Introduction
Человеческий мозг содержит оценкам, 85 миллиардов нейронов и дальнейшие 85 миллиардов без нервных клеток глии в том числе 1. Для большей части последних 100 лет неврологи, ориентированных преимущественно на нейронной популяции клеток, полагая, глиальные клетки, чтобы быть немного больше, чем пассивные поддерживающих клеток, которые представили структурную поддержку для нейронов - отсюда греческого этимологии "глии 'в переводе с английского, как "клей". Однако в последнее время, становится все более очевидным, что нейронные-глиальных взаимодействий может быть гораздо более фундаментальное значение для основных аспектов нейробиологии, нейрофизиологии и генезиса и прогрессирования многих нейродегенеративных заболеваний. Мозжечка ЗК (CGCs), наиболее распространенным однородная нейронная населения в человеческом мозге, доминировать в мозжечок и составляют более 90% своих клеточных составляющих. Следовательно, эти клетки широко используются в пробирке в качестве модельной системы для тон изучению развития нейронов, функции и патологии 2-6.
Тем не менее, CGC культуры по-прежнему содержат микроглии и других глии в возможно значительных пропорциях. В результате, данные, отображающие CGC предположительно прямые нейрональные ответов на различных обработок клеток на самом деле может возникнуть - в частично или полностью - от косвенного вторичной реакции соседних глии в культуре. Для оценки этого, мы селективно элиминируют микроглии от CGC нейрональных культур с помощью L-лейцина метилового сложного эфира (LME). LME является lysomotropic агент первоначально использовались выборочно уничтожать макрофагов 7, и с тех пор используется также выборочно разрушают микроглии от нервных, астроцитов и глиальных культур смешанных 8,9,10. ЛБМ интернализуется макрофагами и микроглии, в котором он вызывает нарушение лизосом и последующее апоптоз 13,14. Макрофаги и микроглии характерно богаты лизосом, заставляя их быть particulaжелезная дорога уязвимы при воздействии лечения LME. Этот протокол обеспечивает мощный, но простой и легкий способ удостовериться вклад микроглии в экспериментах с использованием CGC и другие нейронные системы / глиальные культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты, описанные здесь, были выполнены в соответствии с Соединенным Королевством животных (научные процедуры) Закона 1986 года.
1. Подготовка инструментов, медиакультуры и блюда
- Приготовьте два из нержавеющей стали лаборатории рассекает ножницы и два из нержавеющей стали лабораторные щипцы. Автоклав все инструменты и место в культуре капот O / N в ультрафиолетовом свете (УФ) светом для стерилизации.
- Сделать 500 мл минимальной необходимой медиа (MEM) культуральной среды (10% фетальной бычьей сыворотки [FBS], 20 мМ KCl, 25 мМ NaHCO 3, 30 мМ D-глюкозы, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 6 мкг / мл ампициллина) и фильтр стерилизуют. Хранить при 4 ° С в течение месяца.
- Подготовка 24-луночные культуры, содержащие 14 мм, толщиной 1 номер покровные. Автоклав покровные и пальто в 100 мг / л поли-D-лизина (PDL), как описано ранее 3. УФ-свет стерилизации O / N.
2. Подготовка CGC культуры Solutions
- Готовят раствор "А" (100 мл) в автоклаве, обработанной УФ-светом, стерильной дН 2 O, содержащий 250 мг глюкозы, 300 мг бычьего сывороточного альбумина [BSA] 955 мг в забуференном фосфатом солевом растворе PBS [] (Са 2+ и Mg + бесплатно), и 1 мл 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O.
- Готовят раствор 'В' (10 мл), содержащий 1 мл 5 мг / мл трипсина, разведенного в 9 мл раствора А.
- Подготовка 'C' решение (10 мл), содержащие 1000 единиц ДНКазы, 0,5 мг ингибитора трипсина сои, 100 мкл 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O, разбавленные до 10 мл раствора А.
- Готовят раствор 'D' (20 мл), содержащий 3,2 мл раствора С, разбавленного до 20 мл раствора А.
- Подготовка сбалансированный солевой раствор (EBSS) решение BSA / Эрла, содержащий EBSS, 25 мМ NaHCO 3, 3 мМ MgSO 4 · 7H 2 O, и4% БСА, рН 7,4, как описано ранее 3.
- Подготовьте LME добавлением чистой LME в 5 мл культуральной среды МЕМ, чтобы получить конечную концентрацию 150 мМ LME, возвращают раствор до рН 7,4 с помощью рН-метр настольный, и фильтр стерилизуют с помощью 28 мм полиэфирсульфон (PES) 0,2 мкм шприца фильтр.
3. Культивирование CGCs
- Соберите мозжечка от 4-7-дневных крысят, как описано ранее 3. Сразу же в чашку Петри, содержащую 5 мл раствора А на льду.
- Вылейте излишки раствора из мозжечка и место ткани в блюдо крышкой Петри.
- Чоп ткани мелко с хорошо пылал лезвием по крайней мере в трех различных направлениях.
- Добавить нарезанный ткани в раствор Б (ополоснуть чашку Петри с раствором, чтобы обеспечить ограниченную ткани теряется) и поместить в водяную баню при 37 ° С в течение 5 мин. Слегка встряхнуть каждую пару минут.
- Добавить решение D (20 мл) в пробирку, чтобы нейтрализовать трипсина, встряхнуть и центаrifuge на 65 мкг в течение 5 мин.
- Вылейте супернатант.
- Ресуспендируют в 4 мл раствора C. растирают а (примерно в 10 раз каждый) с тремя Flamed стеклянных пипеток уменьшением диаметра, пока суспензия не является как можно более однородным.
- Медленно и осторожно добавить несколько капель этого гомогената на вершине BSA / EBSS. Если он начинает тонуть через BSA / EBSS, растереть все больше и / или добавить немного больше раствора C. Гомогенат должны сидеть в слое на верхней части BSA / EBSS. Не трясти. Спин на 100 мкг в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок (мягкие) в 1 мл среды МЕМ.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра и пластины на 800000 клеток / покровное в 500 мкл среды МЕМ. Место в инкубаторе при 37 ° С с 6% СО 2.
- Изменить среды на следующий день (24-36 ч после подготовки). Сделать раствор среде МЕМ, содержащей 10 мкМ ингибитора клеточного цикла Арабинофуранозил цитидина (AraC).
- Для каждогопокровное, сохраняют 250 мкл старой среды в свежем 24-луночного планшета, аспирация остальное, добавить 250 мкл нормальной среде МЕМ и аспирации это мыть клетки, затем добавить 250 мкл среды старой обратно в клетки и верхней вверх 250 мкл AraC среде, содержащей.
Примечание: Клетки могут быть использованы из 6 дней в пробирке (DIV).
- Для каждогопокровное, сохраняют 250 мкл старой среды в свежем 24-луночного планшета, аспирация остальное, добавить 250 мкл нормальной среде МЕМ и аспирации это мыть клетки, затем добавить 250 мкл среды старой обратно в клетки и верхней вверх 250 мкл AraC среде, содержащей.
4. Выборочное разрушающие микроглии (Исполняется на 6 DIV)
- Добавить чистого LME 5 мл отдельной аликвоте среде МЕМ с получением конечной концентрации 150 мМ LME.
- Вернуться решение до рН 7,4 и фильтр стерилизуют с помощью 28 мм полиэфирсульфон (PES) 0,2 мкм шприц фильтр.
- Разбавленным раствором до концентрации 50 мм (2 х LME) в среде МЕМ и место в водяной бане при 37 ° С в течение 10 мин вместе с нормальной среде МЕМ для контрольных культурах.
- Удалить половину (250 мкл) в среду MEM от CGC культур и сохраняют при 37 ° С.
- Лечить клеткис среды МЕМ, содержащей 2 х LME (250 мкл), т.е. разбавляют 1: 1 дает концентрацию а 25 мм, или с подогретого MEM среде без LME (250 мкл) в контрольных культурах.
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 6% CO 2 в течение 1 часа.
- Промывают клетки дважды в свежей предварительно нагретой среде МЕМ, чтобы удалить LME-содержащей среде, а затем заменить удерживается культуральную среду и равный объем свежего подогретого MEM среде в соответствующие лунки.
- Возвращение культуры в инкубатор (увлажненный с 6% CO 2 при 37 ° С) и оставить на 24 часов перед дальнейшей обработкой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Способность этого метода избирательного устранения микроглии от CGC и / или смешанных культур опирается на последующее способности следователя точно определить и дифференцировать микроглии от окружающих их клеток. Это может быть достигнуто с использованием микроглии конкретных производителя клеток, таких как isolectin-В4, как показано на рисунке 1. Как показано на рисунке 2, не наблюдаемые изменения астроцитов и нейронов плотности и морфологии не были записаны по отношению к каждой основной группе лечения. Важно отметить, что никаких существенных изменений в нейрональной или астроцитов морфологии не наблюдалось, когда культуры обрабатывали LME один, поддерживая микроглии-специфическим действием соединения. 3А показывает никаких очевидных изменений в плотности астроцитов и морфологии от первичного грызунов астроцитов культуры 12, но делает отображать потерю загрязняющих микроглии. В 3В, как в А, без изменений в astrocyПлотность те и морфология были замечены; Однако, было отмечено потери загрязняющих микроглии число и реактивность. Для краткого описания иммуноцитохимии (МУС) протокол, используемый в этой рукописи см ссылаться 11.
Рисунок 1: Характеристика LME лечения CGCs. (А) Типичные изображения из иммуногистохимии (ICC) Эксперименты проводили на CGC культур после обработки с 25-75 мМ LME в течение 1 ч, после чего смыва. МТП была выполнена с DAPI (синий) для количественного определения общего количества клеток и тех, где отображаются апоптоза морфологии и isolectin-B4 (IB) 4 (зеленый) для микроглии идентификации и количественного. Масштабная линейка = 30 мкм. (Б) Количественная клеток, воспроизводящих апоптоза морфологии, определяемый как конденсации ядерного хроматина (серые полосы;% отОбщее количество клеток в поле) и общее количество микроглии, как процент от контрольных уровней (зеленые полоски). Т-тестов непарных Студенческие проводились между соответствующими управления и специфического лечения LME; * Р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001; п = 3. (т.е. 3 независимых повторов).
Рисунок 2: Характеристика воздействия 25 мМ лечения LME на нейроны и астроциты в CGC культур. Панель представительных изображений из ICC экспериментах на CGC культур после обработки с 25 мМ LME в течение 1 часа. МТП был выполнен с DAPI (синий), анти-β-III-тубулина (зеленый) для идентификации изменений в нейрональной плотности и анти-GFAP (красные) для идентификации изменений в плотности астроцитов и морфологии. Отрицательный контроль (отрицательный CTR) изображения представляют CGC культур, где основной antibodieс были опущены. Масштабная линейка = 30 мкм.
Рисунок 3: Дальнейшая характеристика эффективности лечения 25 мМ LME в удалении от микроглии астроцитов культур. (А) Группа представительных изображений из ICC экспериментах на первичных культурах астроцитов после предварительной обработки 25 мМ LME в течение 1 часа. МТП была выполнена с DAPI (синий), анти-GFAP (красный) для идентификации изменений в плотности и астроцитов морфологии, и анти-ED1 (зеленый) для идентификации микроглии числа. (Б) Типичные изображения из ICC экспериментах на первичных культурах астроцитов после обработки LPS (1 мкг / мл) в течение 24 часов после предварительной обработки с 25 мМ LME в течение 1 часа. МТП проводили, как описано в А, но с анти-GFAP (зеленый) и анти-Inos (красный), чтобы определить активированный мкгЛия. Отрицательный контроль (отрицательный CTR) изображения представляют CGC культур, где первичные антитела были опущены. Масштабная линейка = 30 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важные шаги для обеспечения успешного селективное удаление микроглии от CGC и / или смешанных культур являются: 1) поддержание стерильной и здоровый CGC культуры; 2) Фильтр стерилизации LME-среде, содержащей и возвращение раствора до рН 7,4; 3) ведение нераспределенной CGC массовой информации и на ЛБМ, содержащих носители на 37 ° C, чтобы избежать теплового шока; и 4) работает быстро, чтобы уменьшить время клетки остаются вне инкубатора.
Мы использовали 25 мМ LME истощать микроглии от наших CGC культур - концентрации ранее оптимизированной в нашей лаборатории. Тем не менее, некоторые микроглии остаются в культуре после лечения ЛБМ, который некоторые считают, может отражать население дифференцированного Непролиферирующие микроглии. Действительно, Хэмби др. (2006) обнаружили, что 50-75 мМ ЛБМ требуется устранить микроглии от высокой плотности монослоя астроцитов 13. Мы также показали, что ранее в чистом микроглии Cultures, 10 мМ LME было достаточно, чтобы убить всех микроглии, но только с 24 ч время инкубации 14.
Альтернативные методы избавиться культуры клеток моделей загрязнения микроглии недавно вышли на свет. Крокер и др. (2008) продемонстрировали новый подход к ликвидации микроглии от астроцитов культур путем содействия нейронной стволовых клеток (НСК) дифференциации в астроциты в послеродовом (Р0-Р2) мышей 15. Они обнаружили, что этот метод полностью устранены микроглии из культур, хотя механизмы, лежащие в основе явления неизвестны. . Кроме того, Кумамару др (2012), используемый липосом клодронат - в biophosphonate известный индуцировать апоптоз в макрофагах - устранить микроглии в первичных культурах астроцитов из P3 мышей 16. Это соединение работает аналогично и на том же уровне эффективности, как LME; хотя авторы утверждают, что, как LME могут быть токсичными для астроцитов при определенных условияхиз-за его свободной диффузии в клетки - разрушающих астроцитов адгезии емкость 13 - липосомального клодроната представляет собой усовершенствованный способ, чтобы истощить микроглии от культуры. Мы, однако, обнаружили, что 25 мМ LME не влияет на жизнеспособность астроцитов или пролиферации.
Протокол, описанный здесь, использует определенный концентрации LME избирательно уничтожать микроглии от нейронных обогащенного культур CGCs. Это представляет собой мощный экспериментальный подход, чтобы определить влияние на нейроны микроглии в различных условиях, и продолжает предоставлять важные данные для исследователей, изучающих роль нейровоспаление неврологических расстройств.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |
References
- Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).
- Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).
- Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).
- Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).
- Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).
- Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).
- Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).
- Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116 (2012).
