Introduction
Het menselijk brein bestaat uit een geschatte 85 miljard neuronen en een verdere 85 miljard niet-neuronale cellen, waaronder glia 1. Vandaar de Griekse etymologie van 'glia "vertaald Engels zo - voor het grootste deel van de afgelopen 100 jaar neuroscientists zijn vooral gericht op de neuronale celpopulatie, geloven gliacellen weinig meer dan passieve steuncellen die structurele ondersteuning voor neuronen 'lijm'. Onlangs is het echter steeds duidelijker dat neuronale-gliale interacties veel fundamentele fundamentele aspecten van neurobiologie, neurofysiologie en het ontstaan en de progressie van vele neurodegeneratieve ziekten kunnen zijn. Cerebellaire granule cellen (CBC), de meest voorkomende homogene neuronale populatie in het menselijk brein, domineren het cerebellum en make-up meer dan 90% van de cellulaire bestanddelen. Bijgevolg zijn deze cellen zijn uitgebreid gebruikt in vitro modelsysteem voor thij bestuderen van neuronale ontwikkeling, functie en pathologie 2-6.
Echter, CGC culturen bevatten nog steeds microglia en andere glia in aantoonbaar significante proporties. Hierdoor kan CGC data vermoedelijk weergave van de directe neuronale reacties op andere cel behandelingen daadwerkelijk optreden - gedeeltelijk of geheel - van de indirecte secundaire respons van naburige glia in de kweek. Om dit te bepalen, we selectief afgesplitst microgliale van CGC neuronale kweken met behulp van L-leucine methylester (LME). LME is een lysomotropic middel oorspronkelijk gebruikt om selectief te vernietigen macrofagen 7, en is sindsdien gebruikt om ook selectief afbrekende microglia van neurale, astrocyten, en gemengde gliale culturen 8,9,10. LME wordt geïnternaliseerd door macrofagen en microglia, waarbij veroorzaakt lysosomale ontwrichting en daaropvolgende apoptose 13,14. Macrofagen en microglia zijn karakteristiek rijk aan lysosomen, waardoor ze particula zijnrly kwetsbaar bij blootstelling aan LME behandeling. Dit protocol biedt een krachtige, maar eenvoudige en gemakkelijke manier om de bijdrage van microglia in experimenten met behulp van CGC en andere neuronale / gliale cultuur systemen vast te stellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten die hierin zijn beschreven werden uitgevoerd volgens het Verenigd Koninkrijk Animals (Scientific Procedures) Act van 1986.
1. Voorbereiding van de instrumenten, Cultuur Media en gerechten
- Bereid twee roestvrijstalen laboratorium ontleden schaar en twee roestvrijstalen laboratorium tang. Autoclaaf alle instrumenten en plaats in een cultuur kap O / N onder ultraviolet licht (UV) licht voor sterilisatie.
- Voeg 500 ml minimaal essentieel medium (MEM) kweekmedium (10% foetaal runderserum [FBS], 20 mM KCI, 25 mM NaHCO 3, 30 mM D-glucose, 2 mM L-glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 gg / ml streptomycine en 6 ug / ml ampicilline) en filter steriliseren. Bewaar bij 4 ° C voor maanden.
- Bereid 24 putjes met 14 mm, nummer 1 dikte coverslips. Autoclaaf de dekglaasjes en vacht bij 100 mg / l poly-d-lysine (PDL), zoals eerder beschreven 3. UV-licht steriliseren O / N.
2. Voorbereiding van de CGC Cultuur Solutions
- Bereid 'oplossing A (100 ml) in geautoclaveerde, UV licht behandelde, steriele dH 2 O bevattende 250 mg glucose, 300 mg runderserumalbumine [BSA], 955 mg fosfaat gebufferde zoutoplossing [PBS] (Ca2 + en Mg + vrij) en 1 ml van 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O.
- Bereid 'oplossing B (10 ml) dat 1 ml 5 mg / ml trypsine verdund in 9 ml van oplossing A
- Bereid "oplossing C" (10 ml) dat 1000 eenheden DNase, 0,5 mg sojaboontrypsineremmer, 100 gl 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O, verdund tot 10 ml met oplossing A
- Bereid 'oplossing D' (20 ml) die 3,2 ml oplossing C, verdund tot 20 ml met oplossing A
- Bereid BSA / Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) oplossing die EBSS, 25 mM NaHCO 3, 3 mM MgSO 4 · 7H 2 O, en4% BSA, pH 7,4, zoals eerder beschreven 3.
- Bereid LME door toevoeging pure LME in 5 ml MEM kweekmedium tot een eindconcentratie van 150 mM LME geven, de oplossing op pH 7,4 terug met een benchtop pH meter en filter gesteriliseerd met een 28 mm polyethersulfon (PES) 0,2 urn spuit filter.
3. Het kweken van de CBC's
- Verzamel cerebella 4-7 dagen oude pups rat zoals eerder beschreven 3. Direct plaatsen in petrischaal met 5 ml oplossing A op het ijs.
- Giet het overtollige oplossing uit cerebella en plaats weefsel in de petrischaal deksel.
- Hak fijn weefsel met een goed gevlamd scheermesje in ten minste drie verschillende richtingen.
- Voeg gehakt weefsel aan oplossing B (spoel petrischaal met een oplossing beperkte weefsel zorgen verlies) en overbrengen in een waterbad bij 37 ° C gedurende 5 min. Schud zachtjes om de paar minuten.
- Voeg oplossing D (20 ml) aan de buis trypsine, schudden en cent neutraliserenrifuge bij 65 xg gedurende 5 min.
- Giet supernatant.
- Resuspendeer in 4 ml oplossing C. Triturate goed (ongeveer 10 maal elk) met drie gevlamde glas pipetten van afnemende diameter totdat de suspensie zo homogeen mogelijk.
- Langzaam en voorzichtig enkele druppels van dit homogenaat bovenop de BSA / EBSS. Als het begint te dalen door de BSA / EBSS, tritureer meer en / of voeg een beetje oplossing C. Het homogenaat wordt in een laag bovenop de BSA / EBSS zitten. Niet schudden. Spin bij 100 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder supernatant en resuspendeer pellet (soft) in 1 ml MEM medium.
- Tellen cellen met een hemocytometer en plaat bij 800.000 cellen / dekglaasje in 500 pl MEM medium. Plaats in een incubator bij 37 ° C met 6% CO2.
- Verander het medium de volgende dag (24-36 uur na de prep). Voeg een oplossing MEM medium dat 10 uM van de celcyclus inhibitor arabinofuranosyl cytidine (AraC).
- Perdekglaasje, behouden 250 ui van het oude medium in een frisse 24 wells plaat, zuigen de rest, voeg 250 ul van normale MEM medium en zuig dit om de cellen te wassen, voeg dan de 250 ul van het oude medium terug naar de cellen en vul met 250 pl AraC-bevattend medium.
Opmerking: Cellen kunnen worden gebruikt vanaf 6 dagen in vitro (DIV).
- Perdekglaasje, behouden 250 ui van het oude medium in een frisse 24 wells plaat, zuigen de rest, voeg 250 ul van normale MEM medium en zuig dit om de cellen te wassen, voeg dan de 250 ul van het oude medium terug naar de cellen en vul met 250 pl AraC-bevattend medium.
4. Selectief Depleting de Microglia (Uitgevoerd op 6 DIV)
- Toevoegen pure LME aan 5 ml van een afzonderlijke portie van MEM medium tot een eindconcentratie van 150 mM LME geven.
- Breng de oplossing op pH 7,4 en filter gesteriliseerd met een 28 mm polyethersulfon (PES) 0,2 urn spuitfilter.
- Verdun oplossing tot een concentratie van 50 mM (2 x LME) in MEM medium en in een waterbad bij 37 ° C gedurende 10 min met normale MEM medium voor controlekweken.
- Verwijder de helft (250 ui) MEM medium van CGC kweken en bewaar bij 37 ° C.
- Behandel cellenmet MEM medium dat 2 x LME (250 ui), verdunde 1: 1 geven een goed concentratie van 25 mM, of voorverwarmd MEM medium zonder LME (250 ul) van controlekweken.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 6% CO2 gedurende 1 uur.
- Was cellen tweemaal in vers voorverwarmd MEM medium LME-bevattende media verwijderd en vervang de vastgehouden kweekmedium en een gelijk volume verse voorverwarmde MEM medium tot de overeenkomstige putjes.
- Terug kweken in de broedstoof (bevochtigd met 6% CO2 bij 37 ° C) en laat het rusten gedurende 24 uur voor verdere behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het vermogen van deze techniek om selectief microglia van CGC en / of gemengde kweken elimineren berust op de daaropvolgende vermogen van de onderzoeker nauwkeurig te identificeren en differentiëren microglia van de omringende cellen. Dit kan worden bereikt door een microgliale-specifieke cel maker, zoals isolectin-B4, zie figuur 1. Zoals in figuur 2, werden geen waarneembare veranderingen in astrocyten en neuronale dichtheid en morfologie met betrekking op elke belangrijke behandelingsgroep. Belangrijk, geen significante verandering in neuronale of astrocyten morfologie waargenomen wanneer kweken werden behandeld met LME alleen ondersteuning van een microglia-specifieke werking van de verbinding. Figuur 3A vertoont geen waarneembare veranderingen in astrocyten dichtheid en morfologie van de primaire astrocyten knaagdier kweek 12, maar heeft vertonen een verlies van verontreinigende microglia. In figuur 3B, zoals in A, geen veranderingen in astrocyte dichtheid en morfologie werden gezien; Een verlies van verontreinigende microgliale aantal en reactiviteit waargenomen. Voor een korte beschrijving van de immunocytochemie (ICC) protocol dat wordt gebruikt in dit manuscript, zie referentie 11.
Figuur 1: Analyse van LME behandeling van de CBC's. (A) Vertegenwoordiger beelden van immunocytochemie (ICC) experimenten uitgevoerd op CGC culturen na behandeling met 25-75 mM LME gedurende 1 uur, gevolgd door een wash-off. ICC werd uitgevoerd met DAPI (blauw) voor de kwantificering van het totaal aantal cellen en die tonen van apoptotische morfologie en isolectin-B4 (IB 4) (groen) voor microgliale identificatie en kwantificatie. Scale bar = 30 micrometer. (B) Kwantificering van cellen die apoptotische morfologie, gedefinieerd als nucleaire chromatine condensatie (grijze staven;% vantotale celaantal in het veld) en het totale aantal microglia, uitgedrukt als percentage van controleniveaus (groene balken). Ongepaarde Student's t -testen werden uitgevoerd tussen de betrokken controles en een specifieke behandeling van LME; * P <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001; n = 3. (dwz 3 onafhankelijke herhalingen).
Figuur 2: Karakterisering van het effect van 25 mM LME behandeling op neuronen en astrocyten in CGC kweken. Panel van representatieve beelden van ICC-experimenten uitgevoerd op CGC culturen na behandeling met 25 mM LME gedurende 1 uur. ICC werd uitgevoerd met DAPI (blauw), anti-β-III tubuline (groen) voor de identificatie van veranderingen in neuronale dichtheid en anti-GFAP (rood) voor de identificatie van veranderingen in astrocytaire dichtheid en morfologie. Negatieve controle (ve CTR) beelden vertegenwoordigen CGC culturen waarbij de primaire antibodies werden weggelaten. Scale bar = 30 micrometer.
Figuur 3: Verdere karakterisering van het effect van 25 mM LME behandeling bij het verwijderen van microglia uit astrocytaire kweken. (A) panel van representatieve beelden van ICC experimenten uitgevoerd op primaire astrocyten na voorbehandeling met 25 mM LME gedurende 1 uur. ICC werd uitgevoerd met DAPI (blauw), anti-GFAP (rood) voor de identificatie van veranderingen in astrocytaire dichtheid en morfologie en anti-ED1 (green) voor de identificatie van microgliale nummer. (B) Representatieve beelden van ICC experimenten uitgevoerd op primaire astrocyten kweken na behandeling met LPS (1 ug / ml) gedurende 24 uur na voorbehandeling met 25 mM LME gedurende 1 uur. ICC werd uitgevoerd zoals beschreven in A, maar met anti-GFAP (groen) en anti-iNOS (rood) geactiveerd microg identificerenlia. Negatieve controle (ve CTR) beelden vertegenwoordigen CGC culturen waarbij de primaire antilichamen werden weggelaten. Scale bar = 30 micrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste stappen voor de succesvolle selectieve eliminatie van microglia van CGC verzekeren en / of gemengde kweken zijn: 1) het handhaven van een steriele en gezonde CGC cultuur; 2) filter steriliseren van de LME-bevattend medium en terug de oplossing op pH 7,4; 3) het bijhouden van de ingehouden CGC media en LME-bevattende media bij 37 ° C naar heat shock te voorkomen; en 4) snel werken om de tijd cellen buiten de incubator gehouden verminderen.
We gebruikten 25 mM LME om microglia afbreken van onze CGC culturen - een concentratie eerder geoptimaliseerd in ons laboratorium. Niettemin, sommige microglia nog steeds in de cultuur na LME behandeling, die sommigen geloven kan een populatie van gedifferentieerde, niet-prolifererende microglia weerspiegelen. Immers, Hamby et al. (2006) hebben gevonden dat 50-75 mM LME moest microglia van high-density astrocyten monolagen 13 elimineren. We hebben eerder ook aangetoond dat zuivere microgliale cultures, 10 mM LME was voldoende om alle microglia doden, maar alleen met een 24 uur incubatietijd 14.
Alternatieve methoden om zich te ontdoen celcultuur modellen van verontreinigende microglia zijn onlangs aan het licht gekomen. Crocker et al. (2008) toonden een nieuwe benadering voor microglia van astrocyten te elimineren door het bevorderen neurale stamcellen (NSC) differentiatie in astrocyten in postnatale (P0-P2) 15 muizen. Zij vonden dat deze techniek volledig geëlimineerd microglia van de kweken, hoewel de mechanismen waardoor verschijnselen bekend. . Bovendien Kumamaru et al (2012) gebruikt liposomaal clodronaat - een biophosphonate bekend om apoptose te induceren in macrofagen - tot microglia in primaire astrocyten elimineren van muizen P3 16. Deze verbinding werkt op een soortgelijke wijze en op hetzelfde niveau van werkzaamheid, LME; hoewel de auteurs stellen dat zo kan LME giftig zijn voor astrocyten onder bepaalde voorwaardenvanwege de vrije verspreiding in cellen - verstoren astrocyte hechting capaciteit 13 - liposomaal clodronaat vertegenwoordigt een verbeterde methode om microglia afbreken van cultuur. Wij, echter, vond dat 25 mM LME heeft geen invloed op de astrocyten levensvatbaarheid of proliferatie.
De hierin beschreven protocol maakt gebruik van een bepaalde concentratie van LME om selectief microglia van neuron-verrijkte culturen van CBC's te elimineren. Dit is een krachtige experimentele benadering om de invloed van microglia op neuronen onder verschillende omstandigheden vast en blijft belangrijke gegevens voor onderzoekers onderzoeken de rol van neuroinflammatie bij neurologische aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |
References
- Herculano-Houzel, S. The remarkable, yet not extraordinary, human brain as a scaled-up primate brain and its associated cost. PNAS. 26 (109), 10661-10668 (2012).
- Evans, G. J., &Pocock, J. M. Modulation of neurotransmitter release by dihydropyridine-sensitive calcium channels involves tyrosine phosphorylation. Eur J Neuro. 11 (1), 279-292 (1999).
- Kingham, P. J., Cuzner, M. L., Pocock, J. M. Apoptotic pathways mobilized in microglia and neurones as a consequence of chromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem. 73 (2), 538-547 (1999).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Facci, L., Skaper, S. D. Culture of rat cerebellar granule neurons and application to identify neuroprotective agents. Methods Mol Biol. 846, 23-37 (2012).
- Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester. J Immunology. 131 (5), 2282-2290 (1983).
- Giulian, D., Vaca, K., Corpuz, M. Brain glia release factors with opposing actions upon neuronal survival. J Neurosci. 13 (1), 29-37 (1993).
- Guillemin, G., et al. Obtention and characterization of primary astrocyte and microglial cultures from adult monkey brains. J Neurosci Res. 49 (5), 576-591 (1997).
- Hewett, J. A., Hewett SJ,, Winkler, S., Pfeiffer SE, Inducible nitric oxide synthase expression in cultures enriched for mature oligodendrocytes is due to microglia. J Neurosci Res. 56 (2), 189-198 (1999).
- Jebelli, J., Hooper, C., &Pocock, J. M. Microglial p53 activation is detrimental to neuronal sysnapses during activaton-induced inflammation: implications for neurodegeneration. Neurosci Lett. 7 (583), 92-97 (2014).
- Frade, J., et al. Glutamate induces release of glutathione from cultured rats astrocytes – a possible neuroprotective mechanism. J Neurochem. 105 (4), 1144-1152 (2008).
- Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).
- Morgan, S. C., Taylor, D. L., Pocock, J. M. Microglia release activators of neuronal proliferation mediated by activation of mitogen-activated protein kinase, phosphatidylinositol-3-kinase/Akt and delta-Notch signalling cascades. J Neurochem. 90 (1), 89-101 (2004).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56 (11), 1187-1198 (2008).
- Kumamaru, H., et al. Liposomal clodronate selectively eliminates microglia from primary astrocyte cultures. J Neuroinflamm. 9, 116 (2012).
