Introduction
Den menneskelige hjerne består av anslagsvis 85 milliarder nevroner og en ytterligere 85 milliard ikke-nevronale celler inkludert gliaceller 1. For størstedelen av de siste 100 årene nevrologer har fokusert hovedsakelig på nevronale cellepopulasjon, å tro gliacellene være litt mer enn passive støtteceller som ga strukturell støtte for nervecellene - derav den greske etymologi 'gliaceller "oversettes til engelsk som "lim". Nylig, har det imidlertid blitt stadig tydeligere at nevronale-gliaceller interaksjoner kan være langt mer grunnleggende for grunnleggende aspekter av nevrobiologi, nevrofysiologi, og tilblivelsen og progresjon av mange nevrodegenerative sykdommer. Lillehjernen granule celler (CGCs), den mest tallrike homogen nevronale befolkningen i den menneskelige hjernen, dominerer cerebellum og utgjør mer enn 90% av sine cellulære bestanddeler. Følgelig har disse cellene vært brukt i stor utstrekning som et in vitro modellsystem for tHan studerer for nevronale utvikling, funksjon og patologi 2-6.
Men CGC kulturer fortsatt inneholde mikroglia og andre gliaceller i uten tvil betydelige proporsjoner. Som et resultat, kan data CGC putatively viser direkte neuronale responser på forskjellige celle behandlinger faktisk oppstår - delvis eller totalt - fra den indirekte sekundær respons av nabo gliaceller i kulturen. For å vurdere dette, vi selektivt fjernet fra microglial CGC nevronale kulturer ved hjelp av L-leucin-metylester (LME). LME er en lysomotropic middel opprinnelig brukt til å selektivt ødelegge makrofager 7, og har siden blitt brukt til å også selektivt utarme mikroglia fra nevrale, astrocyte, og blandet gliale kulturer 8,9,10. LME er internalisert av makrofager og mikroglia, hvor det fører lysosomale avbrudd og påfølgende apoptose 13,14. Makrofager og mikroglia er karakteristisk rik i lysosomer, forårsaker dem til å være particularly sårbar ved eksponering til LME behandling. Denne protokollen gir en kraftig, men likevel enkel og lett måte å fastslå bidrag mikroglia i eksperimenter utnytte CGC og andre nevronale / gliale kultursystemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene beskrevet her ble utført i samsvar med Storbritannia Dyr (vitenskapelige prosedyrer) loven av 1986.
1. Utarbeidelse av Instruments, Culture Media og retter
- Forbered to rustfritt stål laboratorium dissekere saks og to rustfrie laboratorie tang. Autoklav alle instrumenter og sted i en kultur hette O / N under ultrafiolett lys (UV) lys for sterilisering.
- Gjør 500 ml av minimum essensielt medium (MEM) dyrkningsmedium (10% føtalt bovint serum [FBS], 20 mM KCI, 25 mM NaHCO3, 30 mM D-glukose, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 6 ug / ml ampicillin), og filtersteriliser. Oppbevar ved 4 ° C i månedsvis.
- Forbered 24 brønners kultur plater inneholdende 14 mm, nummer en tykkelse Dekk. Autoklavere Dekk og frakk i 100 mg / L poly-d-lysin (PDL) som tidligere beskrevet tre. UV lys sterilisere O / N.
2. Fremstilling av CGC kulturoppløsninger
- Forbered 'oppløsning A' (100 ml) i autoklavert, UV-lys behandles, sterile dH 2 O inneholdende 250 mg glukose, 300 mg bovint serumalbumin [BSA], 955 mg fosfatbufret saltoppløsning [PBS] (Ca 2+ og Mg + gratis), og 1 ml 3,8% MgSO4 · 7H 2 O.
- Forberede "oppløsning B" (10 ml) inneholdende 1 ml av 5 mg / ml trypsin fortynnet i 9 ml oppløsning A.
- Forbered 'oppløsning C' (10 ml) inneholdende 1000 enheter DNase, 0,5 mg soyabønne trypsin inhibitor, 100 ul 3,8% MgSO4 · 7H 2 O, fortynnet til 10 ml med oppløsning A.
- Forbered 'løsning D' (20 ml) inneholdende 3,2 ml av oppløsning C, fortynnet til 20 ml med oppløsning A.
- Forbered BSA / Earles Balanced Salt Solution (EBSS) oppløsning inneholdende EBSS, 25 mM NaHCO3, 3 mM MgSO4 · 7H 2 O, og4% BSA, pH 7,4, som beskrevet tidligere tre.
- Forbered LME ved tilsetning av ren LME i 5 ml MEM kulturmedium for å gi en sluttkonsentrasjon på 150 mM LME, returnerer oppløsningen til pH 7,4 ved hjelp av en bord- pH-meter, og filtersteriliser ved hjelp av en 28 mm polyetersulfon (PES) 0,2 pm sprøyte filter.
3. Dyrking de CGCs
- Samle cerebella 4-7 dager gamle rotteunger som tidligere beskrevet tre. Plasser umiddelbart i petriskål inneholdende 5 ml oppløsning A på is.
- Hell av overskytende oppløsning fra cerebella og sted vev i petriskålen lokket.
- Hakk vev fint med et godt flammet barberblad i minst tre ulike retninger.
- Tilsett hakkede vev til oppløsning B (skylle petriskål med løsning for å sikre begrenset vev er tapt) og plasser i vannbad ved 37 ° C i 5 min. Rist forsiktig hvert par min.
- Legg løsning D (20 ml) til røret for å nøytralisere trypsin, riste og prosentrifuge ved 65 xg i 5 min.
- Hell av supernatanten.
- Resuspender i 4 ml av oppløsning C. Triturate brønn (ca. 10 ganger hver) med tre flammet glass pipetter av minkende diameter, inntil suspensjonen er så homogen som mulig.
- Sakte og forsiktig legge noen dråper av denne homogenate på toppen av BSA / EBSS. Hvis det begynner å synke inn i BSA / EBSS, triturer mer og / eller legge litt mer løsning C. Homogenisatet bør sitte i et lag på toppen av BSA / EBSS. Ikke rist. Snurr på 100 xg i 5 min.
- Fjern supernatant og resuspender pelleten (myk) i 1 ml MEM medium.
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer og plate på 800.000 celler / dekk i 500 mL av MEM medium. Plasser i en inkubator ved 37 ° C med 6% CO2.
- Endre medium påfølgende dag (24-36 timer etter prep). Lag en løsning av MEM medium inneholdende 10 uM av cellesyklusen inhibitor arabinofuranosyl cytidin (AraC).
- For hverdekkglass, beholde 250 mL av den gamle medium i en frisk 24 brønners plate, aspirer resten, tilsett 250 mL av normal MEM medium og aspirer dette å vaske cellene, legg deretter til 250 mL av gammelt medium tilbake til cellene og topp opp med 250 ul av AraC-inneholdende medium.
Merk: Celler kan brukes fra 6 dager in vitro (DIV).
- For hverdekkglass, beholde 250 mL av den gamle medium i en frisk 24 brønners plate, aspirer resten, tilsett 250 mL av normal MEM medium og aspirer dette å vaske cellene, legg deretter til 250 mL av gammelt medium tilbake til cellene og topp opp med 250 ul av AraC-inneholdende medium.
4. Selektivt tappe Microglia (Spilt på 6 DIV)
- Legg ren LME til 5 ml av en separat aliquot av MEM-medium for å gi en sluttkonsentrasjon på 150 mM LME.
- Returner løsningen til pH 7,4 og filter sterilisere ved hjelp av en 28 mm polyetersulfon (PES) 0,2 um sprøytefilter.
- Fortynn løsningen til en konsentrasjon på 50 mM (2 x LME) i MEM-medium og plasseres i et vannbad ved 37 ° C i 10 minutter sammen med normal MEM medium for kontrollkulturer.
- Fjerne halvparten (250 ul) i MEM-medium fra CGC kulturer og beholde ved 37 ° C.
- Unn cellermed MEM medium inneholdende 2 x LME (250 ul), det vil si fortynnet 1: 1 gir en godt konsentrasjon på 25 mM, eller med forvarmet MEM medium uten LME (250 ul) for kontrollkulturer.
- Inkuber cellene ved 37 ° C i en fuktet atmosfære med 6% CO2 i 1 time.
- Vask cellene to ganger i frisk forvarmet MEM-medium for å fjerne LME-inneholdende medium, og deretter erstatte den beholdt kulturmedium og et like stort volum frisk forvarmet MEM medium til de tilsvarende brønner.
- Returner kulturer til inkubatoren (fuktes med 6% CO2 ved 37 ° C) og la det hvile i 24 timer før videre behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muligheten av denne teknikken for å selektivt fjerne fra CGC mikroglia og / eller blandede kulturer er avhengig av den påfølgende evne til undersøkeren til nøyaktig å identifisere og skille mikroglia fra sine omgivende celler. Dette kan oppnås ved hjelp av en microglial-spesifikk celletrakter, slik som isolectin-B4, som vist på figur 1. Som vist i figur 2, ble ingen observerbare endringer i astrocytt og neuronal tetthet og morfologi registrert med hensyn på hver hovedbehandlingsgruppe. Viktigere var ingen signifikant endring i neuronal eller astrocytic morfologi observert når kulturer ble behandlet med LME alene, som støtter en microglial spesifikke virkningen av forbindelsen. 3A viser ingen observerbare endringer i astrocyte tetthet og morfologi fra primær gnager astrocyte kultur 12, men gjør vise et tap av forurensende mikroglia. I figur 3B, som i A, ingen endringer i astrocyte tetthet og morfologi ble sett; imidlertid, ble et tap på kontaminerende microglial nummer og reaktivitet observert. For en kort beskrivelse av immunocytokjemi (ICC) protokoll som brukes i dette manuskriptet, se referanse 11.
Figur 1: Karakterisering av LME behandling av CGCs. (A) representative bilder fra immunocytokjemi (ICC) eksperimenter utført på CGC kulturer etter behandling med 25 til 75 mM LME i 1 time, etterfulgt av vask-off. ICC ble utført med DAPI (blå) for kvantifisering av totalt celleantall og de viser apoptotisk morfologi, og isolectin-B4 (IB 4) (grønn) for microglial identifisering og kvantifisering. Scale bar = 30 mikrometer. (B) Kvantifisering av celler som viser apoptotisk morfologi, definert som kjernefysisk kromatin kondens (grå søyler;% avtotalt celle nummer i feltet) og total microglial nummer, som andel av kontrollnivåer (grønne søyler). Uparede Student t -UNDERSØKELSER ble utført mellom de aktuelle kontroller og en spesifikk behandling av LME; * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; n = 3. (dvs 3 uavhengige rapporter).
Figur 2: Karakterisering av virkningene av 25 mM LME behandling på neuroner og astrocytter i CGC kulturer. Panel av representative bilder fra ICC eksperimenter utført på CGC kulturer etter behandling med 25 mM LME for 1 time. ICC ble utført med DAPI (blå), anti-β-III-tubulin (grønn) for identifisering av endringer i neuronal tetthet og anti-GFAP (rød) for identifisering av endringer i astrocytic densitet og morfologi. Negativ kontroll (ve CTR) bildene representerer CGC kulturer hvor den primære antilegemers ble utelatt. Scale bar = 30 mikrometer.
Figur 3: Ytterligere karakterisering av effektiviteten av 25 mM LME behandling i fjerning av mikroglia fra astrocytic kulturer. (A) Panel av representative bilder fra ICC-eksperimenter utført på primær astrocyttkulturer etter forbehandling med 25 mM LME i 1 time. ICC ble utført med DAPI (blå), anti-GFAP (rød) for identifisering av endringer i astrocytic densitet og morfologi, og anti-ED1 (grønn) for identifikasjon av microglial nummer. (B) representative bilder fra ICC-eksperimenter utført på primær astrocyttkulturer etter behandling med LPS (1 pg / ml) i 24 timer etter forbehandling med 25 mM LME i 1 time. ICC ble utført som beskrevet i A, men med anti-GFAP (grønn), og anti-iNOS (rød) for å identifisere aktivert microglia. Negativ kontroll (ve CTR) bilder representerer CGC kulturer hvor de primære antistoffer ble utelatt. Scale bar = 30 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De viktigste tiltak for å sikre en vellykket selektiv fjerning av mikroglia fra CGC og / eller blandede kulturer er: 1) å opprettholde et sterilt og sunn CGC kultur; 2) filtersterilisering LME-inneholdende medium og returnerer oppløsningen til pH 7,4; 3) holde tilbakeholdt CGC media og LME-holdige media ved 37 ° C for å unngå varme sjokk; og 4) som arbeider raskt for å redusere tiden celler holdes utenfor inkubatoren.
Vi brukte 25 mM LME å utarme mikroglia fra våre CGC kulturer - en konsentrasjon som tidligere optimalisert i vårt laboratorium. Likevel, noen mikroglia fortsatt i kultur følgende LME behandling, som noen mener kan gjenspeile en befolkning på differensiert, ikke-former mikroglia. Faktisk Hamby et al. (2006) har funnet at 50-75 mM LME var nødvendig for å eliminere mikroglia fra høy tetthet astrocyttkulturer monolag 13. Vi har også tidligere vist at i ren microglial cultures, 10 mM LME var tilstrekkelig til å drepe alle microglia, men bare med en 24-timers inkuberingstid 14.
Alternative metoder for å kvitte cellekultur modeller av forurensende mikroglia har nylig kommet frem i lyset. Crocker et al. (2008) viste en ny tilnærming for å eliminere mikroglia fra astrocyttkulturer ved å fremme neurale stamceller (NSC) differensiering i astrocytter i postnatal (P0-P2) 15 mus. De fant ut at denne teknikken fullstendig eliminert mikroglia fra kulturer, selv om mekanismene bak fenomenet er ukjent. I tillegg brukte Kumamaru et al (2012) liposomal klodronat - a. Biophosphonate kjent for å indusere apoptose i makrofager - for å eliminere mikroglia i primær astrocyttkulturer fra P3 mus 16. Denne forbindelsen virker på en lignende måte og på samme grad av effekt som LME; om forfatterne hevder at så LME kan være giftig for astrocytter under visse betingelserpå grunn av sin frie diffusjon inn i cellene - forstyrrende astrocytt adhesjon kapasitet 13 - liposomal klodronat representerer en forbedret metode for å utarme mikroglia fra kulturen. Vi fant imidlertid at 25 mM LME har ingen innvirkning på astrocyte levedyktighet eller spredning.
Protokollen er beskrevet her bruker en bestemt konsentrasjon av LME å selektivt fjerne mikroglia fra nervecellen-beriket kulturer av CGCs. Dette representerer en kraftig eksperimentell tilnærming for å bestemme innvirkningen av mikroglia på neuroner under ulike forhold, og fortsetter å gi viktige data for forskere som undersøker rolle nevroinflammasjon i nevrologiske lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |
References
- Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).
- Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).
- Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).
- Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).
- Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).
- Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).
- Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).
- Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116 (2012).
