Introduction
Den menneskelige hjerne består af en anslået 85 milliarder neuroner og en yderligere 85 milliarder ikke-neuronale celler, herunder glia 1. For størstedelen af de seneste 100 år neuroforskere har fokuseret overvejende på neuronal celle befolkning, at tro gliaceller være lidt mere end passive støtte celler, der er fastsat strukturstøtte til neuronerne - dermed den græske etymologi af 'glia "oversat til engelsk som "lim". Imidlertid for nylig er det blevet mere klart, at neuronale-glia interaktioner kan være langt mere grundlæggende til grundlæggende aspekter af neurobiologi, neurofysiologi og tilblivelsen og progression af mange neurodegenerative sygdomme. Cerebellumgranulaceller (CGC), den mest rigelige homogen neuronal population i den menneskelige hjerne, dominerer cerebellum og udgør mere end 90% af dets cellulære bestanddele. Derfor er disse celler blevet anvendt i udstrakt grad in vitro som et modelsystem til tHan studerer af neuronal udvikling, funktion og patologi 2-6.
Imidlertid CGC kulturer indeholder stadig mikroglia og andre glia i velsagtens signifikante proportioner. Som et resultat heraf kan CGC data putativt udviser direkte neuronale reaktioner på forskellige celletyper behandlinger faktisk opstår - delvis eller i alt - fra den indirekte sekundær reaktion af tilstødende glia i kulturen. For at vurdere dette, vi selektivt elimineret mikroglial fra CGC neuronale kulturer ved hjælp af L-leucinmethylester (LME). LME er en lysomotropic agent oprindeligt brugt til selektivt at ødelægge makrofager 7, og er siden blevet brugt til også selektivt nedbryder microglia fra neural, astrocyt, og blandede glial kulturer 8,9,10. LME internaliseres af makrofager og mikroglia, hvor det forårsager lysosomal forstyrrelser og efterfølgende apoptose 13,14. Makrofager og mikroglia er karakteristisk rig i lysosomer, får dem til at være particularly sårbar ved eksponering for LME-behandling. Denne protokol giver en kraftig, men alligevel enkel og nem måde at fastslå bidrag mikroglia i forsøg udnytte CGC og andre neuronale / gliale dyrkningssystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgene beskrevet heri, blev udført i overensstemmelse med De Forenede Kongerige Dyr (Videnskabelige procedurer) Act of 1986.
1. Fremstilling af instrumenter, Kultur Medier og fade
- Forbered to rustfrit stål laboratorium dissekere saks og to rustfrit stål laboratorium pincet. Autoklaver alle instrumenter og sted i en kultur hætte O / N under ultraviolet lys (UV) lys til sterilisering.
- Gøre 500 ml minimum essentielt medium (MEM) dyrkningsmedium (10% føtalt bovint serum [FBS], 20 mM KCI, 25 mM NaHCO3, 30 mM D-glucose, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 6 pg / ml ampicillin) og filtreres sterilisere. Opbevar ved 4 ° C i flere måneder.
- Forbered 24 såvel kultur plader indeholdende 14 mm, nummer 1 tykkelse dækglas. Autoklaver dækglassene og pels i 100 mg / l poly-d-lysin (PDL) som tidligere beskrevet 3. UV-lys sterilisere O / N.
2. Udarbejdelse af CGC Kultur Solutions
- Forberede 'opløsning A' (100 ml) i autoklaveret, UV-lys behandlet, sterilt dH2O indeholdende 250 mg glucose, 300 mg bovint serumalbumin [BSA], 955 mg phosphatbufret saltvand [PBS] (Ca 2+ og Mg + gratis), og 1 ml 3,8% MgSO4 · 7H 2 O.
- Forberede 'opløsning B' (10 ml) indeholdende 1 ml 5 mg / ml trypsin fortyndet i 9 ml opløsning A.
- Forbered 'løsning C «(10 ml) indeholdende 1.000 enheder DNase, 0,5 mg sojabønnetrypsininhibitor, 100 pi 3,8% MgSO4 · 7H 2 O, fortyndet til 10 ml med løsning A.
- Forbered 'løsning D' (20 ml) indeholdende 3,2 ml opløsning C, fortyndet til 20 ml med løsning A.
- Forbered BSA / Earles Balanced Salt Solution (EBSS) indeholdende EBSS, 25 mM NaHCO3, 3 mM MgSO4 · 7H 2 O, og4% BSA, pH 7,4, som tidligere beskrevet 3.
- Forbered LME ved tilsætning ren LME i 5 ml MEM dyrkningsmedium til opnåelse af en slutkoncentration på 150 mM LME, returnere opløsningen til pH 7,4 ved anvendelse af en bordplade pH-meter, og filter sterilisere ved hjælp af en 28 mm polyethersulfon (PES) 0,2 um sprøjte filter.
3. Dyrkning af CGC
- Indsamle cerebella 4-7 dage gamle rotteunger som tidligere beskrevet 3. Sted umiddelbart i petriskål indeholdende 5 ml opløsning A på is.
- Hæld overskydende opløsning fra cerebella og sted væv i petriskålen låg.
- Hak væv fint med et godt flammet barberblad i mindst tre forskellige retninger.
- Tilsæt hakket væv til opløsning B (skyl petriskål med løsning til at sikre begrænset væv mistes) og anbringes i vandbad ved 37 ° C i 5 min. Ryst forsigtigt hvert par min.
- Tilsættes opløsning D (20 ml) til røret for at neutralisere trypsin, rystes og centrifuge ved 65 x g i 5 min.
- Hæld supernatanten.
- Resuspender i 4 ml opløsning C. Dette findeles godt (ca. 10 gange hver) med tre flammede glaspipetter af aftagende diameter, indtil suspensionen er så ensartet som muligt.
- Langsomt og forsigtigt tilføje et par dråber af denne homogenat oven på BSA / EBSS. Hvis den begynder at synke gennem BSA / EBSS, tritureres mere og / eller tilføje lidt mere opløsning C. Homogenatet skal sidde i et lag oven på BSA / EBSS. Må ikke rystes. Spin ved 100 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspender pellet (blødt) i 1 ml MEM-medium.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer og plade ved 800.000 celler / dækglas i 500 pi MEM-medium. Sted i en inkubator ved 37 ° C med 6% CO2.
- Skift mediet den følgende dag (24-36 timer efter prep). Lav en opløsning af MEM-medium indeholdende 10 uM af cellecyklus-inhibitoren arabinofuranosyl cytidin (AraC).
- For hverdækglas, bevarer 250 pi af den gamle medium i en frisk 24-brønds plade, opsug resten, tilsættes 250 pi normal MEM-medium og aspireres dette til at vaske cellerne, tilsæt derefter 250 pi af gamle medium tilbage til cellerne, og påfyld med 250 pi AraC-holdigt medium.
Bemærk: Celler kan anvendes fra 6 dage in vitro (DIV).
- For hverdækglas, bevarer 250 pi af den gamle medium i en frisk 24-brønds plade, opsug resten, tilsættes 250 pi normal MEM-medium og aspireres dette til at vaske cellerne, tilsæt derefter 250 pi af gamle medium tilbage til cellerne, og påfyld med 250 pi AraC-holdigt medium.
4. selektivt nedbryder Mikroglia (Udføres ved 6 DIV)
- Tilføj ren LME til 5 ml af en særskilt alikvot af MEM-medium til opnåelse af en slutkoncentration på 150 mM LME.
- Løsningen vende tilbage til pH 7,4 og filter sterilisere ved hjælp af en 28 mm polyethersulfon (PES) 0,2 um sprøjtefilter.
- Fortynd opløsningen til en koncentration på 50 mM (2 x LME) i MEM-medium og anbringes i et vandbad ved 37 ° C i 10 minutter sammen med normal MEM-medium til kontrolkulturer.
- Fjerne halvdelen (250 pi) i MEM-medium fra CGC kulturer og fastholde ved 37 ° C.
- Treat cellermed MEM-medium indeholdende 2 x LME (250 pi), dvs. fortyndet 1: 1 giver den et koncentration på 25 mM, eller med forvarmet MEM-medium uden LME (250 pi) for kontrolkulturer.
- Cellerne inkuberes ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 6% CO2 i 1 time.
- Vask cellerne to gange i frisk forvarmet MEM-medium til fjernelse af LME-holdige medier, og derefter erstatte den tilbageholdte dyrkningsmedium og et lige volumen af frisk forvarmet MEM-medium til de tilsvarende brønde.
- Retur kulturer til kuvøsen (befugtet med 6% CO2 ved 37 ° C) og lad hvile i 24 timer inden yderligere behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evne denne teknik til selektivt fjerne mikroglia fra CGC og / eller blandede kulturer afhængig den efterfølgende evne investigator til præcist at identificere og differentiere mikroglia fra de omkringliggende celler. Som vist i figur 2 Dette kan opnås ved anvendelse af en mikroglial-specifik celle maker, såsom isolectin-B4, som illustreret i figur 1. Blev der ikke observerbare ændringer astrocyt og neuronal tæthed og morfologi registreres for hvert vigtigste behandlingsgruppe. Vigtigere, blev ingen signifikant ændring i neuronal eller astrocytisk morfologi observeret, når kulturer blev behandlet med LME alene, støtter en mikroglial-specifik virkning af forbindelsen. Figur 3A viser ingen observerbare ændringer i astrocyt tæthed og morfologi fra primær gnaver astrocyt kultur 12, men gør vise et tab af forurenende mikroglia. I figur 3B, som i A, ingen ændringer i astrocyte tæthed og morfologi blev set; var imidlertid et tab i forurene mikroglial nummer og reaktivitet overholdes. For en kort beskrivelse af immuncytokemi (ICC) protokol, der anvendes i dette manuskript, se referere 11.
Figur 1: Karakterisering af LME behandling af CGC. (A) Repræsentative billeder fra immuncytokemi (ICC) eksperimenter udført på CGC-kulturer efter behandling med 25-75 mM LME i 1 time, efterfulgt af afvaskning. ICC blev udført med DAPI (blå) til kvantificering af totale celleantal og dem udviser apoptotisk morfologi, og isolectin-B4 (IB 4) (grøn) til mikroglial identifikation og kvantificering. Scale bar = 30 um. (B) Kvantificering af celler, der udviser apoptotisk morfologi, defineret som nuklear chromatinkondensering (grå bjælker,% afsamlede celleantal i feltet) og total mikroglial nummer, som en procentdel af kontrolniveauer (grønne søjler). Uparrede Students t -tests blev udført mellem de relevante kontroller og en specifik behandling af LME; * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; n = 3. (dvs. 3 uafhængige gentagelser).
Figur 2: Karakterisering af virkningerne af 25 mM LME behandling på neuroner og astrocytter i CGC kulturer. Panel af repræsentative billeder fra ICC eksperimenter udført på CGC kulturer efter behandling med 25 mM LME i 1 time. ICC blev udført med DAPI (blå), anti-β-III-tubulin (grøn) til identifikation af ændringer i neuronal tæthed og anti-GFAP (rød) til identifikation af ændringer i astrocytisk tæthed og morfologi. Negativ kontrol (ve CTR) billeder repræsenterer CGC kulturer, hvor den primære antibodies blev udeladt. Scale bar = 30 um.
Figur 3: Yderligere karakterisering af effektiviteten af 25 mM LME behandling i fjernelse af mikroglia fra astrocytiske kulturer. (A) Panel repræsentative billeder fra ICC eksperimenter udført på primære astrocytkulturer efter forbehandling med 25 mM LME i 1 time. ICC blev udført med DAPI (blå), anti-GFAP (rød) til identifikation af ændringer i astrocytisk tæthed og morfologi, og anti-ED1 (grøn) til identifikation af mikroglial nummer. (B) Repræsentative billeder fra ICC eksperimenter udført på primære astrocyt-kulturer efter behandling med LPS (1 ug / ml) i 24 timer efter forbehandling med 25 mM LME i 1 time. ICC blev udført som beskrevet i A, men med anti-GFAP (grøn) og anti-iNOS (rød) til at identificere aktiveret mikroglia. Negativ kontrol (ve CTR) billeder repræsenterer CGC kulturer, hvor de primære antistoffer blev udeladt. Scale bar = 30 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De vigtigste skridt til at sikre en vellykket selektiv fjernelse af mikroglia fra CGC og / eller blandede kulturer er: 1) at opretholde en steril og sund CGC kultur; 2) filtersterilisering LME-holdige medium og returnere opløsningen til pH 7,4; 3) at holde de tilbageholdte CGC medier og LME-holdige medier ved 37 ° C for at undgå varme chok; og 4) at arbejde hurtigt for at reducere den tid, cellerne holdes uden for inkubatoren.
Vi brugte 25 mM LME at nedbryder mikroglia fra vores CGC kulturer - en koncentration tidligere optimeret i vores laboratorium. Ikke desto mindre, nogle mikroglia stadig i kultur efter LME behandling, som nogle mener kan afspejle en befolkning på differentieret, ikke-prolifererende mikroglia. Faktisk Hamby et al. (2006) har fundet, at 50-75 mM LME var forpligtet til at fjerne mikroglia fra high-density astrocyt monolag 13. Vi har også vist, at tidligere i ren mikroglial cultures, 10 mM LME var tilstrækkelig til at dræbe alle de mikroglia, men kun med en 24 timers inkubationstid 14.
Alternative metoder til at slippe cellekultur modeller af forurenende mikroglia nylig kommet frem. Crocker et al. (2008) demonstrerede en ny tilgang til at eliminere mikroglia fra astrocytkulturer ved at fremme neural stamcelle (NSC) differentiering til astrocytter i postnatal (P0-P2) mus 15. De fandt, at denne teknik fuldstændigt elimineret mikroglia fra kulturerne, selvom mekanismerne bag fænomenerne er ukendte. . Derudover Kumamaru et al (2012) anvendte liposomale clodronat - en biophosphonate vides at inducere apoptose i makrofager - at eliminere mikroglia i primære astrocyt-kulturer fra P3-mus 16. Denne forbindelse virker på en lignende måde og på samme niveau af virkningsfuldhed som LME; selvom forfatterne hævder, at da LME kan være giftige for astrocytter visse betingelserpå grund af dens frie diffusion i celler - afbrydelse astrocyt vedhæftning kapacitet 13 - liposomal clodronat repræsenterer en forbedret fremgangsmåde til at udtømme mikroglia fra kultur. Vi imidlertid fundet, at 25 mM LME ingen har indflydelse på astrocyt levedygtighed eller proliferation.
Den heri beskrevne protokol anvender en specifik koncentration af LME til selektivt fjerne mikroglia fra neuron-berigede kulturer af CGC. Dette repræsenterer en magtfuld eksperimenterende tilgang til at bestemme indflydelsen af mikroglia på neuroner under forskellige forhold, og fortsætter med at levere vigtige data til forskere undersøger rolle neuroinflammation i neurologiske lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |
References
- Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).
- Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).
- Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).
- Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).
- Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).
- Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).
- Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).
- Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116 (2012).
