Introduction
O cérebro humano compreende um número estimado de 85 mil milhões de neurónios e mais 85 mil milhões de células não neuronais, incluindo as células da glia 1. Para a maior parte dos últimos 100 anos os neurocientistas têm focado predominantemente na população de células neuronais, acreditando células gliais ser pouco mais do que as células passivas de apoio que forneceram suporte estrutural para os neurônios - daí a etimologia grega da "glia" traduzido para o Inglês como "cola". Recentemente, no entanto, tornou-se cada vez mais evidente que as interacções neuronais-glial pode ser muito mais fundamental para aspectos básicos da neurobiologia, neurofisiologia, ea gênese e progressão de várias doenças neurodegenerativas. Células do cerebelo granulares (CTC), a população neuronal homogênea mais abundante no cérebro humano, dominar o cerebelo e tornar-se mais de 90% dos seus constituintes celulares. Por conseguinte, estas células têm sido extensivamente usados in vitro, como um sistema modelo para o tele estudo do desenvolvimento neuronal, função e patologia 2-6.
No entanto, as culturas CGC ainda conter outros microglia e as células da glia em proporções significativas, sem dúvida. Como resultado, os dados que indicam CGC putativamente respostas neuronais directos para tratamentos diferentes de células podem, de facto surgir - em parte ou no total, - a partir da resposta secundária indirecta de células gliais vizinho na cultura. Para avaliar isto, eliminada selectivamente da microglia CGC de culturas neuronais, com o auxílio de éster metílico de L-leucina (LME). LME é um agente lysomotropic originalmente usado para destruir selectivamente macrófagos 7, e uma vez que tem sido utilizada para esgotar a microglia também selectivamente a partir neural, astrócitos, e culturas gliais mistas 8,9,10. LME é internalizado pelos macrófagos e microglia, em que ele provoca perturbações lisossômico e apoptose subseqüente 13,14. Macrófagos e microglia são caracteristicamente rica em lisossomos, fazendo com que sejam particularly vulnerável após a exposição ao tratamento LME. Este protocolo fornece uma maneira poderosa, mas simples e fácil de determinar a contribuição de microglia em experimentos que utilizam outros sistemas de cultura neuronal / CGC e gliais.
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Protocol
Todos os experimentos aqui descritos foram realizados de acordo com o Reino Unido Animais (Scientific Procedures) Act, de 1986.
1. Preparação de Instrumentos, Meios de Cultura, e pratos
- Prepare duas tesouras de aço inoxidável laboratório de dissecação e duas pinças de laboratório de aço inoxidável. Autoclave todos os instrumentos e lugar em uma capa de cultura O / N sob luz ultravioleta (UV) para a esterilização.
- Adicione 500 ml de meio essencial (MEM), meio mínimo de cultura (10% de Soro Bovino Fetal [FBS], KCl 20 mM, 25 mM de NaHCO 3, 30 mM de D-glicose, 2 mM de L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e 6 ug / ml de ampicilina) e esterilizar filtro. Armazenar a 4 ° C durante meses.
- Prepare placas de cultura de 24 poços contendo 14 milímetros, número um lamelas de espessura. Autoclave as lamelas e revestimento em 100 mg / L de poli-d-lisina (PDL) como previamente descrito 3. Luz UV esterilizar O / N.
2. Preparação de Soluções CGC Cultura
- Prepare 'Uma solução de' (100 ml) em autoclave, a luz UV tratada, estéril dH 2 O contendo 250 mg de glucose, 300 mg de albumina de soro bovino [BSA], 955 mg de fosfato salino tamponado [PBS] (Ca 2+ e Mg + livre), e 1 ml de 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O.
- Prepare a 'solução B' (10 ml) contendo 1 ml de 5 mg / ml de tripsina diluída em 9 ml de solução A.
- Prepare a 'solução C »(10 ml) contendo 1000 unidades de ADNase, 0,5 mg de inibidor de tripsina de soja, 100 ul de 3,8% MgSO 4 7H 2 O ·, diluída para 10 ml com solução A.
- Prepare a 'solução D' (20 ml) contendo 3,2 ml de solução C, diluída para 20 ml com solução A.
- Preparar a solução de BSA / de Solução Salina Equilibrada de Earle (EBSS) contendo EBSS, NaHCO 3 25 mM, 3 mM MgSO 4 · 7H 2 O, e4% de BSA, pH 7,4, conforme anteriormente descrito 3.
- Prepare LME adicionando ácido clorídrico puro LME em 5 ml de meio de cultura MEM para dar uma concentração final de 150 mM de LME, voltar a solução a pH 7,4 usando um medidor de pH de bancada, e filtro de esterilização usando uma sulfona de poliéter 28 milímetros (PES) de 0,2 um seringa filtro.
3. Cultura das CGCs
- Recolha cerebella 4-7 dias de idade filhotes de ratos, como descrito anteriormente 3. Colocar imediatamente em placa de Petri contendo 5 ml de solução A em gelo.
- Deitar fora o excesso de solução de cerebelo e local de tecido na tampa placa de Petri.
- Pique finamente tecido com uma lâmina de barbear bem-inflamado em pelo menos três direções diferentes.
- Adicionar tecido picado à solução B (enxaguar placa de Petri com solução de assegurar tecido limitada é perdido), e colocados no banho de água a 37 ° C durante 5 min. Agitar suavemente a cada dois minutos.
- Adicionar a solução D (20 ml) para o tubo para neutralizar a tripsina, a vibração e centorifuge a 65 xg durante 5 min.
- Deitar fora o sobrenadante.
- Ressuspender em 4 ml de solução C. Tritura-se bem (aproximadamente 10 vezes cada) com três pipetas de vidro ardido de diâmetro decrescente, até que a suspensão é mais homogénea possível.
- Lentamente e suavemente adição de algumas gotas de este homogeneizado no topo da BSA / EBSS. Se ele começa a afundar através do BSA / EBSS, triturar mais e / ou adicionar um pouco mais de solução C. O homogeneizado deve sentar-se em uma camada em cima da BSA / EBSS. Não agite. Gire a 100 g durante 5 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento (mole) em 1 ml de meio MEM.
- Contagem de células utilizando um hemocitómetro e a placa a 800.000 células / lamela em 500 ul de meio MEM. Colocar numa incubadora a 37 ° C com 6% de CO 2.
- Mudar o meio do dia seguinte (24-36 horas após a preparação). Adicione uma solução de meio MEM contendo 10 uM do inibidor do ciclo celular arabinofuranosil citidina (AraC).
- Para cadalamela, reter 250 ul do meio de idade, em uma nova placa de 24 poços, aspirar o resto, adicione 250 mL de meio MEM normal e aspirar este para lavar as células, em seguida, adicione os 250 mL de meio antigo de volta para as células e top-up com 250 ul de meio contendo AraC.
Nota: As células podem ser utilizadas a partir de 6 dias in vitro (DIV).
- Para cadalamela, reter 250 ul do meio de idade, em uma nova placa de 24 poços, aspirar o resto, adicione 250 mL de meio MEM normal e aspirar este para lavar as células, em seguida, adicione os 250 mL de meio antigo de volta para as células e top-up com 250 ul de meio contendo AraC.
4. seletivamente empobrecem a Microglia (realizada em 6 DIV)
- Adicionar LME puro para 5 ml de uma alíquota separada de meio MEM para dar uma concentração final de 150 mM LME.
- Retorne a solução para pH 7,4 e filtro de esterilizar utilizando um polietersulfonas 28 milímetros (PES) filtro de seringa de 0,2 um.
- Diluir solução a uma concentração de 50 mM (2 x LME) em meio MEM e colocar num banho de água a 37 ° C durante 10 minutos juntamente com meio normal MEM para culturas de controlo.
- Remover metade (250 ul) a partir de culturas de meio MEM CGC e reter a 37 ° C.
- Tratar célulascom meio MEM contendo 2 x LME (250 ul), isto é, diluída 1: 1, dando assim uma concentração de 25 mM, ou com meio de pré-aquecido MEM sem LME (250 ul) para culturas de controlo.
- Incubar as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 6% de CO 2 durante 1 h.
- Lave as células duas vezes em meio de pré-aquecido fresco MEM para remover LME contendo mídia, e, em seguida, substituir o meio de cultura retido e um volume igual de meio de pré-aquecido fresco MEM aos poços correspondentes.
- Culturas e volta para a incubadora (humidificado com 6% de CO2 a 37 ° C) e deixar em repouso durante 24 horas antes de qualquer tratamento adicional.
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Representative Results
A capacidade desta técnica para eliminar selectivamente a partir CGC microglia e / ou culturas mistas baseia-se na capacidade subsequente do investigador para identificar com precisão e diferenciar microglia das suas células vizinhas. Isto pode ser alcançado utilizando uma máquina de células específicas de microglia, tais como isolectina-B4, tal como ilustrado na Figura 1. Tal como demonstrado na Figura 2, não há alterações observáveis para astrócitos e densidade neuronal e morfologia foram registadas em relação a cada grupo de tratamento principal. Mais importante, não houve alteração significativa na morfologia neuronal ou astrocítica foram observadas quando as culturas foram tratadas com LME sozinho, suportando uma acção específica do microglia do composto. A Figura 3A mostra não há alterações observáveis na densidade e morfologia de astrócitos primários a partir de roedor cultura de astrócitos 12, mas faz exibir uma perda de microglia contaminantes. Na Figura 3B, como em A, não há alterações na astrocyforam observados densidade e morfologia de te; no entanto, foi observada uma perda de contaminar número microglial e reactividade. Para uma breve descrição do (ICC) immunocytochemistry protocolo utilizado neste manuscrito, por favor ver referência 11.
Figura 1: Caracterização de tratamento LME da CGC. (A) Imagens representativas de imunocitoquímica (ICC) experimentos realizados em culturas CGC após o tratamento com LME 25-75 mM durante 1 hora, seguido de lavagem-off. ICC foi realizada com DAPI (azul) para a quantificação do número de células total e aqueles exibindo morfologia apoptótica, e isolectin-B4 (IB 4) (verde) para a identificação e quantificação microglial. Barra de escala = 30 um. (B) Quantificação de células que exibem morfologia apoptótica, definida como a condensação da cromatina nuclear (barras cinzentas;% denúmero total de células no campo) e o número total de microglia, como uma percentagem dos níveis de controlo (barras verdes). -Testes T de Student não pareado foram realizadas entre os controles relevantes e um tratamento específico da LME; * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; n = 3. (isto é, três repetições independentes).
Figura 2: Caracterização dos efeitos de tratamento LME 25 mM em neurónios e astrócitos em culturas CGC. Painel de imagens representativas de experiências realizadas em culturas ICC CGC após o tratamento com LME 25 mM durante 1 h. TPI foi realizada com DAPI (azul), anti-β-III-tubulina (verde) para a identificação de alterações na densidade neuronal e anti-GFAP (vermelho) para a identificação de alterações na densidade e morfologia de astrócitos. Controle negativo (CTR) -vos imagens representam culturas CGC em que o antibodie primários foram omitidos. Barra de escala = 30 um.
Figura 3: A caracterização da eficácia do tratamento LME 25 mM na remoção da microglia de culturas astrocíticos. (A) um painel de imagens representativas de ICC experimentos realizados em culturas de astrócitos primários após o pré-tratamento com LME 25 mM durante 1 h. TPI foi realizada com DAPI (azul), anti-GFAP (vermelho) para a identificação de alterações na densidade e morfologia de astrócitos, e anti-ED1 (verde) para a identificação do número de microglia. (B) Imagens representativas de ICC experimentos realizados em culturas de astrócitos primários após tratamento com LPS (1 ug / ml) durante 24 horas seguintes pré-tratamento com LME 25 mM durante 1 h. TPI foi realizada como descrito em A, mas com anticorpos anti-GFAP (verde) e anti-iNOS (vermelho) para identificar microg activadalia. Controle negativo (-ve imagens CTR) representam culturas CGC em que os anticorpos primários foram omitidos. Barra de escala = 30 um.
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Discussion
Os passos mais importantes para garantir a eliminação seletiva de sucesso de microglia do CGC e / ou culturas mistas são: 1) a manutenção de uma cultura CGC estéril e saudável; 2) filtro de esterilização a forma LME contendo e voltando a solução para pH 7,4; 3) manter os meios de comunicação CGC retidos e LME contendo media a 37 ° C para evitar choque térmico; e 4) a trabalhar rapidamente para reduzir o tempo de células são mantidas fora da incubadora.
Utilizou-se LME 25 mM a esgotar microglia dos seus culturas CGC - uma concentração previamente optimizado no nosso laboratório. No entanto, alguns microglia ainda permanecem em cultura após o tratamento LME, que alguns acreditam que pode refletir uma população de diferenciado, microglia não proliferando. Com efeito, Hamby et al. (2006) descobriram que LME 50-75 mM foi necessário para eliminar a microglia de monocamadas de astrócitos de alta densidade 13. Também mostramos anteriormente que, em puro c microglialultures, 10 LME mM foi suficiente para matar todos os microglia, mas apenas com um tempo de incubação de 24 horas 14.
Métodos alternativos para livrar modelos de cultura de células de contaminação microglia têm vindo recentemente à luz. Crocker et ai (2008). Demonstrada uma nova abordagem para eliminar a partir de culturas de astrócitos microglia por promover a diferenciação de células estaminais neurais (NSC) em astrócitos em pós-natal (P0-P2) 15 ratinhos. Eles descobriram que esta técnica eliminado completamente microglia a partir das culturas, embora os mecanismos subjacentes aos fenómenos são desconhecidos. . Além disso, Kumamaru et al (2012) utilizaram lipossomal clodronato - um biophosphonate conhecido por induzir a apoptose em macrófagos - para eliminar a microglia em culturas de astrócitos primários a partir de 16 ratos P3. Este composto funciona de uma forma semelhante e com o mesmo nível de eficácia como LME; embora os autores argumentam que, como LME pode ser tóxico para os astrócitos, sob certas condiçõesdevido à sua difusão livre em células - interrompendo capacidade de adesão astrocyte 13 - clodronate lipossomal representa um método melhorado para esgotar microglia da cultura. Nós, no entanto, descobriu que LME 25 mM não tem efeito sobre a viabilidade ou a proliferação de astrócitos.
O protocolo aqui descrito utiliza uma concentração específica de LME para eliminar selectivamente microglia a partir de culturas enriquecidas com neurônios de CGCs. Isto representa uma abordagem poderosa experimental para determinar a influência da microglia em neurónios em várias condições, e continua a fornecer os dados importantes para investigadores investigaram o papel de neuroinflama�o em distúrbios neurológicos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |
References
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