Introduction
Il cervello umano è composto una stima di 85 miliardi di neuroni e un ulteriore 85 miliardi di cellule non neuronali tra cui glia 1. Per la maggior parte degli ultimi 100 anni i neuroscienziati si sono concentrati prevalentemente sulla popolazione delle cellule neuronali, cellule gliali credendo di essere poco più di cellule di supporto passivi che hanno fornito supporto strutturale per i neuroni - da qui l'etimologia greca del 'glia' tradotto in inglese come 'colla'. Recentemente, tuttavia, è diventato sempre più evidente che le interazioni neuronali gliali possono essere molto più fondamentale per aspetti fondamentali della neurobiologia, neurofisiologia, e la genesi e progressione di molte malattie neurodegenerative. Cellule cerebellari granulari (CGC), il più abbondante popolazione neuronale omogenea nel cervello umano, dominano il cervelletto e costituiscono oltre il 90% dei suoi componenti cellulari. Di conseguenza, queste cellule sono stati ampiamente utilizzati in vitro come sistema modello per tegli studio dello sviluppo neuronale, funzione e patologia 2-6.
Tuttavia, le culture CGC contengono ancora microglia e glia altri in proporzioni probabilmente significativi. Di conseguenza, i dati che mostrano CGC putatively risposte neuronali scalo a trattamenti con le cellule differenti possono infatti insorgere - in tutto o in parte - dalla risposta secondario indiretta della vicina glia nella cultura. Per valutare questo, abbiamo selettivamente eliminato microglia da colture neuronali CGC con l'ausilio di estere metilico L-leucina (LME). LME è un agente lysomotropic originariamente utilizzato per distruggere selettivamente macrofagi 7, e da allora è stato usato per esaurire anche selettivamente microglia da neurale, astrociti, e le culture gliali miste 8,9,10. LME è interiorizzato da macrofagi e microglia, in cui esso provoca un'interruzione lisosomiale e la successiva apoptosi 13,14. Macrofagi e microglia sono caratteristicamente ricchi di lisosomi, causando loro di essere particularly vulnerabile in seguito all'esposizione al trattamento LME. Questo protocollo fornisce un modo potente, ma semplice e facile stabilire il contributo della microglia in esperimenti utilizzando altri sistemi di coltura gliali / neuronali CGC e.
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Protocol
Tutti gli esperimenti qui descritti sono stati eseguiti in conformità alle Regno Unito Animali (Procedure Scientifiche) Act del 1986.
1. Preparazione degli strumenti, terreni di coltura, e piatti
- Preparare due forbici laboratorio in acciaio inox di dissezione e due pinze da laboratorio in acciaio inox. Autoclavare tutti gli strumenti e posto in una cappa di coltura O / N sotto luce (UV) ultravioletta per la sterilizzazione.
- Fate 500 ml di mezzi essenziali (MEM) terreno minimo cultura (10% fetale Bovine Serum [FBS], 20 mM KCl, 25 NaHCO mm 3, 30 mm D-glucosio, 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 6 mg / ml di ampicillina) e filtro sterilizzare. Conservare a 4 ° C per mesi.
- Preparare 24 piastre di coltura e contenenti 14 mm, numero 1 coprioggetto spessore. Autoclave i coprioggetti e cappotto a 100 mg / L poli-d-lisina (PDL) come descritto in precedenza 3. Luce UV sterilizzare O / N.
2. Preparazione di CGC Cultura Solutions
- Preparare 'soluzione A' (100 ml) in autoclave, luce UV trattato, dH 2 O sterile contiene 250 mg di glucosio, 300 mg di albumina sierica bovina [ASC], 955 mg di tampone fosfato [PBS] (Ca 2+ e Mg + free), e 1 ml di 3,8% MgSO 4 · 7H 2 O.
- Preparare 'soluzione B' (10 ml) contenente 1 ml di 5 mg / ml di tripsina diluito in 9 ml di soluzione A.
- Preparare 'soluzione C' (10 ml) contenente 1.000 unità DNasi, 0,5 mg di inibitore della tripsina di soia, 100 ml di 3,8% MgSO4 · 7H 2 O, diluita a 10 ml con soluzione A.
- Preparare 'soluzione D' (20 ml) contenente 3,2 ml di soluzione C, diluita a 20 ml con soluzione A.
- Preparare la soluzione BSA / Earle soluzione salina bilanciata (EBSS) contenente EBSS, 25 NaHCO mm 3, 3 MgSO mm 4 · 7H 2 O, e4% BSA, pH 7,4, come precedentemente descritto 3.
- Preparare LME aggiungendo puro LME in 5 ml di terreno di coltura MEM per dare una concentrazione finale di 150 mM LME, riportare la soluzione a pH 7,4 utilizzando un pHmetro da banco, e filtro sterilizzare utilizzando un polietere solfone 28 mm (PES) 0,2 micron siringa filtro.
3. La coltura le CGC
- Raccogliere cerebella 4-7 giorni vecchi cuccioli di ratto come descritto in precedenza 3. Mettere subito in piastra Petri contenente 5 ml di soluzione A su ghiaccio.
- Eliminare la soluzione in eccesso da cerebella e luogo del tessuto nel coperchio piastra di Petri.
- Tagliare il tessuto finemente con una lama di rasoio ben fiammato-in almeno tre diverse direzioni.
- Aggiungi il tessuto tagliato a soluzione B (lavare capsula di Petri con una soluzione per garantire il tessuto limitata è perso), e posto in bagno d'acqua a 37 ° C per 5 minuti. Agitare delicatamente ogni paio di minuti.
- Aggiungere la soluzione D (20 ml) al tubo di neutralizzare la tripsina, scossa e centrifuge a 65 xg per 5 min.
- Eliminare il surnatante.
- Risospendere in 4 ml di soluzione C. Triturare anche (circa 10 volte ciascuna) con tre pipette di vetro fiammati di diametro decrescente, fino a quando la sospensione è più possibile uniforme.
- Lentamente e delicatamente aggiungere qualche goccia di questo omogenato in cima alla BSA / EBSS. Se inizia ad affondare attraverso la BSA / EBSS, triturare più e / o aggiungere un po 'di soluzione più C. L'omogeneizzato dovrebbe sedersi in uno strato sopra l'BSA / EBSS. Non agitare. Spin a 100 g per 5 min.
- Rimuovere il surnatante e risospendere pellet (soft) in 1 ml di MEM.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e piastra a 800.000 cellule / vetrino in 500 ml di MEM. Inserire in termostato a 37 ° C con il 6% di CO 2.
- Cambiare il medio il giorno seguente (24-36 ore dopo la preparazione). Fare una soluzione di MEM contenente 10 mM del ciclo cellulare inibitore arabinofuranosil citidina (AraC).
- Per ciascunovetrino, conservano 250 microlitri del vecchio medium in 24 pozzetti fresco, aspirare il resto, aggiungere 250 ml di normale media MEM e aspirare questo per lavare le cellule, poi aggiungete 250 ml di vecchio schienale medio alle cellule e rabboccare con 250 ml di medio-AraC contenenti.
Nota: Le celle possono essere utilizzati da 6 giorni in vitro (DIV).
- Per ciascunovetrino, conservano 250 microlitri del vecchio medium in 24 pozzetti fresco, aspirare il resto, aggiungere 250 ml di normale media MEM e aspirare questo per lavare le cellule, poi aggiungete 250 ml di vecchio schienale medio alle cellule e rabboccare con 250 ml di medio-AraC contenenti.
4. selettivamente L'esaurimento della microglia (eseguiti a 6 DIV)
- Aggiungere LME puro a 5 ml di un'aliquota separata di MEM per dare una concentrazione finale di 150 mM LME.
- Riportare la soluzione a pH 7,4 e filtro sterilizzare con un solfone polietere 28 mm (PSE) filtro da 0,2 micron siringa.
- Diluire soluzione ad una concentrazione di 50 mM (2 x LME) in terreno MEM e posto in un bagno d'acqua a 37 ° C per 10 min con mezzo normale MEM per colture di controllo.
- Rimuovere la metà (250 ml) il terreno MEM dalle culture CGC e mantenere a 37 ° C.
- Cellule Treatcon MEM terreno contenente 2 x LME (250 microlitri), cioè diluito 1: 1 dando una concentrazione di ben 25 mM, o con pre-riscaldato mezzo MEM senza LME (250 microlitri) per colture di controllo.
- Incubare le cellule a 37 ° C in atmosfera umidificata con il 6% di CO 2 per 1 ora.
- Lavare le cellule due volte a fresco preriscaldato medio MEM per rimuovere LME contenenti supporti, e quindi sostituire il terreno di coltura conservato e un uguale volume di fresco pre-riscaldato medio MEM per rispettivi pozzetti.
- Culture Ritorna alla incubatrice (inumidito con 6% di CO 2 a 37 ° C) e lasciare riposare per 24 ore prima di ogni ulteriore trattamento.
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Representative Results
La capacità di questa tecnica per eliminare selettivamente microglia da CGC e / o colture miste si basa sulla successiva capacità del ricercatore di identificare accuratamente e differenziare microglia dalle celle circostanti. Ciò può essere ottenuto usando una macchina per cella specifica-microglia, come isolectin-B4, come illustrato in figura 1. Come mostrato nella Figura 2, nessun cambiamento osservabile astrociti e la densità neuronale e morfologia sono stati registrati con riferimento a ciascun gruppo di trattamento principale. È importante sottolineare che nessun cambiamento significativo nella morfologia dei neuroni o astrociti sono stati osservati quando le culture sono stati trattati con LME da solo, sostenendo un'azione specifica-microglia del composto. La figura 3A mostra cambiamenti osservabili nella densità astrociti e morfologia da roditore primario astrociti cultura 12, ma fa visualizzare una perdita di microglia contaminanti. Nella Figura 3B, come in A, nessun cambiamento in astrocyDensità te e la morfologia sono stati visti; Tuttavia, è stata osservata una perdita di contaminare il numero della microglia e reattività. Per una breve descrizione del protocollo (ICC) immunoistochimica usato in questo manoscritto, vedere riferimento 11.
Figura 1: Caratterizzazione di trattamento LME del CGC. (A) Immagini rappresentative da immunoistochimica (ICC) esperimenti condotti su colture CGC dopo il trattamento con 25-75 LME mM per 1 ora, seguito da dilavamento. ICC è stata eseguita con DAPI (blu) per la quantificazione del numero di cellule totale e quelle che mostrano la morfologia apoptotica, e isolectin-B4 (IB 4) (verde) per l'identificazione e la quantificazione della microglia. Barra di scala = 30 micron. (B) Quantificazione delle cellule che mostrano morfologia apoptotica, definita come la condensazione della cromatina nucleare (barre grigie;% dinumero totale di cellule in campo) e il numero totale microglia, in percentuale dei livelli di controllo (barre verdi). T -test di Student spaiato sono state eseguite tra i controlli attinenti nonché di un trattamento specifico di LME; * P <0.05, ** p <0.01, *** p <0,001; n = 3. (cioè 3 ripetizioni indipendenti).
Figura 2: Caratterizzazione degli effetti del trattamento LME 25 mM sui neuroni e astrociti in culture CGC. Pannello di immagini rappresentative da esperimenti condotti su colture ICC CGC dopo il trattamento con il 25 LME mM per 1 ora. ICC è stata eseguita con DAPI (blu), anti-β-III-tubulina (verde) per l'identificazione delle variazioni di densità neuronale e anti-GFAP (rosso) per l'identificazione delle variazioni di densità astrociti e morfologia. Controllo negativo (CTR) -ve immagini rappresentano culture CGC cui il antibodie primarias sono stati omessi. Barra di scala = 30 micron.
Figura 3: Ulteriore caratterizzazione dell'efficacia di trattamento 25 LME mM nella rimozione della microglia da culture astrociti. (A) Pannello di immagini rappresentative da esperimenti condotti su colture ICC astrociti primarie dopo il pre-trattamento con 25 LME mM per 1 ora. ICC è stata eseguita con DAPI (blu), anti-GFAP (rosso) per l'identificazione delle variazioni di densità astrociti e morfologia, e anti-ED1 (verde) per l'identificazione del numero microglia. (B) Immagini rappresentative da esperimenti condotti su colture ICC astrociti primarie dopo il trattamento con LPS (1 mg / ml) per 24 ore di seguito il pre-trattamento con LME mm 25 per 1 ora. ICC è stata eseguita come descritto in A ma con anti-GFAP (verde) e anti-iNOS (rosso) per identificare microg attivatolia. Controllo negativo immagini (CTR -ve) rappresentano culture CGC in cui sono stati omessi gli anticorpi primari. Barra di scala = 30 micron.
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Discussion
I passi più importanti per assicurare l'eliminazione selettiva di successo di microglia da CGC e / o colture miste sono: 1) il mantenimento di una cultura CGC sterile e sano; 2) filtro sterilizzante medio LME contenente e ritornando la soluzione a pH 7,4; 3) mantenere i media CGC conservati e LME contenenti supporti a 37 ° C per evitare lo shock termico; e 4) che lavorano rapidamente per ridurre il tempo di cellule sono tenuti all'esterno dell'incubatrice.
Abbiamo usato 25 LME mM per esaurire microglia dalle nostre culture CGC - una concentrazione precedentemente ottimizzato nel nostro laboratorio. Ciò nonostante, alcuni microglia rimangono ancora nella cultura dopo il trattamento LME, che secondo alcuni potrebbe riflettere una popolazione di differenziata, microglia non proliferanti. Infatti, Hamby et al. (2006) hanno trovato che il 50-75 LME mM è stato richiesto di eliminare microglia da alta densità monostrati astrociti 13. Abbiamo anche dimostrato in precedenza che in puro c microglialiultures, LME 10 mM era sufficiente per uccidere tutte le microglia, ma solo con una 24 ore di tempo di incubazione 14.
Metodi alternativi per liberare i modelli di coltura cellulare di contaminare microgliali sono recentemente venuti alla luce. Crocker et al. (2008) ha dimostrato un nuovo approccio per eliminare microglia da colture di astrociti attraverso la promozione di cellule staminali neurali (NSC) differenziazione in astrociti in postnatale (P0-P2) topo 15. Essi hanno scoperto che questa tecnica eliminato completamente microglia dalle culture, anche se i meccanismi alla base del fenomeno sono sconosciuti. . Inoltre, Kumamaru et al (2012) hanno usato liposomale clodronato - un biophosphonate noti per indurre apoptosi nei macrofagi - per eliminare le microglia in colture primarie di astrociti da P3 topi 16. Questo composto funziona in modo simile e allo stesso livello di efficacia come LME; anche se gli autori sostengono che come LME può essere tossico per gli astrociti, a determinate condizionigrazie alla sua libera diffusione in cellule - che perturbano astrociti capacità di adesione 13 - clodronato liposomiale rappresenta un metodo migliore per esaurire microglia dalla cultura. Noi, invece, abbiamo trovato che il 25 LME mM non ha alcun effetto sulla vitalità astrociti o proliferazione.
Il protocollo qui descritto utilizza una specifica concentrazione di LME per eliminare selettivamente microglia da colture di neuroni arricchito di CGC. Ciò rappresenta un approccio sperimentale potente per determinare l'influenza della microglia sui neuroni in varie condizioni, e continua a fornire dati importanti per ricercatori che studiano il ruolo di neuroinflammation in disturbi neurologici.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | The curved end facilitates removal of the cerebellum |
| Micro-dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection |
| L-leucine methyl ester hydrochloride | Sigma-Aldrich | 7517-19-3 | |
| EBSS solution | Sigma-Aldrich | E7510-500 ml | |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | 27964-99-4 | Coat coverslips 1 day before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| Mouse anti-ED1 antibody | Abcam | ab31630 |
References
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