Introduction
Das menschliche Gehirn enthält schätzungsweise 85 Milliarden Neuronen und eine weitere 85 Milliarden nicht-neuronalen Zellen, sowie Glia 1. Daher der griechischen Etymologie "Glia" übersetzt in englisch als - zum größten Teil von den letzten 100 Jahren haben Neurowissenschaftler überwiegend auf der neuronalen Zellpopulation konzentriert, zu glauben, Gliazellen auf wenig mehr als passive Stützzellen, die strukturelle Unterstützung für den Neuronen vorgesehen sein "Leim". In jüngster Zeit wurde es jedoch zunehmend offensichtlich geworden, dass neuronale-glial Wechselwirkungen können weitaus Grund grundlegende Aspekte der Neurobiologie, Neurophysiologie und der Entstehung und Progression von vielen neurodegenerativen Krankheiten. Kleinhirn-Körnerzellen (BVKA), die am häufigsten vorkommende homogene neuronalen Population im menschlichen Gehirn, dominieren das Kleinhirn und machen mehr als 90% der Zellbestandteile. Folglich wurden diese Zellen ausgiebig in vitro als Modellsystem für T verwendeter studieren der neuronalen Entwicklung, Funktion und Pathologie 2-6.
Allerdings enthalten CGC Kulturen noch Mikroglia und anderen Glia in wohl signifikante Anteile. Als Ergebnis CGC Daten mutmaßlich Anzeige direkten neuronalen Reaktionen auf verschiedene Zellen Behandlungen können in der Tat ergeben - teilweise oder insgesamt - aus dem indirekten sekundäre Antwort benachbarter Glia in der Kultur. Um dies zu beurteilen, haben wir selektiv abgespalten Mikroglia von CGC neuronalen Kulturen mit Hilfe von L-Leucinmethylester (LME). LME ist ein lysomotropic Mittel ursprünglich benutzt, um selektiv Makrophagen 7 zerstört und seit verwendet worden, um auch selektiv abzureichern Mikroglia aus neuralen, Astrozyten und gemischten Gliakulturen 8.9.10. LME wird von Makrophagen und Mikroglia verinnerlicht, bei dem es lysosomalen Unterbrechung und anschließender Apoptose 13,14 bewirkt. Makrophagen und Mikrogliazellen sind charakteristischerweise reich an Lysosomen, wodurch sie particula seinrly anfällig bei Exposition gegenüber LME Behandlung. Dieses Protokoll bietet eine leistungsstarke und dennoch einfache und einfache Möglichkeit, den Beitrag der Mikroglia in Experimenten unter Verwendung von CGC und andere neuronale / Gliazellen Kultursystemen zu ermitteln.
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Protocol
Alle hierin beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act von 1986 durchgeführt.
1. Herstellung des Instruments, Kultur, Medien und Gerichte
- Bereiten Sie zwei Edelstahl Labor Präparierscheren und zwei Edelstahl-Laborzangen. Autoklaven alle Instrumente und in eine Kultur Haube O / N unter ultraviolettem Licht (UV) Licht für die Sterilisation.
- Bilden 500 ml Minimum Essential Medium (MEM) Kulturmedium (10% Fötales Rinderserum [FBS], 20 mM KCl, 25 mM NaHCO 3, 30 mM D-Glucose, 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 6 & mgr; g / ml Ampicillin) und Filter zu sterilisieren. Lagerung bei 4 ° C für Monate.
- Bereiten Sie 24 Well-Kulturplatten mit 14 mm, die Nummer 1 Dicke Deckgläser. Autoklaven werden die Deckgläser und Mantel in 100 mg / l Poly-D-Lysin (PDL), wie vorstehend beschrieben 3. UV-Licht sterilisiert O / N.
2. Herstellung von CGC Kulturlösungen
- Vorbereiten "Lösung A" (100 ml) in autoklavierten, UV-Licht behandelt, steriles dH & sub2; O, enthaltend 250 mg Glukose, 300 mg Rinderserumalbumin [BSA], 955 mg phosphatgepufferte Kochsalzlösung [PBS] (Ca 2+ und Mg + free), und 1 ml 3,8% MgSO 4 · 7 H 2 O.
- Vorbereiten "Lösung B" (10 ml), die 1 ml 5 mg / ml Trypsin in 9 ml Lösung A verdünnt
- Vorbereiten "Lösung C" (10 ml), enthaltend 1.000 Einheiten DNase, 0,5 mg Sojabohnentrypsininhibitor, 100 & mgr; l 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O, 10 ml mit Lösung A. verdünnt
- Vorbereiten "Lösung D" (20 ml), die 3,2 ml der Lösung C auf 20 ml mit Lösung A. verdünnt
- Vorbereitung Balanced Salt Solution (EBSS) Lösung BSA / Earles enthaltende EBSS, 25 mM NaHCO3, 3 mM MgSO 4 · 7H 2 O, und4% BSA, pH 7,4, wie zuvor beschrieben, 3.
- Bereiten LME durch Zugabe von reinem LME in 5 ml MEM Kulturmedium, um eine Endkonzentration von 150 mM LME zu geben, zurück die Lösung auf pH 7,4 mit einem pH-Meter Tisch Modell und Filter-sterilisiert unter Verwendung eines 28 mm Polyethersulfon (PES) 0,2 um Spritzen Filter.
3. Kultivierung der BVKA
- Sammeln cerebella 4-7 Tage alten Rattenjungen, wie zuvor beschrieben 3. Platzieren Sie sofort in Petrischale mit 5 ml Lösung A auf Eis.
- Gießen Sie überschüssige Lösung von Kleinhirne und Ort Gewebe in der Petrischale Deckel.
- Zerhacken Gewebe fein mit einer gut geflammt Rasierklinge in mindestens drei verschiedenen Richtungen.
- Gehackte Gewebe zu Lösung B (rinse Petrischale mit Lösung begrenzte Gewebe sicherzustellen geht verloren) und im Wasserbad bei 37 ° C für 5 min. Vorsichtig schütteln alle paar min.
- In Lösung D (20 ml) zu dem Rohr, um das Trypsin, schütteln und Cent zu neutralisierenrifuge bei 65 × g für 5 min.
- Überstand abgießen.
- Resuspendieren in 4 ml Lösung C Man reibt gut (ca. 10 mal) mit je drei geflammten Glaspipetten mit abnehmendem Durchmesser, bis die Suspension so homogen wie möglich ist.
- Langsam und vorsichtig ein paar Tropfen dieses Homogenats auf dem BSA / EBSS. Wenn es beginnt, durch die BSA / EBSS Spüle, verreiben mehr und / oder fügen Sie ein wenig mehr Lösung C. Das Homogenat sollten in einer Schicht auf der Oberseite des BSA / EBSS sitzen. Nicht schütteln. Spin bei 100 xg für 5 min.
- Überstand entfernen und Pellet (weich) in 1 ml MEM-Medium.
- Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und Platte bei 800.000 Zellen / Deckglas in 500 & mgr; l MEM-Medium. In einem Brutschrank bei 37 ° C unter 6% CO 2.
- Ändern Sie den folgenden Tag (24 bis 36 Stunden nach der prep) des Mediums. Stellen eine Lösung von MEM-Medium mit 10 & mgr; M des Zellzyklus-Inhibitors arabinofuranosyl Cytidin (AraC).
- Für jedenDeckglas, behalten 250 ul des alten Mediums in einem frischen 24-Well-Platte, saugen Sie den Rest, fügen Sie 250 ul normalen MEM-Medium und saugen Sie diese, um die Zellen zu waschen, dann die 250 ul alte Medium zurück in den Zellen und füllen mit 250 ul AraC enthaltenden Medium.
Hinweis: Zellen kann von 6 Tagen in vitro (DIV) verwendet werden.
- Für jedenDeckglas, behalten 250 ul des alten Mediums in einem frischen 24-Well-Platte, saugen Sie den Rest, fügen Sie 250 ul normalen MEM-Medium und saugen Sie diese, um die Zellen zu waschen, dann die 250 ul alte Medium zurück in den Zellen und füllen mit 250 ul AraC enthaltenden Medium.
4. Wahlweise zum Abbau der Mikroglia (Durchgeführt bei 6 DIV)
- Hinzuzufügen reinen LME bis 5 ml eines separaten Aliquot MEM-Medium auf eine Endkonzentration von 150 mM LME ergeben.
- Rückkehr der Lösung auf pH 7,4 und mit einem Filter sterilisiert 28 mm Polyethersulfon (PES), 0,2 & mgr; m Spritzenfilter filtriert.
- Verdünnte Lösung auf eine Konzentration von 50 mM (2 x LME) in MEM-Medium und in einem Wasserbad bei 37 ° C für 10 min mit dem normalen MEM Medium für Kontrollkulturen.
- Entfernen Sie die Hälfte (250 ul) der MEM-Medium von CGC Kulturen und bei 37 ° C zu halten.
- Treat-Zellenmit MEM-Medium, das 2 x LME (250 ul), das heißt 1: 1 verdünnt hat ein schönes Konzentration von 25 mM oder mit vorgewärmter MEM-Medium ohne LME (250 ul) für Kontrollkulturen.
- Zellen bei 37 ° C inkubieren in einer befeuchteten Atmosphäre mit 6% CO 2 für 1 Stunde.
- Wash Zellen zweimal in frischem vorgewärmten MEM-Medium zu LME haltigen Medien zu entfernen, und ersetzen Sie dann den gehaltenen Kulturmedium und ein gleiches Volumen an frischem vorgewärmten MEM-Medium in die entsprechenden Wells.
- Zurück Kulturen in den Inkubator (mit 6% CO 2 bei 37 ° C befeuchtet) ruhen lassen für 24 h vor der weiteren Behandlung.
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Representative Results
Die Fähigkeit dieser Technik selektiv zu eliminieren Mikroglia CGC und / oder Mischkulturen beruht auf der nachfolgenden Fähigkeit des Untersuchers genau zu identifizieren und zu differenzieren Mikroglia aus ihrer umgebenden Zellen. Dies kann mit einer Mikroglia-spezifischen Zellmacher, wie isolectin-B4 erreicht werden, wie in 1 dargestellt. Wie in Figur 2 gezeigt, wurden keine beobachtbaren Änderungen in Astrozyten und neuronalen Dichte und Morphologie in Bezug auf jede Hauptbehandlungsgruppe aufgezeichnet. Wichtig ist, dass keine signifikante Veränderung der neuronalen oder astrozytären Morphologie beobachtet, wenn Kulturen mit LME allein behandelt wurden, die Unterstützung einer Mikroglia-spezifischen Wirkung der Verbindung. 3A zeigt keine beobachtbaren Veränderungen in Astrozyten Dichte und Morphologie von der Grund Nagetier Astrozyten Kultur 12, aber tut zeigen einen Verlust von verunreinigenden Mikroglia. In 3B, wie in A, keine Veränderungen in astrocyte Dichte und Morphologie zu sehen waren; jedoch ein Verlust an kontaminierenden Mikro Anzahl und Reaktivität beobachtet. Eine kurze Beschreibung der Immunzytochemie (ICC) Protokoll in dieser Handschrift verwendet wird, finden Sie in Referenz 11.
Abbildung 1: Charakterisierung der LME Behandlung von BVKA. (A) Repräsentative Bilder von Immunzytochemie (ICC) Experimente an CGC Kulturen nach der Behandlung für 1 Stunde durchgeführt, mit 25-75 mM LME, gefolgt vom Abwaschen. ICC wurde mit DAPI (blau) zur Quantifizierung der Gesamtzellzahl und solche Anzeige apoptotische Morphologie und isolectin-B4 (IB 4) (grün) für Mikro Identifizierung und Quantifizierung durchgeführt. Balken = 30 um. (B) Quantifizierung von Zellen, die apoptotische Morphologie, definiert als Kern Chromatinkondensation (graue Balken;% derGesamtzellzahl in dem Feld) und die Gesamtzahl Mikroglia, als Prozentsatz des Steuerungsebenen (grüne Balken). T -Tests ungepaarten Student wurden zwischen den betreffenden Kontrollen und eine spezifische Behandlung der LME durchgeführt wird; * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; n = 3 (dh 3 unabhängige Wiederholungen).
Figur 2: Charakterisierung der Wirkungen von 25 mM LME-Behandlung auf Neuronen und Astrozyten in CGC Kulturen. Panel repräsentativer Bilder von ICC Experimente an CGC Kulturen nach der Behandlung für 1 Stunde durchgeführt, die mit 25 mM LME. ICC wurde mit DAPI (blau), Anti-β-III-Tubulin (grün) zur Identifikation von Änderungen der neuronalen Dichte und Anti-GFAP (rot) zur Identifizierung von Änderungen in Astrozyten Dichte und Morphologie durchgeführt. Negativkontrolle (-ve CTR) Bilder stellen CGC Kulturen, wobei das primäre antibodies wurden weggelassen. Balken = 30 um.
Figur 3: Eine weitere Charakterisierung der Wirksamkeit der 25 mM LME-Behandlung bei der Entfernung von Mikroglia astrocytic Kulturen. (A) Steuerung repräsentativer Bilder von ICC Experimente an primären Astrozytenkulturen nach Vorbehandlung für 1 Stunde durchgeführt, die mit 25 mM LME. ICC wurde mit DAPI (blau), Anti-GFAP (rot) zur Identifizierung von Änderungen in Astrozyten Dichte und Morphologie sowie Anti ED1 (grün) für die Identifizierung von Mikronummer durchgeführt. (B) Repräsentative Bilder von ICC Experimente an primären Astrozytenkulturen nach der Behandlung durchgeführt mit LPS (1 ug / ml) 24 h nach einer Vorbehandlung mit 25 mM LME für 1 Stunde. ICC wurden wie in A, jedoch mit Anti-GFAP (grün) und anti-iNOS (rot) beschrieben aktiviert microg identifizieren geführtlia. Negativkontrolle (-ve CTR) Bilder stellen CGC Kulturen wobei die primären Antikörper wurden ausgelassen. Balken = 30 um.
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Discussion
Die wichtigsten Schritte, um die erfolgreiche selektive Elimination von Mikroglia CGC sichern und / oder Mischkulturen sind: 1) die Aufrechterhaltung einer sterilen und gesunde CGC Kultur; 2) Sterilfiltrieren der LME haltigen Medium und Rückführen der Lösung auf pH 7,4; 3) halten die beibehalten CGC Medien und LME haltigen Medien bei 37 ° C, um Hitzeschock zu vermeiden; und 4) schnell arbeiten, um die Zeit-Zellen werden außerhalb des Inkubators gehalten zu reduzieren.
Wir haben 25 mM LME zu Mikroglia aus unserem CGC Kulturen führen - einer Konzentration zuvor in unserem Labor optimiert. Dennoch bleiben einige Mikrogliazellen in Kultur folgenden LME Behandlung, die einige glauben könnte eine Bevölkerung von differenzierten, nicht proliferierenden Mikroglia zu reflektieren. Tatsächlich Hamby et al. (2006) fanden heraus, dass 50 bis 75 mM LME war erforderlich, um Mikroglia von High-Density-Astrozyten Monoschichten 13 zu beseitigen. Wir haben auch vorher, dass in reinen Mikro c gezeigtultures war 10 mM LME ausreichen, um alle Mikroglia zu töten, aber nur mit einer 24-Stunden-Inkubationszeit 14.
Alternative Methoden zum Zellkulturmodelle von kontaminierenden Mikroglia befreien haben kürzlich bekannt. Crocker et al. (2008) zeigte einen neuen Ansatz zur Mikroglia Astrocytenkulturen durch Förderung der neuronalen Stammzelle (NSC) Differenzierung in Astrozyten in postnatalen (P0-P2) Mäusen 15 zu eliminieren. Sie fanden heraus, dass diese Technik vollständig beseitigt Mikroglia aus den Kulturen, obwohl die Mechanismen, die die Phänomene sind nicht bekannt. . Darüber hinaus Kumamaru et al (2012) verwendet liposomalen Clodronat - eine biophosphonate bekannt, die Apoptose in Makrophagen zu induzieren - auf Mikrogliazellen in primären Astrozyten-Kulturen von P3-Mäuse 16 zu beseitigen. Diese Verbindung funktioniert in ähnlicher Art und Weise und auf der gleichen Ebene der Wirksamkeit als LME; obwohl die Autoren argumentieren, dass, wie LME kann giftig für Astrozyten unter bestimmten Bedingungendurch seine freie Diffusion in Zellen - zu stören Astrozyten Haftungsvermögen 13 - liposomalen Clodronat stellt ein verbessertes Verfahren zur Mikrogliazellen von Kultur führen. Wir dagegen festgestellt, dass 25 mM LME hat keine Auswirkung auf die Lebensfähigkeit oder Proliferation Astrozyten beeinflussen.
Das hier beschriebene Protokoll verwendet eine bestimmte Konzentration der LME selektiv zu eliminieren Mikroglia von Neuronen angereicherten Kulturen von BVKA. Dies stellt eine leistungsfähige experimentellen Ansatz, um den Einfluss der Mikroglia auf Neuronen unter verschiedenen Bedingungen zu bestimmen, und weiterhin, um wichtige Daten zu untersuchen Forscher die Rolle der Neuroentzündung bei neurologischen Erkrankungen bereitzustellen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |
References
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