Introduction
Den mänskliga hjärnan består av uppskattningsvis 85 miljarder nervceller och en ytterligare 85 miljarder icke-neuronala celler inklusive glia 1. För större delen av de senaste 100 åren neuroforskare har fokuserat främst på den neuronala cellpopulationen, att tro gliaceller vara lite mer än passiva stödceller som föreskrivs strukturellt stöd till de nervceller - därav det grekiska etymologi av "glia" översätts till engelska "lim". Nyligen har det dock blivit allt tydligare att neuronala-gliaceller interaktioner kan vara långt mer grundläggande för grundläggande aspekter av neurobiologi, neurofysiologi, och uppkomsten och utvecklingen av många neurodegenerativa sjukdomar. Cerebellära granulatceller (CGC), den vanligast förekommande homogena neuronala befolkningen i den mänskliga hjärnan, dominerar lillhjärnan och utgör mer än 90% av sina cellbeståndsdelar. Följaktligen har dessa celler använts i stor omfattning in vitro som ett modellsystem för than studie av nervsystemets utveckling, funktion och patologi 2-6.
Men CGC kulturer innehåller fortfarande mikroglia och andra glia i påstå betydande proportioner. Som ett resultat, CGC uppgifter förmodat visar direkta neuronala svar på olika cellbehandlingar kan faktiskt uppstå - delvis eller totalt - från det indirekta sekundära svaret angränsande glia i kulturen. För att bedöma detta, selektivt elimineras vi microglial från CGC neuronala kulturer med hjälp av L-leucinmetylester (LME). LME är ett lysomotropic agent ursprungligen användes för att selektivt förstöra makrofager 7, och har sedan dess använts för att även selektivt utarma mikroglia från neurala, astrocyternas och blandade gliaceller kulturer 8,9,10. LME internaliseras av makrofager och mikroglia, där det orsakar lysosomal störningar och efterföljande apoptos 13,14. Makrofager och mikroglia är karaktäristiskt rikt på lysosomer, vilket får dem att vara particularly sårbara vid exponering för LME behandling. Detta protokoll ger en kraftfull, men ändå enkel och lätt sätt att fastställa bidrag mikroglia i experiment som använder CGC och andra neuronala / glia odlingssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment som beskrivs häri utfördes i enlighet med Förenade kungariket Djur (vetenskapliga förfaranden) Act från 1986.
1. Framställning av instrument, Kultur Media och Rätter
- Bered två rostfritt stål laboratorium dissekera sax och två rostfria laboratorie pincett. Autoklav alla instrument och plats i en kultur huva O / N under ultraviolett ljus (UV) ljus för sterilisering.
- Gör 500 ml minimalt essentiellt medium (MEM) odlingsmedium (10% fetalt bovint serum [FBS], 20 mM KCl, 25 mM NaHCOs 3, 30 mM D-glukos, 2 mM L-glutamin, 100 U / ml penicillin, 100 ig / ml streptomycin och 6 ng / ml ampicillin) och filtrera sterilisera. Förvara vid 4 ° C i flera månader.
- Förbered 24 brunnar odlingsplattor innehållande 14 mm, nummer 1 tjocklek täck. Autoklavera täck och rock i 100 mg / L poly-D-lysin (PDL) som tidigare beskrivits 3. UV-ljus sterilisera O / N.
2. Framställning av CGC Kultur Solutions
- Bered "lösning A" (100 ml) i autoklaverad, UV-ljus behandlas, steril dH 2 O innehållande 250 mg glukos, 300 mg bovint serumalbumin [BSA], 955 mg Fosfatbuffrad saltlösning [PBS] (Ca2 + och Mg + gratis), och 1 ml 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O.
- Bered lösning B "(10 ml) innehållande 1 ml av 5 mg / ml trypsin utspädd i 9 ml lösning A.
- Bered lösning C (10 ml) innehållande 1000 enheter DNas, 0,5 mg sojaböntrypsininhibitor, 100 pl 3,8% MgSO 4 · 7 H2O, utspädd till 10 ml med lösning A.
- Bered 'lösning D "(20 ml) innehållande 3,2 ml av lösning C, späddes till 20 ml med lösning A.
- Bered BSA / Earles balanserade saltlösning (EBSS) lösning innehållande EBSS, 25 mM NaHCOs 3, 3 mM MgSO 4 · 7 H2O, och4% BSA, pH 7,4, såsom tidigare beskrivits 3.
- Bered LME genom tillsats av rent LME i 5 ml MEM odlingsmedium för att ge en slutlig koncentration av 150 mM LME, tillbaka lösningen till pH 7,4 med användning av en bords pH-meter, och filtersterilisera genom att använda en 28 mm polyetersulfon (PES) 0,2 ^ m spruta filtrering.
3. Odling av CGC
- Samla cerebella 4-7 dagar gamla råttungar som tidigare beskrivits 3. Placera omedelbart petriskål innehållande 5 ml lösning A på is.
- Häll bort överskottslösning från cerebella och plats vävnad i skålen locket Petri.
- Chop vävnad fint med en väl flammig rakblad i åtminstone tre olika riktningar.
- Tillsätt hackad vävnad till lösning B (skölj petriskål med lösning för att säkerställa begränsad vävnad förloras) och placera i vattenbad vid 37 ° C under 5 min. Skaka försiktigt varje par minuter.
- Lägg lösning D (20 ml) till röret för att neutralisera trypsin, skaka och procentrifuge vid 65 xg under 5 minuter.
- Häll av supernatanten.
- Resuspendera i 4 ml lösning C. Finfördela väl (ca 10 gånger vardera) med tre flammade glaspipetter med minskande diameter, tills suspensionen är så homogen som möjligt.
- Långsamt och försiktigt lägga några droppar av detta homogenat ovanpå BSA / EBSS. Om det börjar sjunka genom BSA / EBSS, finfördela mer och / eller lägga till lite mer lösning C. Homogenatet ska sitta i ett lager ovanpå BSA / EBSS. Skaka inte. Spin vid 100 xg under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten (mjuk) i 1 ml MEM-medium.
- Räkna celler med en hemocytometer och platta på 800.000 celler / täck i 500 pl MEM-medium. Placera i en inkubator vid 37 ° C med 6% CO2.
- Ändra mediet följande dag (24-36 timmar efter prep). Gör en lösning av MEM-medium innehållande 10 | iM av cellcykeln inhibitorn arabinofuranosyl cytidin (AraC).
- För varjetäck, behålla 250 ul av gamla mediet i en ny platta med 24 brunnar, aspirera resten, tillsätt 250 pl normal MEM-medium och aspirera detta att tvätta cellerna, tillsätt sedan 250 pl gammalt medium tillbaka till cellerna och fyll på med 250 | il av AraC-innehållande medium.
Obs: Celler kan användas från 6 dagar in vitro (DIV).
- För varjetäck, behålla 250 ul av gamla mediet i en ny platta med 24 brunnar, aspirera resten, tillsätt 250 pl normal MEM-medium och aspirera detta att tvätta cellerna, tillsätt sedan 250 pl gammalt medium tillbaka till cellerna och fyll på med 250 | il av AraC-innehållande medium.
4. Selektiv nedbrytande mikroglia (utförd på 6 DIV)
- Lägg ren LME till 5 ml av en separat alikvot av MEM-medium för att ge en slutlig koncentration av 150 mM LME.
- Återgå lösningen till pH 7,4 och filtrera sterilisera med hjälp av en 28 mm polyetersulfon (PES) 0,2 fim sprutfilter.
- Späd lösningen till en koncentration av 50 mM (2 x LME) i MEM-medium och placera i ett vattenbad vid 37 ° C i 10 minuter tillsammans med normalt MEM-medium för kontrollkulturer.
- Ta bort hälften (250 pl) MEM medium från CGC kulturer och behålla vid 37 ° C.
- Behandla cellermed MEM-medium innehållande 2 x LME (250 pl), dvs utspädd 1: 1, vilket gav en väl koncentration av 25 mM, eller med förvärmda MEM medium utan LME (250 pl) för kontrollodlingar.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i en fuktad atmosfär med 6% CO2 under 1 timme.
- Tvätta cellerna två gånger med färskt förvärmda MEM-medium för att avlägsna LME-innehållande media, och sedan ersätta den kvarhållna odlingsmedium och en lika stor volym av färska förvärmda MEM medium till motsvarande brunnar.
- Återgå kulturer till inkubatorn (fukt med 6% CO2 vid 37 ° C) och låt vila i 24 timmar innan någon ytterligare behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förmågan hos denna teknik för att selektivt eliminera mikroglia från CGC och / eller blandade kulturer bygger på den efterföljande förmågan hos utredaren att exakt identifiera och särskilja mikroglia från deras omgivande celler. Detta kan uppnås med användning av en microglial-specifik cell maker, såsom isolectin-B4, såsom visas i fig 1. Såsom visas i fig 2, observerades inga observerbara förändringar av astrocyt och neuronal densitet och morfologi som spelats in med avseende på varje huvudbehandlingsgrupp. Viktigt var ingen signifikant förändring av neuronala eller astrocytisk morfologi observerades när kulturer behandlades med LME enbart stödja en microglial specifik verkan av föreningen. Figur 3A visar inga observerbara förändringar i astrocyternas densitet och morfologi från primär gnagare astrocyternas kultur 12, men inte visa en förlust av förorenande mikroglia. I fig 3B, som i A, inga förändringar i astrocyte densitet och morfologi sågs; var dock en förlust på förorenande microglial antal och reaktivitet observerades. För en kort beskrivning av immunocytokemi (ICC) protokoll som används i detta manuskript, se referens 11.
Figur 1: Karakterisering av LME behandling av CGC. (A) Representativa bilder immunocytokemi (ICC) experiment på CGC kulturer efter behandling med 25-75 mM LME under 1 timme, följt av tvätt-off. ICC utfördes med DAPI (blå) för kvantifiering av det totala antalet celler och de visar apoptotiska morfologi och isolectin-B4 (IB 4) (grön) för microglial identifiering och kvantifiering. Skalstreck = 30 | im. (B) Kvantifiering av celler som uppvisar apoptotiska morfologi, definieras som kärn kromatinkondensation (grå staplar,% avtotala antalet celler i området) och totalt microglial nummer, som en procentandel av kontrollnivåer (gröna staplar). Oparade Students t -tests utfördes mellan de relevanta kontroller och en särskild behandling av LME; * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; n = 3. (dvs 3 oberoende upprepningar).
Figur 2: Karakterisering av effekterna av 25 mM LME behandling på neuroner och astrocyter i CGC kulturer. Panel av representativa bilder från ICC experiment utförda på CGC kulturer efter behandling med 25 mM LME under 1 timme. ICC utfördes med DAPI (blå), anti-β-III-tubulin (grön) för identifiering av förändringar i neuronala densitet och anti-GFAP (röd) för identifiering av förändringar i astrocytisk densitet och morfologi. Negativ kontroll (-ve CTR) bilder representerar CGC kulturer där den primära antibodies uteslöts. Skalstreck = 30 | im.
Figur 3: Ytterligare karakterisering av effektiviteten av 25 mM LME behandling i avlägsnandet av mikroglia från astrocytiska kulturer. (A) Panel representativa bilder från ICC experiment utförda på primära astrocyternas kulturer efter förbehandling med 25 mM LME under 1 timme. ICC utfördes med DAPI (blå), anti-GFAP (röd) för identifiering av förändringar i astrocytisk densitet och morfologi, och anti-ED1 (grön) för identifiering av microglial nummer. (B) Representativa bilder ICC experiment utförda på primära astrocyternas kulturer efter behandling med LPS (1 | ig / ml) under 24 h efter förbehandling med 25 mM LME under 1 timme. ICC utfördes såsom beskrivits i A men med anti-GFAP (grönt) och anti-iNOS (röd) för att identifiera aktiverade mikroglia. Negativ kontroll (ve CTR) bilder representerar CGC kulturer där de primära antikropparna utelämnades. Skalstreck = 30 | im.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De viktigaste åtgärder för att säkerställa en framgångsrik selektiv eliminering av mikroglia från CGC och / eller blandade kulturer är: 1) att upprätthålla en steril och hälsosam CGC kultur; 2) filtersterilisering LME-innehållande mediet och återföring av lösningen till pH 7,4; 3) hålla de kvarhållna CGC media och LME-innehållande media vid 37 ° C för att undvika värmechock; och 4) arbetar snabbt för att minska den tid cellerna hålls utanför inkubatorn.
Vi använde 25 mM LME att tömma mikroglia från våra CGC kulturer - en koncentration som tidigare optimerad i vårt laboratorium. Trots vissa mikroglia fortfarande i odling efter LME behandling, som vissa tror kan återspegla en population av differentierade, icke-förökande mikroglia. Faktum Hamby et al., (2006) har funnit att 50 till 75 mM LME krävdes för att eliminera mikroglia från hög densitet astrocyternas monolager 13. Vi har också tidigare visat att i ren microglial cultures, var 10 mM LME tillräcklig för att döda alla mikroglia, men bara med en 24 timmars inkubering tid 14.
Alternativa metoder för att bli cellodlingsmodeller förorenande mikroglia har nyligen kommit i dagen. Crocker et al., (2008) visade en ny metod för att eliminera mikroglia från astrocyternas kulturer genom att främja neural stamcell (NSC) differentiering till astrocyter i postnatal (P0-P2) möss 15. De fann att denna teknik helt elimineras mikroglia från kulturerna, men mekanismerna bakom fenomenet är okända. Dessutom använde Kumamaru et al (2012) liposomalt klodronat - a. Biophosphonate känd för att inducera apoptos i makrofager - att eliminera mikroglia i primär astrocyternas kulturer från P3-möss 16. Denna förening fungerar på ett liknande sätt och på samma nivå av effektivitet såsom LME; men författarna menar att eftersom LME kan vara giftiga för astrocyter under vissa villkorpå grund av dess fria diffusion in i celler - störa astrocyternas vidhäftningsförmåga 13 - liposomal klodronat representerar en förbättrad metod för att utarma mikroglia från kulturen. Men vi fann att 25 mM LME inte har inverkan på astrocyternas livskraft eller spridning.
Protokollet som beskrivs här använder en specifik koncentration av LME att selektivt eliminera mikroglia från neuron-berikade kulturer av CGC. Detta är en kraftfull experimentell metod för att bestämma påverkan av mikroglia på neuroner under olika förhållanden, och fortsätter att ge viktiga data för forskare som undersöker rollen av neuroinflammation i neurologiska sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |
References
- Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).
- Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).
- Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).
- Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).
- Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).
- Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).
- Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).
- Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116 (2012).
