biomed. Eng. 35, 1485-1497 (2007).
  2. Hald, E. S., Alford, P. W. Smooth muscle phenotype switching in blast traumatic brain injury-induced cerebral vasospasm. Transl. Stroke Res. 5, 385-393 (2014).
  3. Olivetti, G., Anversa, P., Melissari, M., Loud, A. V. Morphometry of medial hypertrophy in the rat thoracic aorta. Lab. Invest. 42, 559-565 (1980).
  4. , Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
  5. Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
  6. Rhodin, J. A. G. Architecture of the vessel wall. Physiol. Rev. ed, B. erne,R. ., , American Physiology Society. (1979).
  7. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 19943-19948 (2011).
  8. Grosberg, A., Alford, P. W., McCain, M. L., Parker, K. K. Ensembles of engineered cardiac tissues for physiological and pharmacological study: heart on a chip. 11, 4165-4173 (2011).
  9. Alford, P. W., Nesmith, A. P., Seywerd, J. N., Grosberg, A., Parker, K. K. Vascular smooth muscle contractility depends on cell shape. Integr. Biol. (Camb). 3, 1063-1070 (2011).
  10. Win, Z., et al. Smooth muscle architecture within cell-dense vascular tissues influences functional contractility). Integr. Biol. (Camb). , (2014).
  11. Genchi, G. G., et al. Bio/non-bio interfaces: a straightforward method for obtaining long term PDMS/muscle cell biohybrid constructs). Colloid Surface B. 105, 144-151 (2013).
  12. Fessel, G., Cadby, J., Wunderli, S., van Weeren, R., Snedeker, J. G. Dose- and time-dependent effects of genipin crosslinking on cell viability and tissue mechanics - Toward clinical application for tendon repair. Acta Biomater. , (2013).
  13. Lima, E. G., et al. Genipin enhances the mechanical properties of tissue-engineered cartilage and protects against inflammatory degradation when used as a medium supplement. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 692-700 (2009).
  14. Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. J. Biomed. Mater. Res. A. , (2011).
  15. Satyam, A., Subramanian, G. S., Raghunath, M., Pandit, A., Zeugolis, D. I. In vitro evaluation of Ficoll-enriched and genipin-stabilised collagen scaffolds. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2012).
  16. Alford, P. W., et al. Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 12705-12710 (2011).
  17. Song, H., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. A microfluidic system for controlling reaction networks in time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, 768-772 (2003).
  18. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  19. Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. Long-term vascular contractility assay using genipin-modified muscular thin films. Biofabrication. 6, 045005 (2014).
  20. Han, M., Wen, J. K., Zheng, B., Cheng, Y., Zhang, C. Serum deprivation results in redifferentiation of human umbilical vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C50-C58 (2006).
  21. Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
  22. Volfson, D., Cookson, S., Hasty, J., Tsimring, L. S. Biomechanical ordering of dense cell populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15346-15351 (2008).
  23. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis. Hypertension. 38, 581-587 (2001).
  24. Kayembe, K. N., Sasahara, M., Hazama, F. Cerebral aneurysms and variations in the circle of Willis. Stroke. 15, 846-850 (1984).
  25. McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
  26. Weir, B., Grace, M., Hansen, J., Rothberg, C. Time course of vasospasm in man. 48, 173-178 (1978).
  27. McCain, M. L., Sheehy, S. P., Grosberg, A., Goss, J. A., Parker, K. K. Recapitulating maladaptive, multiscale remodeling of failing myocardium on a chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9770-9775 (2013).
  28. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).
  29. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).
  30. Meer, A. D., van den Berg, A. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse. Integr. Biol. (Camb). 4, 461-470 (2012).

Tags

Bioteknologi substrat modifikasjon MicroFluidics protein avsetning vaskulære glatte muskelceller celle levedyktighet polydimethylsiloxane genipin arteriell tissue engineering mekaniske egenskaper,
Microfluidic Genipin Nedfall Technique for Extended Culture of Micropatterned Vaskulær Muskuløse Thin Films
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, … More

Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films. J. Vis. Exp. (100), e52971, doi:10.3791/52971 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter