Introduction
人間の脳は、推定850億のニューロンおよびグリア1を含むさらに850億非神経細胞を含みます。過去100年間の大部分のために神経科学者は、ニューロンのための構造的支持を提供した受動支持細胞より少しであることがグリア細胞を信じて、神経細胞集団に主に焦点を当てている - それ故に「グリア」のギリシャ語の語源は、英語に翻訳します「接着剤」。しかし最近では、それは、神経膠細胞の相互作用がはるかに根本的な神経生物学、神経生理学、および多くの神経変性疾患の発生および進行の基本的な側面になる可能性があることがますます明らかになりました。小脳顆粒細胞（CGCS）、ヒトの脳で最も豊富な均質なニューロン集団は、小脳を支配し、その細胞成分の90％以上を占めています。したがって、これらの細胞は、Tのためのモデル系として、in vitroで広範に使用されています彼は、神経発達、機能、および病理2-6の検討します。
しかし、CGC培養はまだ間違いなくかなりの割合でミクログリア及びその他のグリアが含まれています。その結果、推定される種々の細胞治療への直接神経細胞応答を表示するCGCデータは、実際に発生する可能性がある - 一部または全体で - 文化の中で、隣接するグリアの間接的な二次応答から。これを評価するために、我々は、選択的に、L-ロイシンメチルエステル（LME）の助けを借りてCGCニューロン培養物からミクログリアを除去しました。 LMEは、もともと選択マクロファージ7を破壊するために使用lysomotropic剤であり、以降も選択的神経、アストロサイト、および混合膠細胞培養8,9,10からミクログリアを枯渇させるために使用されてきました。 LMEは、リソソームを破砕した後、アポトーシス13,14を引き起こしており、マクロファージおよびミクログリアによって内在化されます。マクロファージおよびミクログリアは、彼らがparticulaであることを引き起こして、リソソームにおける特徴豊富ですLMEの治療に暴露されるとRLY脆弱。このプロトコルは、CGC、その他のグリア/ニューロンの培養系を利用した実験でミクログリアの貢献を把握するための強力な、まだシンプルで簡単な方法を提供します。
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Protocol
本明細書に記載の全ての実験は、1986年の英国動物（科学的手続）法に基づいて実施しました。
楽器、文化メディア、および料理の作製
- 2つのステンレス鋼実験室解剖ハサミと2つのステンレス鋼実験用鉗子を準備します。紫外線下で培養フードO / Nですべての機器と場所をオートクレーブ滅菌用（UV）光。
- 最小必須培地（MEM）培地（10％ウシ胎児血清[FBS]、20mMの塩化カリウム、25mMのNaHCO 3を、30mMのD-グルコース、2mMのL-グルタミン、100 U / mlペニシリン、100 500mlのを作ります/ mlのストレプトマイシンおよび6 / mlのアンピシリン）とフィルター滅菌します。ヶ月間4℃で保存してください。
- 14ミリメートル、数1の厚さのカバースリップを含む24ウェル培養プレートを準備します。先に説明したように3 100 mg / Lのポリ-D-リジン（PDL）でカバースリップおよびコーティングをオートクレーブ。 UV光はO / Nを殺菌します。
CGC培養液の調製
- 処理されたオートクレーブ処理、UV光の「溶液A」（100ミリリットル）、グルコース250mgのを含有する無菌のdH 2 O、ウシ血清アルブミン[BSA]、リン酸緩衝生理食塩水[PBS]（のCa 2+の955 mgの300 mgを準備し、 MG）+自由、および3.8％の1ミリリットルのMgSO 4·7H 2 O
- 5 mg / mlのトリプシン溶液Aの9ミリリットル中に希釈し、1 mlを含む準備「溶液B」（10ミリリットル）
- 「溶液C」1000個のDNアーゼ、大豆トリプシン阻害剤0.5mgの、溶液Aで10mlに希釈した3.8％のMgSO 4·7H 2 Oの100μLを含む（10ml）に準備
- 溶液C 3.2 mlを含有する「溶液D '（20ml）を溶液Aで20mlまで希釈し、準備します
- ·7H 2 O EBSS、25mMのNaHCO 3を、3 mMの硫酸マグネシウムを含むBSA /アールの平衡塩溶液（EBSS）溶液を調製し、4％BSA、pH7.4中で、先に説明した3。
- 、150mMのLMEの最終濃度を得MEM培地5mlに純粋LMEを追加することによってLMEを調製する卓上pHメーターを用いてpH 7.4溶液を返し、フィルタ28ミリポリエーテルスルホン（PES）、0.2μmのシリンジを使用して滅菌フィルター。
3. CGCSを培養
- 以前に3を説明したように4-7日齢のラットの子から小脳を収集します。氷上で5ミリリットル溶液Aを含むペトリ皿に直ちに置きます。
- シャーレのふたで小脳と場所組織から余分な溶液を捨てます。
- 少なくとも三つの異なる方向によく燃え上がっかみそりの刃で細かく組織をみじん切りに。
- 5分間37℃の水浴中で溶液（失われた制限された組織を確保するために溶液でペトリ皿をすすぐ）B及び場所にみじん切り組織を加えます。静か分おきに振ります。
- トリプシン、手ぶれやセントを中和するために、チューブに溶液D（20ミリリットル）を追加5分間、65×gでrifuge。
- 上清を捨てます。
- 直径を小さくする3燃え上がっガラスピペットで十分に溶液C.トリチュレート4mlの（約10回ずつ）で再懸濁し、懸濁液をできるだけ均一になるまで。
- ゆっくり、ゆっくりとBSA / EBSSの上にこのホモジネートを数滴を追加します。それはBSA / EBSSを通じてシンクを開始した場合は、より多くを粉砕するおよび/またはもう少し溶液Cを追加ホモジネートは、BSA / EBSSの上の層に座ってする必要があります。振らないでください。 5分間100×gでスピン。
- 上清およびMEM培地1mlでペレットを再懸濁し（ソフト）を取り外します。
- MEM培地500μlの80万細胞/カバーガラスで血球計数器およびプレートを用いて細胞数を計測します。 6％CO 2で37℃のインキュベーターに入れ。
- 培地を翌日（分取した後24〜36時間）を変更します。細胞周期阻害剤のアラビノフラノシルシチジン（のAraC）の10μMを含むMEM培地の溶液を作ります。
- それぞれについてカバーガラスにして、再び細胞とトップまでの古い培地を250μlを追加、通常のMEM培地250μlを添加し、細胞を洗浄するために、これを吸引し、残りの部分を吸引、新鮮な24ウェルプレートに古い培地250μlのを保持のAraC含有培地250μlのと。
注意：細胞は、 インビトロ （DIV） で 6日間使用することができます。
- それぞれについてカバーガラスにして、再び細胞とトップまでの古い培地を250μlを追加、通常のMEM培地250μlを添加し、細胞を洗浄するために、これを吸引し、残りの部分を吸引、新鮮な24ウェルプレートに古い培地250μlのを保持のAraC含有培地250μlのと。
4.を選択ミクログリアを枯渇（6 DIVに出演）
- 150mMのLMEの最終濃度が得られるようにMEM培地の別々のアリコートを5 mlに純粋なLMEを追加します。
- pHを7.4に解決策を戻し、フィルターは28ミリメートルのポリエーテルスルホン（PES）、0.2μmのシリンジフィルターを用いて滅菌します。
- コントロール培養のための通常のMEM培地と共に10分間37°Cの水浴中でMEM培地と場所での50mM（2×LME）の濃度に溶液を希釈。
- CGC培養から半分（250μl）をMEM培地を除去し、37℃で保持します。
- 細胞を処理します、または対照培養のためのLMEのない予め温めたMEM培地（250μl）を、25 mMとウェル濃度を与える1： すなわち 2×LME（250μl）を含むMEM培地で1希釈しました。
- 1時間、6％CO 2の加湿雰囲気中、37℃で細胞をインキュベートします。
- 洗浄細胞を2回新鮮予め温めたMEM培地中のLME含有培地を除去し、その後、対応するウェルに保持された培地と新鮮予め温めたMEM培地を等量置き換えます。
- （37℃で6％CO 2の加湿）インキュベーターに文化を戻し、任意のさらなる処理の前に24時間休ませるままにします。
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Representative Results
選択的CGCおよび/または混合培養物からミクログリアを排除するために、この技術の能力を正確に識別し、その周囲の細胞からミクログリアを区別するために、研究者のその後の能力に依存しています。 図1に示されるように、これは、例えば、イソレクチンB4として、マイクログリア特異的細胞マーカーを使用して達成することができる。 図2に示すように、星状細胞およびニューロンの密度および形態学に対する観察可能な変化は、各メイン処理群に対して記録されませんでした。培養物は、化合物のミクログリア固有のアクションをサポートし、単独LMEで処理した場合重要なことは、神経細胞またはアストロサイトの形態に有意な変化は観察されなかった。 図3（a）は、一次げっ歯類アストロサイト培養物12からアストロサイトの密度と形態の観察可能な変化を示さないが、ありません汚染ミクログリアの損失が表示されます。 図3Bにおいて、Aのように、変更なしastrocyでTE密度と形態が見られました。しかし、ミクログリア数および反応性の汚染の損失が観察されました。この原稿で使用される免疫細胞化学（ICC）プロトコルの簡単な説明については、11を参照して参照してください。
図1：CGCSのLME処理の特性 。免疫細胞化学から（A）代表的な画像（ICC）の実験は、洗い流した後、1時間25〜75 mMのLMEで処理した後CGC培養上で実行します。 ICCは、ミクログリアの同定および定量化のための全細胞数の定量化のためのDAPI（青色）と、それらの表示アポトーシス形態、およびイソレクチンB4（IB 4）（緑）を用いて行きました。 =30μmのスケールバー。 （B）アポトーシス形態を示す細胞の定量化、核クロマチンの凝縮（灰色バーとして定義され;の％対照レベル（緑色のバー）の割合として分野における総細胞数）および総ミクログリア数。対応のないスチューデントの t -testsは、関連するコントロールとLMEの特定の治療法との間で行われました。 * P <0.05、** P <0.01、*** p <0.001。 N = 3（ すなわち、3つの独立した反復）。
図2：CGC培養における神経細胞とアストロサイト上の25mMのLME治療の効果の評価 。 1時間25 mMのLMEで処理した後CGC培養上で行わICC実験からの代表的な画像のパネル。 ICCは、星状細胞密度および形態の変化を同定するための神経細胞密度および抗GFAP（赤）の変化を同定するための抗β-IIIチューブリン（緑）、DAPI（青）を用いて行きました。ネガティブコントロール（-ve CTR）画像はCGC培養を表すプライマリantibodieSは省略しました。 =30μmのスケールバー。
図3：星状細胞の培養物からのミクログリアの除去に25 mMのLMEの治療の有効性のさらなる特徴 。 （A）1時間、25mMのLMEで前処理した後、一次星状細胞培養物に対して行っICC実験からの代表的な画像のパネル。 ICCは、星状細胞の密度および形態、およびミクログリア数を同定するための抗ED1（緑）の変化を同定するためのDAPI（青色）、抗GFAP（赤）を用いて行きました。 （B）1時間、25mMのLMEでの前処置後24時間LPS（1μg/ ml）で処理した後、一次星状細胞培養物に対して行っICC実験からの代表的な画像。 ICCは、活性化マイクログラムを識別するために、Aに記載のように行っが、抗GFAP（緑）および抗iNOSの（赤）としLIA。一次抗体を省略した前記ネガティブコントロール（-ve CTR）画像はCGC培養を表します。 =30μmのスケールバー。
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Discussion
CGCからミクログリアの成功選択的除去を確実にするために最も重要なステップおよび/または混合培養物は、1）滅菌し、健康CGC文化を維持します。 2）フィルタは、LME含有培地を滅菌し、pHを7.4に溶液を戻します。 3）37に保持CGC媒体とLME含有培地を維持 ヒートショックを回避するため°C; 4）細胞をインキュベーターの外に保持される時間を短縮するために迅速に取り組ん。
以前に我々の研究室で最適化された濃度 - 私たちは、CGC培養物からミクログリアを枯渇させるために、25mMのLMEを使用していました。それにもかかわらず、いくつかのミクログリアは、まだいくつかの差別化、非増殖ミクログリアの人口を反映している可能性が信じているLME処理を、以下の培養中に残っています。実際、ハンビーら （2006）50-75 mMのLMEが高密度星状細胞単層13からミクログリアを除去するために必要であったことを発見しました。また、純粋なミクログリアCのことが以前に示されていますultures、10mMのLMEはなく、わずか24時間のインキュベーション時間14で、すべてのミクログリアを殺すのに十分でした。
ミクログリアの混入細胞培養モデルを取り除くための別の方法は、最近明るみに出てきました。クロッカーら （2008）（P0-P2）出生後のマウス15にアストロサイトへの神経幹細胞（NSC）の分化を促進することによって、星状細胞培養物から小グリア細胞を除去するための新規なアプローチを示しました。現象の根底にあるメカニズムは不明であるが、それらは、この技術は完全に培養物からミクログリアを除去することを見出しました。 。また、Kumamaru ら （2012）は、リポソームを使用クロドロネート-マクロファージのアポトーシスを誘導することが知られているbiophosphonateを- P3マウス16からの一次星状細胞培養物におけるミクログリアを排除します。この化合物は、同様の方法でとLMEとして有効性の同じレベルで動作します。著者らは、LMEが一定の条件の下で星状細胞に毒性であり得るようにと主張するものの星状細胞の接着能力13を破壊する- -による細胞内への自由拡散にリポソームクロドロネートを培養物からミクログリアを枯渇させる改良された方法を表します。我々は、しかし、25 mMのLMEには星状細胞の生存率または増殖に影響を与えていることが分かっていません。
本明細書に記載されているプロトコルを選択CGCSのニューロン富化培養物からミクログリアを除去するためにLMEの特定の濃度を使用しています。これは、様々な条件の下でのニューロンのミクログリアの影響を決定するための強力な実験的なアプローチを示し、神経疾患における神経炎症の役割を調査する研究者に重要なデータを提供し続けています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |
References
- Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).
- Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).
- Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).
- Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).
- Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).
- Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).
- Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).
- Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116 (2012).
